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我國口岸出入境人員HIV-1基因亞型分析*

來源:《中華醫學研究雜志》 作者:朱紅,劉建禮,董華凰 2008-7-4

摘要: 【摘要】 目的 研究我國口岸檢出的人類免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)感染者的HIV-1 gag區基因序列特征,了解亞型種類,為艾滋病的監控和防制提供科學依據。方法 從HIV陽性的出入境人員血漿中提取病毒核酸,之后采用RT-PCR法擴增gag區基因,對該段序列進行測定分析。結果 2004~2006年確認的39例HIV陽性標本,根據ga......


【摘要】  目的 研究我國口岸檢出的人類免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)感染者的HIV-1 gag區基因序列特征,了解亞型種類,為艾滋病的監控和防制提供科學依據。方法 從HIV陽性的出入境人員血漿中提取病毒核酸,之后采用RT-PCR法擴增gag區基因,對該段序列進行測定分析。結果 2004~2006年確認的39例HIV陽性標本,根據gag區基因序列系統樹分析顯示,共有8種亞型,其中12例C亞型,9例CRF01_AE重組,6例CRF07_BC重組,5例CRF08_BC重組,4例B亞型,1例B’亞型,1例CRF02_AG重組和1例A1亞型。結論 北京口岸檢出的HIV-1亞型種類較為復雜,研究口岸艾滋病病毒的變異特點和傳播來源對于我國艾滋病的防治具有重要作用。

【關鍵詞】  HIV-1;gag基因;亞型分析


    HIV-1 gag gene sequencing and subtype analysis  in China entry-exit port population

    ZHU Hong,LIU Jian-li,DONG Hua-huang.Beijing Quarantine Bureau of National Boundary,Beijing 100013,China

    【Abstract】  Objective  To analyze gag sequence characteristics of HIV-1 infected people found at China port,to learn subtype and to provide scientific reference for AIDS supervision and control in China.Methods  To extract HIV-1 RNA from HIV positive plasma from entry-exit populations,then HIV-1 gag gene were amplified by RT-PCR and sequence was analyzed.Results  Phylogenetic tree analysis showed that there existed 8 kinds of subtype among 39 HIV positive samples confirmed from 2004 to 2007,consisting 12 cases of C,9 cases of CRF01_AE,6 cases of CRF07-BC,5 cases of CRF08_BC,4 cases of B ,1 case of B’,1 case of CRF02_AG and 1 case of A1. Conclusion  The subtypes of HIV-1 tested at China port were complex and research on HIV variation characteristics and spreading source at port will play an important role in AIDS preventation and treatment.

    【Key words】  HIV-1; gag gene; subtype analysis

    艾滋病是由人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)引起的一類死亡率極高的傳染性疾病,對全球、尤其是亞洲和非洲等廣大發展中國家人民的生命健康安全威脅極大[1]。到目前為止,根據不同的地理區域可將HIV-1分為M組、O組和N組,到目前為止,其中占全球HIV-1流行毒株90%以上的M組按其gag基因和env基因的變異程度又可分為9種單一亞型(A~D,F~H,J和K)和19種循環重組型(CRF01至CRF19)(Los Alamos National Laboratory  [http://www.hiv.lanl.gov])。已發現不同亞型在不同地區和不同高危人群中的分布不同[2,3],出入境人員是一個來自世界各地的復雜而具有特殊意義的群體,對于我國HIV的傳入傳出以及今后的流行趨勢具有重要的意義。因此對我國質檢系統檢出的出入境HIV-1感染者進行了病毒基因亞型鑒定和基因序列分析,從而為我國艾滋病的防治策略提供參考依據。

    1  材料與方法

    1.1  研究對象  受檢人員為國外入境人員及中國出入境人員。包括由國家質量監督檢驗檢疫總局以及北京國際旅行衛生保健中心HIV確認實驗室檢出的共39份出入境人員HIV抗體陽性血漿樣品,予-20℃保存。

    1.2  核酸的提取  采用德國Qiagen公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒提取血漿HIV病毒核酸RNA。

    1.3  gag基因的PCR擴增  針對gag基因的引物(見表1)由北京賽百盛基因技術有限公司合成,用無核酸酶的水配成應用濃度。以GAG-L和GAG-E2為外引物,GUX和GDX為內引物,采用TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司的One-step RT-PCR試劑盒對gag基因進行擴增。PCR反應條件為:第一輪外側引物擴增時,50℃30min,94℃5min,55℃1min,72℃2min,1個循環;94℃30s,55℃45s,72℃90s,30個循環;72℃延伸10min;4℃保溫。第二輪內側引物擴增時,94℃2min,55℃1min,72℃90s,1個循環;94℃30s,55℃45s,72℃90s,30個循環;72℃ 10min;4℃保溫。PCR反應體系見表2。表1  gag區擴增引物一覽表表2  HIV-1 gag基因序列擴增反應體系

    1.4  基因測序和序列分析  以GUX和GDX為測序引物,在BioRad公司PCR儀上用Taq酶進行雙向測序反應后,在PEABI公司377型DNA自動測序儀上測定和修正序列。測得的序列用美國ABI公司的Seq ED軟件進行編輯校正,再用CExpress軟件進行拼接,之后利用美國生物技術信息中心(NCBI)的新序列相似性檢索(BLAST)程序將測得序列與國際參考HIV-1分離株序列進行同源性比較,根據最大相似性原則確定HIV-1亞型。以BioEdit軟件對序列進行排列和比較;用Distances程序計算氨基酸序列的同源性;用Mega軟件的Neighbor-joining法繪制系統樹;HIV-1各亞型(A亞型、B亞型、B’亞型、C亞型、CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC和CRF02_AG)國際標準參考序列從美國Los Alamos HIV基因數據庫網站下載。

