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DEAE-Sephadex A-50純化免疫球蛋白F(ab’)2的研究

來源:《中華醫學研究雜志》 作者:張金 2008-7-4

摘要: 【摘要】 目的 采用DEAE-Sephadex A-50純化,提高破傷風抗毒素免疫球蛋白F(ab’)2的純度。方法 破傷風免疫血漿用胃蛋白酶消化、硫酸銨鹽析、明礬提純后的免疫球蛋白F(ab’)2 ,經DEAE-Sephadex A-50純化并進行檢測。結果 經上述方法消化2h,95%以上的IgG水解成為F(ab’)2 ,經DEAE-Sephadex A-50純化后破傷風抗毒素免......


【摘要】  目的 采用DEAE-Sephadex A-50純化,提高破傷風抗毒素免疫球蛋白F(ab’)2的純度。方法 破傷風免疫血漿用胃蛋白酶消化、硫酸銨鹽析、明礬提純后的免疫球蛋白F(ab’)2 ,經DEAE-Sephadex A-50純化并進行檢測。結果 經上述方法消化2h,95%以上的IgG水解成為F(ab’)2 ,經DEAE-Sephadex A-50純化后破傷風抗毒素免疫球蛋白F(ab’)2含量可達75%以上,比活性大幅度提高。結論 DEAE-Sephadex A-50純化破傷風抗毒素免疫球蛋白F(ab’)2是一個較為理想的方法。

【關鍵詞】  破傷風抗毒素 F(ab’)2 純化 DEAE-Sephadex A-50

    Study on TAT immunoglobulin F(ab’)2 purified by DEAE-Sephadex A-50

    ZHANG Jin,WEI Guo-hong,ZHANG Lin.Lanzhou Institute of Biological Products,Lanzhou 730046,China

    【Abstract】  Objectives  In order to improve the purity of TAT immunoglobulin F(ab’)2,we purified it by DEAE-Sephadex A-50.Methods  The immunoglobulin F(ab’)2,produced from the tetanus immune plasma which was digested by pepsin,separated by ammonium sulphate,purified by alum,was purified by DEAE-Sephadex A-50 and was carried on all reqired tests.Results  After digestion for  2 hours in mentioned situation,over 95%IgG hydrolysis F(ab’)2,and after purification by DEAE-Sephadex A-50,the content of F(ab’)2 reached over 75%,and the specific activity increased greatly.Conclusion  Purification of TAT immunoglobulin F(ab’)2  by DEAE-Sephadex A-50 is an ideal method. 

    【Key words】  tetanus antitoxin(TAT); F(ab’)2;purification;DEAE-Sephadex A-50

    近年來層析技術已廣泛應用于生物高分子的分離和純化,據報道,國內外一些生物制品廠家采用層析技術進行血漿蛋白分離、疫苗純化[1]。破傷風抗毒素目前采用鹽析法生產的產品存在雜蛋白含量偏高,特別是胃蛋白酶消化后制品中Fc片段無法徹底去除,產品的比活性和F(ab’)2含量偏低,臨床使用時個別會出現副反應;為進一步提高制品的純度,筆者采用了DEAE-Sephadex A-50純化經胃蛋白酶消化、硫酸銨鹽析、明礬提純的破傷風抗毒素,將結果報告如下。

    1  材料與方法

    1.1  材料  DEAE-Sephadex A-50, 購自瑞典Pharmacia公司;胃蛋白酶, 購自德國MERCK公司;破傷風抗毒素制品由本所血清室提供;破傷風抗毒素標準品(批號0053,效價為6.0 IU/ml)購自中國藥品生物制品檢定所;試驗用昆明小鼠清潔級、英國豚鼠清潔級由本所實驗動物室提供。

    1.2  方法

    1.2.1  DEAE-Sephadex A-50預處理  稱取DEAE-Sephadex A-50 100g,懸于10000 ml注射用水中,1h后傾去上層細粒,按每克A-50加0.5N NaOH 15ml的比例,將A-50浸泡于0.5N NaOH中,攪勻,靜置30min,裝入布氏漏斗(墊有2層尼龍絹絲)中抽濾,并反復用注射用水洗至pH顯中性;再以0.5N HCl同上操作過程處理,最后以0.5N NaOH再處理一次;處理完后將A-50浸泡于0.1M,pH7.4 PBS中過夜。

    1.2.2  純化  將已預處理的A-50用布氏漏斗抽干,稱重。按比例加入經胃蛋白酶消化、硫酸銨鹽析、明礬提純的破傷風抗毒素免疫球蛋白F(ab’)2制品中緩慢攪拌,攪拌結束裝入布氏漏斗(墊有2層尼龍絹絲)濾去A-50凝膠。A-50凝膠用不同濃度的NaCl溶液洗滌和洗脫。純化前后制品進行檢測。

