當前位置:首頁 > 醫源資料庫 > 在線期刊 > 中華醫學研究雜志 > 2007年第7卷第11期 > 利用IFNγ - ELISPOT評價肝癌復合表位抗原的細胞免疫反應

利用IFNγ - ELISPOT評價肝癌復合表位抗原的細胞免疫反應

來源:《中華醫學研究雜志》 作者:何競 2008-7-4

摘要: 【摘要】 目的 構建肝癌多表位基因和含Tat PTD的多表位基因的原核表達載體,表達純化融合蛋白,比較其細胞免疫反應。分別克隆入原核表達載體pBVIL1,構建含Tat PTD及不含Tat PTD的肝癌多表位基因原核表達載體pBVIL1/Tat+T、pBVIL1/T。IFNγ- ELISPOT法檢測免疫小鼠的細胞免疫應答。ELISPOT檢測顯示Tat+T蛋白免疫組......


【摘要】  目的 構建肝癌多表位基因和含Tat PTD的多表位基因的原核表達載體,表達純化融合蛋白,比較其細胞免疫反應。方法 人工合成多表位和Tat基因;分別克隆入原核表達載體pBVIL1,構建含Tat PTD及不含Tat PTD的肝癌多表位基因原核表達載體pBVIL1/Tat+T、pBVIL1/T;誘導表達、純化目的蛋白;IFNγ- ELISPOT法檢測免疫小鼠的細胞免疫應答。結果 正確構建復合表位基因的原核表達質粒,目的蛋白質在大腸桿菌中獲到高效表達,并得到有效純化;ELISPOT檢測顯示Tat+T蛋白免疫組能更有效地激發特異性T細胞免疫反應。結論 所構建的含Tat PTD的新型復合表位抗原能激活特異性CTL反應,為基于CTL表位的肝癌免疫治療提供了實驗依據。

【關鍵詞】  肝細胞癌 T細胞表位 ELISPOT Tat PTD

    Detecting the cell immune response of recombinant multiple epitopes antigen of hepatocellular carcinoma by IFNγ - ELISPOT

    HE Jing, ZHANG He-qiu, WANG Guo-hua, et al.Institute of Basic Medical Sciences, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China

    【Abstract】  Objective  To construct the prokaryotic recombinant plasmid to express HCC multiple epitopes gene, then purify the fused protein for ELISPOT analysis.Methods  The gene of multi-epitope were gained and it was cloned into prokaryotic expression vector and expressed in E.coli. An recombinant eukaryotic expression vector was constructed and its eukaryotic expression was determined in transfected cells. Balb/c mice were immunized with different forms of antigen. The cell immune response was tested by ELISPOT.Results  The recombinant prokaryotic plasmid was correctly constructed. The gene was expressed in E. coli. highly and the expressed protein was purified efficiently. The antigen specific T cell response IFN-γ release  was much stronger in protein Tat+T group than in the other groups.Conclusion  This preliminary result showed that immunization with those improved recombinant polyepitope antigen has high antigenicity, especially in induction of high CTL response. This research may be useful to further development of immunotherapy for HCC.

    【Key words】  hepatocellular carcinoma;T-cell epitopes;ELISPOT;TatPTD

    肝細胞癌(HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一,我國肝癌患者約占全世界的50%,在我國加強肝癌的防治研究意義重大。隨著分子免疫學、腫瘤免疫治療學的迅猛發展,使免疫治療可能成為治療肝癌的有效手段[1~3]。主動特異性免疫治療即腫瘤疫苗因其特異性高、針對性強又成為免疫治療的方向與主流。尋找腫瘤特異性/相關性抗原,增強其免疫原性,提高腫瘤免疫治療的效果已經成為腫瘤疫苗研究的核心問題。因此,本研究擬采用肝癌中高表達的AFP、MAGE-1分子作為模式腫瘤抗原,從抗原遞呈方式角度提高肝癌復合表位的免疫原性,為基于CTL表位肽的肝癌免疫治療打下基礎。

    1  材料與方法

    1.1  材料  DNA限制性內切酶(EcoRⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ和XbaⅠ);PCR產物純化試劑盒和質粒提取試劑盒購自博大生物公司;原核表達載體pET22b為Novagen公司產品,原核表達載體pBVIL1由本室構建并保存[4];Ni-NTA superflow 購自 QIAGEN公司;ELISPOT檢測采用法國DIACLONE公司的Murine IFNγ ELISPOT 試劑盒;多肽由上海博亞生物公司合成與純化,純度達90%以上;弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自Sigma公司。

