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沙鼠短暫性腦缺血及西比靈干預后腦內Smad2和Smad4表達的研究

來源:《中華醫學研究雜志》 作者:周為軍,胡治平 2008-7-4

摘要: 【摘要】 目的 研究沙鼠短暫性腦缺血及西比靈干預后腦內Smad2和Smad4蛋白的表達。方法 制作沙鼠腦缺血再灌注模型,用免疫組化法檢測腦內Smad2、Smad4蛋白的表達變化。結果 各組沙鼠神經元和膠質細胞胞漿內均有Smad2、Smad4蛋白陽性表達,且Smad4蛋白表達均顯著強于Smad2蛋白。缺血再灌注6h、1天后Smad2、Smad4蛋......


【摘要】  目的 研究沙鼠短暫性腦缺血及西比靈干預后腦內Smad2和Smad4蛋白的表達。方法 制作沙鼠腦缺血再灌注模型,用免疫組化法檢測腦內Smad2、Smad4蛋白的表達變化。結果 各組沙鼠神經元和膠質細胞胞漿內均有Smad2、Smad4蛋白陽性表達,且Smad4蛋白表達均顯著強于Smad2蛋白。缺血再灌注6h、1天后Smad2、Smad4蛋白表達顯著上調(P<0.05)。同腦缺血組相比,西比靈干預組20只沙鼠神經元和神經膠質細胞內Smad2和Smad4蛋白在缺血再灌注6h、1天時表達明顯下調(P<0.05)。結論 沙鼠腦神經細胞和神經膠質細胞內均有Smad2、Smad4蛋白表達;西比靈干預后,缺血再灌注沙鼠腦神經細胞和神經膠質細胞內Smad2和Smad4蛋白表達下調。提示Smad2和Smad4蛋白可能是缺血性腦損傷程度的又一重要標志;Smad4、Smad2在沙鼠腦缺血的發生和發展過程中可能有協同作用。

【關鍵詞】  Smad蛋白;免疫組化;缺血再灌注;沙鼠


    Expression study of cerebral Smad 2 and Smad 4 protein by flunarizine after transient cerbral ischemia reperfusion in gerbil

    ZHOU Wei-jun,HU Zhi-ping.The people’s Hospital,Xiangxiang City,Hunan 411400,China

    【Abstract】  Objective  To study the expressions of Smad2 and Smad4 protein of flunarizine on the expressions of  tissue following cerebral ischemic reperfusion in gerbil.Methods  A cerebral ischemia - reperfusion model in gerbils was established . The expressions of Smad2 and Smad4 protein in brain tissue were detected by using immunohistochemistry technique at the 6th hour, 1st day after ischemic reperfusion (IR).Results  Experimental results revealed that Smad2 and Smad4 protein were expressed in neurons and gliacytes of brain tissue in all gerbils, and expression of Smad4 protein is higher than that of Smad2 protein(P<0.05). Compared with normal control group, the expression of Smad2 and Smad4 protein in neurons and gliacytes of ischemic gerbils was evidently increased at the 6th hour, 1 day (P< 0.05).Compared with cerebral ischemia group, the expression of Smad2 and Smad4 protein in neurons and gliacytes of gerbils in flunarizine treatment group was evidently decreased at the 6th hour,1st day(P<0.05).Conclusion  Smad2 and Smad4 protein were expressed in neurons and gliacytes of brain tissue in gerbils; and the expression of Smad2 and Smad4 protein in neurons and gliacytes of gerbils in flunarizine treatment group were evidently decreased.Smad2 and Smad4 protein might be important factors of mark of brain injury following cerebral ischemic reperfusion.Smad2 and Smad4 protein may take on synergistic actions in normal brain tissue of gerbils and in the occurrence and development of signal transduction of cerebral ischemia gerbil.

    【Key words】  Smad;protein;immunohistochemistry;ischemia-reperfusion;gerbil

    體內外實驗均證明,轉化生長因子β有神經保護作用[1]。腦缺血后,腦組織內TGF-β表達增高,是機體對缺血性腦損傷的一種保護性反應[2]。TGF-β1增高能減少腦梗死面積,抵御腦缺血性損傷。Smad蛋白是輔助TGF-β超家族信號在細胞內傳導的一族蛋白,包括了Smad2、Smad4等[3];直接參與TGF-β超家族成員的信號傳導,是TGF-β超家族成員參與生命活動的重要介質。我們通過免疫組化技術測定沙鼠正常腦組織;缺血再灌注后腦組織及西比靈干預后缺血再灌注后腦組織及Smad2/4轉錄水平的表達,初步發現了Smad2、Smad4之間的關系,現報告如下。

    1  材料與方法

    1.1  實驗材料

    1.1.1  實驗動物  健康雄性蒙古沙鼠60只,9月齡,體重(90±5)g,購自上海實驗動物管理委員會。隨機分為正常組、假手術組、腦缺血組及西比靈干預組。

    1.1.2  主要試劑  Smad2、Smad4免疫組化檢測試劑盒,一抗(鼠IgG),二抗(羊抗鼠IgG),抗原修復液I,山羊血清封閉液、SABC等和DAB顯色試劑盒均由武漢博士德生物工程有限公司提供;西比靈膠囊由西安楊森醫藥公司提供。