    2  結果

    2.1  一般流行病學調查結果  本次研究采集的標本來自國外入境人員和本國出入境人員。樣本基本信息見表3。以男性居多,性接觸為主要感染途徑,職業分布有駕駛員、農民、按摩女、導游、商人、干部等。表3  不同性別和職業的HIV-1感染者感染途徑分布

    2.2  基因擴增和亞型分析  血漿RNA提取,gag基因區部分序列擴增,1%瓊脂糖凝膠(含溴乙錠0.15μg/ml)電泳,通過標準分子量DNA比較,紫外燈下觀察出現特異條帶。擴增片斷大小約1000bp,將所測序列提交到美國Los Alamos HIV基因數據庫中進行比對結果,39例樣本共呈現出8種亞型(表4),分別為:12例C亞型,9例CRF01_AE,6例CRF07_BC,5例CRF08_BC,1例CRF02_AG,1例A1亞型,4例B亞型和1例B’亞型。表4  不同國籍來源的HIV-1陽性標本的亞型分布

    2.3  HIV-1 gag基因序列系統樹分析  將39例感染者的HIV-1病毒gag基因區部分序列與各亞型的幾株代表性的國際參考序列排列比對,進一步由系統進化樹結果(見圖1)可見,39例標本中有10例(001,0502,0522,RL010,RL013,RL017,RL021,RL028,RL031和RL034)的基因序列聚集在C.IN.95. 95IN21068周圍;2例(0455與0406)聚集在C.ZA.03ZASK033B2周圍;有9例(RL038,RL035,RL032,RL029,RL027,RL023,0601,0623和420)與01 AE.TH.90聚集;有4例(RL033,RL036,003和0534)與B.FR.83.HXB2LAIIIIB BRU聚集;有6例(RL025,RL020,RL019,RL018,RL014,404)與07BC. CN.97.CN54接近;有5例(006,RL022,RL026,RL030和RL037)與08 BC.CN.97. 97CN GX接近;1例0439接近02 AG.NG. IBNG;1例409接近A1 SE.94.SE7253;另外還有1例004與15_01B.TH.99.99TH_ MU2079距離最近。

    2.4  與各亞型國際參考株的基因距離結果  應用Mega軟件的Distance程序將研究毒株與國際參考毒株進行基因距離比較,結果見表5。表5  39株毒株與國際參考株進行亞型比對的基因距離

    3  討論

    我國分子流行病學調查顯示,目前中國存在著很廣泛的HIV-1亞型種類,主要有A、B、B’、C、D、F和G以及重組型CRF01-AE、CRF07-BC和CRF08-BC,其中B/B’居多,占將近一半,其次為CRF08-BC和CRF01-AE[4~6]。近年來,我國的HIV種類日趨復雜,從國外引入新的毒株是一個重要因素。口岸檢測出的毒株來源范圍廣,猶如一個集中了世界各地毒株的窗口,出入境人群是毒株國際間傳播的重要媒介,因此,在出入境人群中進行HIV檢測具有防止病毒傳入傳出和對國境安全把關的重要作用。我國出入境人群的HIV檢出率呈逐年上升趨勢,僅2006年上半年中國在1.26億人次的出入境人員中查出HIV陽性者290人。本次研究中,以男性中青年和性接觸感染為主。從不同職業人群的角度分析顯示,HIV感染者中,其主要原因是離家遠,時間長,缺乏正常的夫妻性行為,也有一小部分人從事性服務行業,不懂得自我保護,導致HIV的感染。

    我國的HIV分子流行病學數據庫正在逐步完善,但是其中出入境人群的資料和信息仍十分匱乏,分析出入境人員HIV-1毒株的gag基因序列特征能夠從分子水平追蹤病毒的傳播來源和毒株的變異規律,進一步充實我國艾滋病病毒數據庫,為國家制定艾滋病防治規劃提供科學依據。我們對39例出入境人員HIV-1感染者進行了gag基因系統樹分析,結果共存在8種HIV-1亞型,以C和CRF01_AE亞型居多,而且發現了我國較少見的瑞典A1亞型和西非的CRF02_AG亞型。圖1  HIV-1gag區系統進化樹分析    不同的亞型有其相應的主要傳播方式,B/B’主要在經血傳播的感染者中流行,而CRF08-BC和CRF-01AE則分別在吸毒人群和性亂人群中流行[7~11]。本次研究中A/E亞型毒株主要來自泰國,C亞型毒株主要來源于印度,CRF02_ AG亞型毒株來源于西非,CRF07_BC亞型的毒株主要是來自于我國云南邊境和緬甸的人群。應有針對性地加強對這一人群的教育,保護中國出入境人員的身體健康,加大對出入境人員進行關于艾滋病知識的宣傳教育,指出艾滋病對自身的危害性,以及感染上艾滋病后對家庭、事業和社會的影響力度,讓每個出入境人員都了解HIV防治知識,讓他們充分認識到在國外也要有良好的生活習慣。同時要加強對來自東南亞、南亞入境人員艾滋病的監測工作,避免艾滋病在國內的傳播。

 

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作者單位:100013 北京,北京出入境檢驗檢疫局


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