    1.2  肝癌復合表位基因的克隆  選取肝癌高表達的AFP和MAGE-1作為模式腫瘤抗原[5~8],選中6個CTL表位作為研究對象,以-NG-為連接臂對各表位加以連接[9]。以HIV Tat蛋白的47~57位氨基酸和通用PAPRE表位作為Tat 序列。

    人工合成Tat(中間含EcoRⅠ、BamHⅠ)和多表位基因。通過原核表達載體pET22b將Tat和多表位基因連接。將含Tat PTD及不含Tat PTD的肝癌多表位基因加入6個his分別克隆于原核表達載體pBVIL1中,構建原核表達載體pBVIL1/Tat+T、pBVIL1/T,并對其進行酶切及DNA序列鑒定。

    1.3  目的蛋白的表達、純化  挑取單個克隆于37℃振蕩培養過夜,次日按1%接種量接種于LB(Amp+)培養基中,37℃活化至A值達0.4~0.6時,42℃水浴搖床繼續培養5h,收集菌體,取1ml誘導后的菌體沉淀15%SDS-PAGE電泳,經考馬斯亮藍染色,選取表達量最高的作為蛋白純化的工程菌。

    制備包涵體,選用Ni-superflow進行重組蛋白的純化,具體步驟按說明書進行。收集各部分洗脫峰,SDS-PAGE鑒定。凝膠過濾脫鹽復性重組蛋白。

    1.4  小鼠免疫方案  進行將6周齡Balb/c小鼠分為A~C組,每組6只。A組為Tat+T重組蛋白組;B組為T重組蛋白組;C組為PBS對照組。重組蛋白免疫初次采用與弗氏完全佐劑1:1混合,50μg/只,皮下多點和腹腔注射免疫小鼠;加強免疫使用弗氏不完全佐劑,皮下多點和腹腔注射免疫小鼠。初次免疫后,分別于第3周和6周各加強1次。末次免疫后2周處死小鼠,無菌條件下取出脾臟,分離脾細胞作為效應細胞,用于IFN-γ的ELISPOT檢測抗原的細胞免疫反應。

    1.5  免疫小鼠脾淋巴細胞的分離  斷頸處死小鼠,無菌取出脾臟,在 200目不銹鋼網上研磨脾組織。將脾細胞懸液8ml緩慢沿管壁加入裝有4ml Ficoll淋巴細胞分離液的透明離心管中,1500r/min離心20min,小心吸取白膜層,用10ml預冷的培養基洗2次。計數分離得到的淋巴細胞,最后將細胞重懸于20%胎牛血清的RPMI1640培養基。

    1.6  免疫小鼠IFN-γ的ELISPOT檢測  ELISPOT檢測具體操作按Murine IFNγ ELISPOT 試劑盒產品說明書進行,主要步驟如下:(1)在用100μl/孔70%乙醇清洗ELISPOT板,室溫下放置10min;(2)棄去乙醇,100μl/孔PBS洗板3次;(3)用10ml PBS稀釋100μl捕獲抗體(capture antibody),混勻,加入PVDF板中,100μl/孔,4℃靜置過夜(16h);(4)次日清空孔內液體,100μl/孔PBS洗板1次,加入100μl/孔2%脫脂奶PBS,室溫封閉2h;(5)輕輕晃動ELISPOT板,棄去孔內液體,在紙上輕輕拍干,100μl/孔PBS清洗1次;(6)在每孔中加入合適濃度的細胞懸液和刺激原混合液共100μl,蓋好板蓋,于37℃ 5%CO2孵箱中培養20h;(7)輕輕晃動ELISPOT板,清空孔內液體,在紙上輕輕拍干;(8)加入100μl/孔洗液(含0.1%Tween20的PBS),4℃靜置10min;(9)100μl 0.1%Tween20 PBS清洗ELISPOT板3次,每次靜置1min;(10)用10ml 1% BSA 的PBS稀釋100μl檢測抗體(detection antibody),混勻,每孔加入100μl,37℃ CO2孵箱中孵育1.5h;(11)清空孔內液體,100μl 0.1%Tween20 PBS清洗ELISPOT板3次;(12)用1%BSA PBS稀釋鏈親和素標記的堿性磷酸酶(Streptavidin-Alkaline Phosphatase Conjugate),每孔加入1:5000的稀釋酶液100μl,37℃孵育1h;(13)清空孔內液體,100μl 0.1%Tween20 PBS清洗ELISPOT板3次,拍干ELISPOT板直至沒有殘留液體;(14)在每孔中加入100μl即用型BCIP/NBT底物反應液。室溫避光顯色2~10min,肉眼觀察斑點的形成;待斑點形成后,用蒸餾水終止反應;(15)拍干ELISPOT板,4℃放置過夜,ELISPOT儀讀取結果(ImmunoSpot 3.2 Beta 1軟件),室溫避光保存。

