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β淀粉肽1-40在阿爾茨海默病病人腦內表達的變化

來源:《中華醫學研究雜志》 作者:鄒春杰 2008-7-4

摘要: 【摘要】 目的 采用穹隆-海馬傘切斷及去勢的大鼠模型模擬阿爾茨海默病病人,觀察模型大鼠腦內不同部位β淀粉肽1-40(Aβ1-40)表達的變化,了解A β1-40與阿爾茨海默病(AD)相關的發病機制。常規處死大鼠取腦組織行A β1-40免疫細胞化學染色,觀察海馬CA1區、皮質區、杏仁復合體區、基底前腦Meynet核等部位Aβ1-40陽......


【摘要】  目的 采用穹隆-海馬傘切斷及去勢的大鼠模型模擬阿爾茨海默病病人,觀察模型大鼠腦內不同部位β淀粉肽1-40(Aβ1-40)表達的變化,了解A β1-40與阿爾茨海默病(AD)相關的發病機制。方法 將大鼠分為穹隆-海馬傘切斷組、去勢組(模型組)和假手術組,假手術組除了不切斷穹隆-海馬傘和去除卵巢外,其余步驟同模型組。常規處死大鼠取腦組織行A β1-40免疫細胞化學染色,觀察海馬CA1區、皮質區、杏仁復合體區、基底前腦Meynet核等部位Aβ1-40陽性細胞表達變化。結果 假手術組大腦各觀察區有少量的Aβ1-40表達,與假手術組比較,模型組大腦海馬CA1區、皮質區、杏仁復合體區、基底前腦Meynet核Aβ1-40陽性細胞數明顯增多(t=3.969~6.677,P<0.01)。結論 穹隆-海馬傘切斷和去勢的大鼠腦內多部位Aβ1-40表達增多,此可能與老年性癡呆病理改變有關。

【關鍵詞】  穹隆 海馬傘 淀粉樣β蛋白 阿爾茨海默病 大鼠 Wistar

    Expressive varieties of β-amyloid peptide 1-40 in brain of AD

    ZOU Chun-jie,BI Hong-ying.Heilongjiang Provincil Second Healthy School,Harbin 150006,China

    【Abstract】  Objective  To observe the expressive varieties of β-amyloid(A β1-40)peptide in different sections of the rat brain with fimbria/fornix transaction  and to study the pathogenic mechanisms related to Alzheimer disease(AD).Methods  Health female Wister rats were randomly divided into the model group and control group with five rats in each group.The fimbria/fornix transection and ovaries cutting were simultaneously performed for the animal model.The rats were executed and the brain taken conventionly.The Aβ1-40 immunocytes were stained by using an immunohistochemical technique.The expressions of the Aβ1-40 positive cells in the hippocampi CA1,cortex,amygdale,Meynert of the basal forebrain were observed.Results  A little A β1-40 was expressed in the observed sections of the brain in the control group,while the A β1-40 positive cells in the model group were significantly increased than those in the control group in the hippocammpiCA1,cortex,and amygdale(t=3.969~6.667,P<0.01).Conclusion  Fimbria/fornix transaction  cutting can cause the increased of Aβ1-40 expression in many sections of the brain, which might be related to the cognitive disturbance due to Alzheimer disease.

    【Key words】  fornix; hippocampus fimbria; β-amyliod protein; Alzheimer disease;rats;Wistar

    β淀粉樣肽是淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)的代謝產物,是老年斑的主要成分,其中以β-淀粉樣肽1-40(Aβ1-40)為主。雌激素與APP的代謝過程密切相關[1]。阿爾茨海默病(AD)是一種以認知障礙為主要特征的進行性神經系統疾病,在美國AD發病年齡一般在65歲以上,80歲以上的患病率為40%,男女均可發病,但女性病人是男性的2~3倍,研究表明,女性AD病人體內的雌激素缺乏與AD發病有關[2]。大鼠卵巢切除(VOX,去勢)是一種較好的雌激素缺乏模型[3],結合穹隆-海馬傘切斷可以造成大鼠體內雌激素缺乏和腦內膽堿能神經遠端支配區的乙酰膽堿(Ach)功能下降,恰似老年婦女AD體內遞質的變化[3,4],應用這種模型觀察大鼠腦內的病理改變,尤其是APP等的代謝狀態,是否產生A β1-40和老年斑等,對于探討AD的病理變化具有重要意義。

    1  材料與方法

    1.1  實驗動物和分組      成年健康雌性Wistar大鼠。由青島市藥物研究實驗中心提供,5個月齡,體重210~250g。常規飼養,環境溫度22℃,隨機分為穹隆-海馬傘切斷加去勢組(模型組)和假手術組,每組大鼠5只。