    1.1.3  主要儀器  石蠟切片機、免疫組化專用蓋玻片(武漢博士德生物工程有限公司提供)、恒溫箱、冰箱、顯微鏡、照相機等。

    1.2  實驗步驟和方法

    1.2.1  動物模型的建立  健康雄性蒙古沙鼠,用3%戊巴比妥以30mg/kg的劑量腹腔注射進行麻醉,固定動物,消毒,頸正中切開皮膚1.5cm左右,鈍性分離皮下組織,分離雙側頸總動脈,微血管夾夾閉雙側頸總動脈10min后松夾再灌注,縫合皮膚。

    1.2.2  動物的分組和處置  正常組10只,不予任何處理即斷頭處死動物。假手術組10只,僅分離雙側的頸總動脈,不予夾閉,就縫合皮膚,1天后斷頭處死。腦缺血組:共20只沙鼠,分為缺血6h組(IR6h)、缺血1天組(IRld)兩組,每組10只,分別在缺血再灌注(IR)6h、1天時間點處死動物。西比靈干預組共20只沙鼠,分為IR6h,IRld兩組,每組n=10,在缺血再灌注前一天給予喂食西比靈[按20mg/(kg·d)]。分別在缺血再灌注(IR)6h、1天時間點處死動物。所有實驗動物在預定時間斷頭處死,快速取前腦置10%福爾馬林固定,常規石蠟包埋后5μm連續切片。

    1.2.3  SMAD蛋白表達的檢測  免疫組化:按常規SABC法進行,一抗的稀釋度均為1:100。

    1.2.4  結果判定  病理結果采用相鄰腦組織切片作常規HE染色,用光鏡觀察其組織病理變化,估計腦損傷程度。免疫組化取各組沙鼠斷面水平相似的連續組織切片,所有切片分析均在同一強度、同一放大倍數下進行,每個指標采用陽性細胞計數法。在40×10倍的光鏡視野下觀察免疫反應,以細胞漿著棕褐色為陽性,每張切片在高倍視野下分別取上、下、左、右及中心共5個區域進行細胞計數, 每個區計數200個細胞, 共計數1000個細胞, 計算染色細胞所占比例,即為Smad2、Smad4表達指數。

    1.3  統計學分析  各組檢測結果用單因素方差分析方法,2個獨立樣本用t檢驗,兩變量間相關關系用直線相關分析,計算Pearson相關系數;確定P<0.05差異有顯著性;所有統計分析均用SPSS11.0統計軟件包完成。

    2  結果

    2.1  病理觀察結果  正常組和假手術組皮層組織形態結構正常。腦缺血組IR6h可見部分神經元和膠質細胞輕度水腫;IRld后神經元出現變性、灶性壞死、膠質細胞輕度增生。西比靈治療組:IR6h、IRId各組分別同腦缺血組相應時間點相比,腦組織損傷程度均明顯輕于腦缺血組。

    2.2  免疫組化結果  所有正常沙鼠腦組織神經元和神經膠質細胞內均有Smad2和Smad4蛋白不同程度的陽性表達,多呈棕黃色顆粒;顆粒主要定位于胞漿,部分定位于胞核。但表達程度有所不同,Smad4蛋白表達強于Smad2蛋白,統計差異有顯著性(P<0.05)。在缺血再灌注沙鼠腦組織中,神經元和神經膠質細胞內也有不同程度的Smad2和Smad4蛋白的陽性表達,表達部位與正常組基本一致,Smad4蛋白表達也高于Smad2蛋白,統計差異有顯著性(P<0.05)。缺血再灌注組(IR6h、IR1D)與正常組、假手術組比較,Smad2和Smad4蛋白陽性表達率增高,統計差異有顯著性(P<0.05)。西比靈干預組Smad2和Smad4蛋白陽性表達率低于同時間點的腦缺血組,高于同時間點的正常對照組,統計差異均有顯著性(P<0.05)(圖1、2;表1)。表1  各組Smad2和Smad4蛋白表達指數比較 注:與正常對照組比較,▲P<0.05;與同時間點缺血組比較,△P<0.05;與各組Smad4蛋白比較,*P<0.05

    3  討論

    Smad蛋白質群是近年來發現的新的細胞內信號傳導蛋白,它們直接參與TGF-β超家族成員的信號傳導[4]。目前已發現的Smad蛋白至少有10種,在哺乳動物中有8種,Smad1~Smad8。其中,參與調節TGF-β的Smads包括Smad1,2,3和4。Smad2由Eppert等于1996年從人腎cDNA文庫中克隆獲得,其C端含有SSXS結構,SSXS結構能被特異的絲氨酸激酶I型受體磷酸化,進而參與信號傳導。Smad4C端不含SSXS結構,它不能特異地介導信號傳導,但它能與Smad1,2,3,5和8等結合后協同激活各自的特異靶基因,因此也稱為協同Smad;當TGF-β受體活化后,可以誘導限制途徑Smad2和Smad3通過細胞膜特異的絲氨酸/蘇氨酸激酶受體活化而發生磷酸化,再與共有型Smad4結合成寡聚體轉運到細胞核,在細胞核直接地應答TGF-β的轉錄功能,這一結構是TGF-β細胞內信號的開關[5]。