2  結果

    2.1  原核表達載體pBVIL1/T、pBVIL1/Tat+T的構建與鑒定  將Tat、多表位(T)基因克隆于原核表達載體pET22b,構建原核表達載體PET/Tat、PET/T,用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切PET/Tat和T基因,連接轉化大腸桿菌JM109,連接Tat和多表位基因。

    將含Tat PTD及不含Tat PTD的肝癌多表位基因克隆入原核表達載體pBVIL1,原核表達載體的構建過程見圖1。酶切鑒定pBVIL1/Tat+T、pBVIL1/T的陽性克隆,經測序與設計序列完全一致,成功構建的原核表達載體可進行表達純化。

    2.2  目的蛋白的誘導表達與純化  將測序正確的重組表達質粒轉化大腸桿菌HB101,工程菌經IPTG誘導后,經 15% SDS-PAGE電泳pBVIL1/Tat+T、pBVIL1/T分別在分子量22×103和21×103處出現一新增的蛋白條帶,其大小與預計值相符,而空載體pBVIL1對照表達17×103的蛋白條帶。融合蛋白主要以包涵體形式表達(圖2)。

    我們對不同的誘導條件進行了摸索,如誘導時的菌液濃度、誘導培養時間等。最終確定誘導前培養約2.5h至A達0.5,42℃誘導5h為最佳條件,進行重組蛋白的大量誘導表達與純化。采用Ni柱法純化目的蛋白,洗脫峰中的目的蛋白純度較高(圖3)。

    2.3  ELISPOT檢測免疫小鼠IFN-γ  ELISPOT結果示意圖見圖4。檢測結果顯示:A組(重組蛋白Tat+T免疫組)產生的斑點數明顯多于B組(重組蛋白T免疫組)和PBS對照組,差異有顯著性(P<0.05)。含Tat融合肽的重組蛋白Tat+T比不含Tat融合肽的重組蛋白T產生的細胞免疫反應水平高(圖5)。圖1  原核表達載體pBVIL1/Tat+T、pBVIL1/T的構建示意圖

    3  討論

    如何評價腫瘤抗原特異性T細胞反應,是抗腫瘤免疫治療的基礎。從T細胞免疫反應檢測的方法來看,ELISPOT法是近年來逐步建立起來的通過檢測細胞因子來評價T淋巴細胞功能和特異性的新方法,可檢測單細胞水平上的細胞因子產生、分泌情況。這一方法的特異性和敏感性都很高,廣泛應用于CTL表位鑒定,疫苗療效監測[10~14]。自從首次發現TatPTD的轉導活性以來[15~17],這一特性為將目的分子引入細胞提供了一條嶄新的途徑。蛋白疫苗形式雖然安全可靠,但較難引發CTL細胞免疫反應,究其原因與外源蛋白通常進不了細胞而不能進入MHC-類分子介導的抗原呈遞途徑有關,這也極大地限制了利用重組蛋白疫苗來誘發CTL免疫應答的研究。Kim等[18]將卵清蛋白(OVA)與TatPTD融合,加入到APC體外培養細胞后,融合蛋白跨膜導入細胞并進入MHC-Ⅰ類分子介導的抗原呈遞途徑,從而激活了CD8+的T淋巴細胞,而且用TatPTD融合蛋白免疫小鼠后也可激發抗原特異性CTL的免疫應答。此項研究拓展了重組蛋白疫苗的應用范圍,有望在激活體液免疫的同時激活細胞免疫。研究表明TatPTD融合蛋白可改善基于蛋白質的腫瘤免疫治療,為腫瘤亞單位疫苗提供了新的研究策略[17]。本研究中應用TatPTD融合蛋白免疫動物,確實能有效誘導細胞免疫反應,ELISPOT斑點數優于不含TatPTD的蛋白組。以上結果表明,TatPTD融合形式的復合表位在腫瘤免疫治療中有很好的應用前景。

 

【參考文獻】
  1 Tahara K, Mori M, Sadanaga N, et al. Expression of the MAGE gene family in human hepatocellular carcinoma .Cancer,1999,85(6):1234-1240.

2 Chen CH, Huang GT, Lee HS, et al. High frequency of expression of MAGE genes in human hepatocellular carcinoma .Liver,1999,19(2):110-114.