    1.2  模型制作

    1.2.1  雙側穹隆-海馬傘切斷  經100g/L水合氯醛(300mg/Kg,皮下注射)麻醉后,將大鼠固定于江灣IC型腦立體定位儀,常規消毒、剪毛、正中切開頭皮,暴露出顱骨,參照Paxinos和Waston的大鼠腦立體定圖譜[5],在前鹵后2.2~2.5mm,中線外1.0mm處,用電動開顱器鑿開 顱骨,切開硬腦膜,用自制雙刃刀置上述部位腦表面,接著降刀4.5mm,外移1.0mm,然后再降刀1.0mm,外移1.5mm,最后上下抽動刀約20次,以保證海馬傘外側緣完全切斷。清潔顱面,縫合頭皮,常規飼養[4,6]。

    1.2.2  VOX方法  經10%水合氯醛(35~40mg/kg,ip)麻醉后,先使動物右側臥位,在腰背部脊柱旁和最末肋骨下約1cm剪開皮膚,切口約2~3cm,沿脊柱旁切開肌肉,打開腹腔,將腎臟下方的脂肪拉出后可見有一紅色顆粒樣腺體,此即是埋在脂肪內的卵巢,結扎并切除卵巢,觀察無出血后關閉腹腔;再使動物轉向左側側臥位,以同樣的方法取出右側卵巢[9]。

    1.2.3  假手術組處理  大鼠除了不切斷海馬傘和去除卵巢外,其余處理同模型組。術后觀察大鼠1個月后處死。

    1.4  大鼠腦組織病理觀察  100g/L水合氯醛麻醉大鼠(300mg/kg),暴露心臟,以生理鹽水200ml經升主動脈沖洗,再灌注40g/L多聚甲醛200~300ml固定,持續30min后取腦備用。取材范圍為前囟后2.0~5.0mm和前囟后2.0mm至前囟前0.3mm。腦組織常規脫水、透明、浸蠟包埋,連續冠狀切片(切片厚度5μm),用于免疫組化觀察。

    1.5  免疫組化染色  切片經0.01mol/L PBS溶液漂洗3次,每次10min;浸入Aβ1-40抗體(1:200,博士德公司)孵育,4℃過夜,或37℃孵育1h,0.01mol/L PBS溶液漂洗3次,每次10min,入生物素化兔二抗(博士德公司)孵育2h,0.01mol/L PBS溶液漂洗3次,每次10min,入ABC復合物(博士德公司)孵育2h,0.01mol/L PBS溶液漂洗3次,每次10min,蒸餾水快洗3次。用硫酸鎳銨加強的DAB法核對色,鏡下控制時間,蒸餾水終止反應,干燥、脫水、透明、封片,光鏡觀察。陰性對照用0.01mol/L PBS替代一抗,其余步驟相同。

    1.6  定量分析記數和統計學處理  參考Paxinos和Watson編寫的大鼠腦圖譜[5],Olympus光學顯微鏡下(10×40倍)觀察海馬CA1區、皮質區、杏仁復合體區、基地前腦 Meynet核等部位Aβ1-40陽性細胞的數量,用x±s表示,統計處理采用t檢驗

    2  結果

    假手術組大腦各觀察區有少量的A1-40表達,與假手術組比較,模型組大鼠海馬CA1區、皮質區、杏仁復合體區A1-40陽性細胞的數量均顯著增多(t=3.969~6.677,P<0.01)。見表1。 表1  兩組腦內不同部位A β1-40陽性細胞數量比較

    3  討論

    APP是一種跨膜蛋白,Aβ蛋白是APP斷裂后產生的殘基多肽。神經細胞存在大量的APP,生理條件下,多數APP由α分泌酶裂解成可溶性的APP肽,APP肽再進一步被γ分泌酶裂解產生P3。極少部分的APP在胞質溶酶體經β分泌酶和γ分泌酶裂解為A β1-40。在某些病理條件下如APP基因突變,產生過多的Aβ1-40,導致AD發病。在AD病人的老年斑和類淀粉血管病的血管壁中,均可見到Aβ的沉積[7~9]。

    Aβ1-40對神經細胞可以產生直接的毒性,也可以增強或放大各種傷害刺激,如低糖血癥、興奮毒性、自由基等的細胞損傷效應。多數細胞與Aβ1-40結合以后,會出現細胞腫脹,染色體濃縮,核內DNA斷裂等細胞凋亡的典型特征和生化特征[10]。雌激素影響靶組織的生長、分化和功能發揮。卵巢切除的病人和自然絕經后婦女會出現學習和記憶的減退,情感異常,焦慮等變化,嚴重者出現認知功能障礙,人格改變和近期記憶喪失,發展為AD。