    國內外已有研究Smad2和Smad4蛋白在心肌細胞、肝細胞、牙乳頭細胞和胃癌等細胞和組織中有表達,但沙鼠腦組織中是否存在Smad2和Smad4蛋白表達尚未見文獻報道。本實驗用免疫組化方法檢測到正常沙鼠腦組織神經細胞和神經膠質細胞胞漿和胞核內均有Smad2和Smad4蛋白表達,Smad4蛋白表達強于Smad2蛋白,兩者差異有顯著性。這表明Smad2和Smad4蛋白作為TGF-β在細胞內信號轉導的分子,在于沙鼠神經細胞及神經膠質細胞中是必需的,神經細胞及神經膠質細胞需要Smad2和Smad4蛋白的表達才能發揮正常功能。而Smad4蛋白表達高于Smad2蛋白的可能原因是Smad4蛋白是TGFβ信號通路的共同通路有關。Smad2和Smad4蛋白在缺血再灌注6h,1天時沙鼠神經細胞、神經膠質細胞胞漿和胞核內也均有表達,且較正常沙鼠神經細胞、神經膠質細胞胞漿和胞核內的表達有明顯上調,兩者差異有顯著性。進一步分析發現Smad2和Smad4蛋白在缺血第1天時間點表達比在缺血第6h時間點表達更明顯(P<0.05)。腦缺血再灌注后Smad2和Smad4蛋白表達升高的可能原因我們認為是:腦缺血再灌注后,腦組織發生損害,氧自由基等有害物質表達增加,機體為了抵御這些有害因子,反應性地上調一些保護性因子,這其中就有TGF-β1。Smad2和Smad4蛋白是TGF-β1信號轉導的必需分子,故當TGF-β1表達上調時,可能需要更多Smad2和Smad4蛋白來轉導具有腦保護作用的TGF-β1的信號,而1天時TGF-β1表達較6h更高,Smad2和Smad4表達也相應增多。統計還發現,正常對照組、缺血組沙鼠腦神經細胞和神經膠質細胞內Smad4蛋白和Smad2蛋白表達存在正相關關系,其Pearson相關系數為0.582,這提示Smad4蛋白和Smad2蛋白在正常沙鼠腦組織內及腦缺血的發生和發展過程中可能有協同作用,這與目前大多數研究一致。西比靈是經典的鈣離子拮抗劑,它有明顯的腦保護作用。西比靈可有效的抑制神經細胞膜受體依賴性Ca2+通道開放,具有神經保護作用,并具有減輕皮質抑制,縮短恢復時間,防止腦組織缺血性改變的功能,增加腦組織對缺氧的耐受性。已有研究表明,西比靈發揮腦保護是通過以下機制實現的:西比靈可增加腦組織對缺氧的耐受性,有神經細胞保護作用;抑制病理性血管收縮,阻止血小板聚集,抗自由基作用,拮抗興奮性氨基酸作用;改善腦循環,減輕腦水腫;避免再灌注性損傷[6]。由于Smad是TGF-β信號轉導通路必需的,故闡明正常、缺血沙鼠腦組織內Smad4和Smad2蛋白的表達水平有助于加深對TGF-β胞內信號轉導機制的理解,也有助于深入闡明腦缺血缺氧的發病機制,為其進一步深入分子水平的研究與治療打下基礎。

【參考文獻】
  1 RuoccoA,NicoleO,DocagneF,et al.Increased express ion of TGF-β1in brain tissue after ischemic stroke in humans.Stroke,1996,27(5):852-857.

2 PrehnJH,MillerRJ.Opposite efects of TGF-β1 on r apidly-and slowly triggered excitotoxicin jury.Neuro pharmacology,1996,35 (3):249-256.

3 MassagueJ.TGF-β signal transduction.Annu Rev B iochem,1998,67:753-791.

4 Sekelsky JJ, Newfeld SJ,Reftery LA,et al.Geneticc haracter-rizationandcloning of mothers again std pp, agene required for decapen taplegic functionDrosophils melano gaster.Genestics, 1995,139:1347-1358.

5 Held in CH,MiyazonoK,tenDijkeP.TGF-beta singalling from cellmembraneto nucleusth rough SMAD proteins.Nature,1997,390(6659):465-471.

6 Holmes B,Brogden RN,Heel RC,et al.Fl unarizine.Areview of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties and therapeutic use Drugs,1984,27(1):6-44.


作者單位:411400 湖南湘鄉,湘鄉市人民醫院


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