3 Vollmer CM Jr, Eilber FC, Butterfield LH, et al. Alpha-fetoprotein-specific genetic immunotherapy for hepatocellular carcinoma .Cancer Res,1999,59(13):3064-3067.

4 宋曉國,凌世淦,張賀秋,等.高效原核表達載體(pBVIL1)的構建及其在HCV抗原表達中的應用.細胞與分子免疫學雜志,2001,17(3):231-235.

5 Butterfield LH, Koh A, Meng W, et al. Generation of human T-cell responses to an HLA-A2.1-restricted peptide epitope derived from alpha-fetoprotein . Cancer Res, 1999,59(13):3134-3142.

6 Butterfield LH, Meng WS, Koh A, et al. T cell responses to HLA-A*0201-restricted peptides derived from human alpha-fetoprotein .J Immunol,2001,166(8): 5300-5308.

7 Chaux P, Lethe B, Van Snick J, et al. A MAGE-1 peptide recognized on HLA-DR15 by CD4(+) T cells . Eur J Immunol,2001,31(6):1910-1916.

8 Fujie T, Tahara K, Tanaka F, et al.A MAGE-1-encoded HLA-A24-binding synthetic peptide induces specific anti-tumor cytotoxic T lymphocytes . Int J Cancer,1999,80(2):169-172.

9 Livingston BD, Newman M, Crimi C, et al. Optimization of epitope proceeing enhances immungenicity of multiepitope DNA vaccine .Vaccine,2001,19:4652-4660.

10 Griffioen M, Borghi M, Schrier P, et al.Detection and quantification of CD8(+) T cells specific for HLA-A*0201-binding melanoma and viral peptides by the IFN-gamma-ELISPOT assay .Int J Cancer,2001,93(4):549-555.

11 Jger E, Nagata Y, Gnjatic S, et al. Monitoring CD8 T cell responses to NY-ESO21 : Correlation of humoral and cellular immune responses .Proc Natl Acad Sci, 2000,97:4760-4765.

12 Asai T, Storkus WJ, Whiteside TL. Evaluation of the modified ELISPOT assay for gamma interferon production in monitoring of cancer patients receiving antitumor vaccines. Clin Diagn Lab Immunol,2000,7:145-154.

13 Ittet MJ, Zippelius A, Speiser DE, et al. ex vivo IFN-γ Secretion by Circulating CD8 T Lymphocytes:Implications of a novel approach for T cell monitoring in infectious and malignant diseases . J Immunol,2001,166:7634-7640.

14 Arlen P, Tsang KY, Marshall JL, et al . The use of a rapid ELISPOT assay to analyze peptide specific immune responses in carcinoma patients to peptide vs . recombinant poxvirus vaccines . Cancer Immunol Immunother,2000,49(10): 517-529.

15 Green M, Loewenstein PM. Autonomous functional domains of chemically synthesized human immumunodeficiency virus Tat transactivator protein.Cell,1988,55:1179-1188.

16 Frankel AD, PaboCo. Cellular uptake of the Tat protein from human immumunodeficiency virus.Cell,1988,55:1189-1193.

17 Giannouli C, Brulet JM, Gesche F, et al.Fusion of a tumour-associated antigen to HIV-1 Tat improves protein-based immunotherapy of cancer .Anticancer Res,2003,23(4):3523-3531.

18 Kim DT, Mitchell DJ, Brockstedt DG, et al. Introduction of soluble proteins into the MHC class I pathway by conjugation to an HIV-tat peptide.J Immunol,1997,159:1666-1668.

(編輯:李 木)


作者單位:100850 北京,軍事醫學科學院基礎醫學研究所


醫學百科App—醫學基礎知識學習工具


頁:
返回頂部】【打印本文】【放入收藏夾】【收藏到新浪】【發布評論



察看關于《利用IFNγ - ELISPOT評價肝癌復合表位抗原的細胞免疫反應》的討論


關閉

網站地圖 | RSS訂閱 | 圖文 | 版權說明 | 友情鏈接
Copyright © 2008 39kf.com All rights reserved. 醫源世界 版權所有
醫源世界所刊載之內容一般僅用于教育目的。您從醫源世界獲取的信息不得直接用于診斷、治療疾病或應對您的健康問題。如果您懷疑自己有健康問題,請直接咨詢您的保健醫生。醫源世界、作者、編輯都將不負任何責任和義務。
本站內容來源于網絡,轉載僅為傳播信息促進醫藥行業發展,如果我們的行為侵犯了您的權益,請及時與我們聯系我們將在收到通知后妥善處理該部分內容