    生理濃度的17β-E2可使人乳癌細胞株ZR751培養基中可溶性淀粉樣蛋白生成增多,而細胞內成熟或未成熟APP并無明顯變化。提示雌激素是通過影響APP的分泌代謝機制而促進了可溶性淀粉樣蛋白的生成。切除卵巢的大鼠APP mRNA表達2h內增加67.9%,大量的APP經β分泌酶降解,使Aβ1-40和Aβ1-41的釋放增多[11]。進一步研究表明,由于基底前大腦皮質及海馬部位雌激素受體與神經生長因子受體位于同一位點,雌激素通過神經生長因子介導激活蛋白激酶C(PKC),PKC又增強α分泌酶的活性,因而激活了可溶性淀粉樣蛋白的生成途徑。Aβ1-40在腦內沉積導致神經元細胞死亡,雌激素可阻斷這種毒性作用[12]。

    Gibbs[13]觀察到神經生長因子受體(TrkA)、膽堿乙酰化轉移酶(ChAT)和雌激素受體(ER)共存。內側隔核和斜角帶核內95%以上TrkA免疫反應陽性神經元內含有ChAT;Meynert核內80%以上TrkA免疫反應陽性神經元內含有ChAT、ER。穹隆-海馬傘切斷損傷了共同的物質基礎。

    本研究結果顯示,模型組大鼠腦內海馬CA1區、皮質區、杏仁復合體區Aβ1-40陽性細胞的數量均顯著增多,說明膽堿能神經的失活和體內雌激素水平的下降,不僅導致了乙酰膽堿的含量減少,而且也導致了APP代謝異常產生過多A1-40,加重了神經的蛻變損傷。

    基底前腦Meynert核發射纖維至杏仁復合體區。邊緣皮質、丘腦、下丘腦、杏仁復合體、基底前腦等組成以Papez內環路為中心將各部分有機地聯系在一起的系統,對情緒、動機、學習及記憶產生重要的作用[14,15]。AD病人臨床出現學習、記憶以及情緒等的變化,可能與此機制有關。膽堿能系統的蛻變和雌激素的下降,是否影響到杏仁復合體系統的神經細胞Aβ1-40的變化,目前尚無報道。本文在穹隆-海馬傘切斷加去勢模型大鼠腦內觀察到,杏仁復合體部位的神經細胞Aβ1-40陽性細胞明顯增多,說明神經細胞的APP代謝受到損傷,這可能是癡呆病人發病以及情緒異常的原因。

 

【參考文獻】
  1 Scott A,Lyness SA,zarow C,et al.Neuron loss in key cholinergic and aminergic nuclei in Alzheimer disease;a meta-analysis.Neurobiology Aging,2003,24:1.

2 Bieber EJ,Cohen DP.Estrogen and hormone replacement therapy; is there a role in the preservation of cognitive function.Int J Fertile Womens Med,2001,46(4):206.

3 Singh M,Meyer EM,Millard WJ,et al.Ovarian steroid deprivation results in a reversible learning impairment and compromised cholinergic function in female SD rats.Brain Res,1994,644:305.

4 Ute K,Bigl V,Eschrich K,et al. De-afferentation of the septo-hippocampal pathway in rats as a model of the metabolic events in Alzheimer,s disease.Int J Devl Neuroscience,2001,19:263.

5 PaxinosG,WatsonC.The rat brain in sterrotaxic coordinated.2nd.Australia:Academic Press Australia,1988,23-38.

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11 Oliveri G,Novakovic M,Savaskan E,et al.The effects of β-estradiol on SHSY5Y neuroblastoms cell during heave induced oxidative stress neurotoxicity and β-amyloid secretion.Neurosceience,2002,113(4):849.

12 Wise PM,Dubal DB,Wilson ME,et al.Estradiol is a protective factor in the adual and aging brain:understanding of mechanisms derived from in vitro studies.Brain Research Reviews,2001,37:313.

13 gibbs rb.levels of trka and bdnf mRNA,but not NGF mRNA,fluctuate across the estrous cycle and increase in response to acute hormone replacement.Brain Res,1998,787:259.

14 朱長庚.神經解剖學.北京:人民衛生出版社,2002,705-725.

15 Dong HW,Petrovich GD,Swanson LW.Topography of projection from amygdala to bed nuclei of the stria terminalis.Brain Res Rev,2001,38:192.


作者單位:150006 黑龍江哈爾濱,黑龍江省第二衛生學校


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