    1.2.3  檢測方法  破傷風抗毒素的熱原質、蛋白含量、小鼠中和效力試驗、NaCl含量、F(ab’)2含量、無菌檢查、鑒別試驗等項目均按文獻[2]進行。

    1.2.4  安全試驗

    1.2.4.1  小鼠試驗法   上述方法純化的3批破傷風抗毒素分別接種體重18~22g。每只小鼠腹腔注射供試品0.5ml,觀察7天。觀察期內,小鼠應全部健存,且無異常反應,到期時每只小鼠體重應增加,供試品判為合格。

    1.2.4.2  豚鼠試驗法  每批供試品用2只豚鼠,注射前每只豚鼠稱體重,應250~350g。每只豚鼠腹腔注射供試品5.0ml,觀察7天,觀察期內,豚鼠應全部健存,且無異常反應,到期時每只豚鼠體重應增加,供試品判定為合格[2]。

    1.2.5  統計學分析  采用SPSS 11.5版醫學統計分析軟件進行分析。

    2  結果

    2.1  純化前后熱原質試驗結果比較  按照以上方法分別對三批(050701、050702、050703)破傷風抗毒素制品進行了小量純化試驗。純化前后檢測結果見表1,由表1可見純化后三批熱原質總和平均降低0.06℃,經過DEAE-Sephadex A-50純化后三批制品熱原質均符合要求。表1  純化前后破傷風抗毒素試驗結果比較

    2.2  純化前后蛋白含量、比活性結果比較  純化前后蛋白含量結果比較,純化后比純化前蛋白含量降低分別為10.43%、13.96%、26.92%,三批試驗平均降低17.1%;純化前后蛋白含量兩組檢測數據經統計學方差分析P=0.019, P<0.05, 差異有顯著性。純化后比純化前比活性分別提高11.73%、16.22%、36.82%。純化前后比活性兩組結果采用上述軟件進行方差分析P=0.022, P<0.05, 差異有顯著性。

    DEAE-Sephadex A-50純化破傷風抗毒素免疫球蛋白F(ab’)2是一個較為理想的方法。

    2.3  純化前后F(ab’)2含量結果比較    純化前后F(ab’)2含量結果采用上述軟件進行方差分析P=0.01, P<0.05, 差異有顯著性。

    2.4  安全試驗結果  7天觀察期內,各組小鼠全部健存,動作活潑,表現如常,每只小鼠體重有增加,且無異常反應;7天觀察期內,各組豚鼠全部健存,動作活潑,表現如常,每只豚鼠體重都有增加,且無異常反應,表明純化的破傷風抗毒素安全性好。

    以上試驗結果表明,破傷風抗毒素經DEAE-Sephadex A-50純化后,制品的各項指標均達到藥典三部要求,蛋白含量平均降低17.1%,F(ab’)2含量平均提高22.65%,比活性平均提高21.59%,總效價回收率95.3%,進一步改善了制品的外觀,提高了制品質量。

    2.5  結論  DEAE-Sephadex A-50純化破傷風抗毒素免疫球蛋白F(ab’)2是一個較為理想的方法。

    3  討論

    DEAE-Sephadex A-50 為弱酸性陰離子交換劑,經NaOH將Cl-型轉變為OH-型后,可純化酸性蛋白,胃蛋白酶消化中除F(ab’)2外其余均屬酸性蛋白。當溶液的pH在6.5時,酸性蛋白被DEAE-Sephadex A-50吸附,有效成分F(ab’)2留在溶液中。因此利用這一原理可以提高F(ab’)2含量。

    在選擇A-50吸附用量時,我們考慮的基點是以最小的A-50用量使破傷風抗毒素的回收率和純度均達到較理想的結果,從而盡量降低因A-50吸附而造成的制品損失。所以我們選擇了1:2(凝膠干重﹕蛋白克數)這一比例。

    純化前后的F(ab’)2含量和效價測定分析,F(ab’)2含量提高主要是因去除了雜蛋白所致,總效價回收率由純化工藝引起的損失為4.7%。

    針對片段抗體極易發生降解或聚合,加之酶切產物成分復雜,給純化工作帶來許多困難,對建立的工藝在保證達到指定純度的前提下,應盡可能地做到操作步驟少,工藝流程短,以最大限度地保持其生物活性,減少片段在酶切及純化過程中降解或聚合的可能性[3]。

【參考文獻】
  1 劉雋湘. 輸血療法與血液制劑.北京:人民衛生出版社,1996,196-208.

2 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典三部.北京:化學工業出版社, 2005,139-140.

3 余曉玲, 米力, 陳志南,等. 片段抗體純化工藝的優化.生物技術通訊,2000,11(2): 123-124.


作者單位:730046 甘肅蘭州,蘭州生物制品研究所


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