摘要: 【摘要】 目的 研究人類白細胞抗原（human leucocyte antigen,HLA）DR等位基因多態性與浙江籍漢族原發性肝癌遺傳易感性的關系，為尋找原發性肝癌的易感基因或保護基因提供線索。方法 應用聚合酶鏈反應-序列特異性引物技術對101例浙江籍原發性肝癌患者和111例正常健康對照者進行了HLA-DR等位基因檢測，并結合臨床資......
【摘要】 目的 研究人類白細胞抗原（human leucocyte antigen,HLA）DR等位基因多態性與浙江籍漢族原發性肝癌遺傳易感性的關系，為尋找原發性肝癌的易感基因或保護基因提供線索。方法 應用聚合酶鏈反應-序列特異性引物技術對101例浙江籍原發性肝癌患者和111例正常健康對照者進行了HLA-DR等位基因檢測，并結合臨床資料進行比較分析。結果 原發性肝癌組HLA-DR15、DR13等位基因頻率顯著下降，其他等位基因在兩組之間差異無顯著性。結論 HLA-DR15、DR13等位基因可能是浙江籍漢族人群原發性肝癌的抵抗基因。
【關鍵詞】 人類白細胞抗原; 原發性肝癌; 遺傳易感性
The association of HLA-DR allele polymorphism with the genetic susceptibility to primary carcinoma of liver
HAO Bing, GAO Song, MENG Xue-qin.Key Laboratory of Combined Multi-Organ Transplantation, Ministry of Public Health, First Hospital Affiliated to Medical College of Zhejiang University, Hangzhou 310003,China
【Abstract】 Objective To assess the association of human leucocyte antigen (HLA)-DR allele with the genetic susceptibility to primary carcinoma of liver. Methods One hundred and one patients with primary carcinoma of liver in Zhejiang area were investigated for HLA-DR gene by polymerase chain reaction-sequence specific primers technique. The results were compared with those from 111 normal healthy people. Results The frequency of HLA-DR15, DR13 allele in patient group was significantly lower than that in control group. There was no obvious difference in the frequencies of other HLA-DR alleles between two groups. Conclusion HLA-DR15, DR13 allele is a resistance gene in patients with primary carcinoma of liver.
【Key words】 human leucocyte antigen; primary carcinoma of liver; genetic susceptibility
原發性肝癌(PCL)是臨床上常見的嚴重危害人類健康的疾病。臨床資料顯示不同的原發性肝癌個體，臨床表型各不一樣，提示原發性肝癌與機體的免疫功能以及某些遺傳因素有密切關系。HLA（human leucocyte antigen）是位于人6號染色體短臂上一群高度多態性的緊密連鎖的基因群，它所編碼的主要組織相容性抗原，與控制移植排斥反應，介導免疫應答。免疫調節及某些病理狀態的產生密切相關。以往的研究認為HLA基因型的多態性可能與原發性肝癌的遺傳易感性有關［1］。我們利用聚合酶鏈反應/序列特異性引物（polymerase chain reactian/sequence specific primer）技術通過對浙江地區原發性肝癌患者中HLA-DR基因多態性分析,以探討HLA-DR與原發性肝癌遺傳易感性的關系。
1 材料與方法
1.1 研究對象 病例組為我院2005年11月～2007年7月浙江籍漢族原發性肝癌患者101例，男65例，女36例，平均年齡（54±8.7）歲，經B超、CT、肝穿刺活檢或手術確診。所有患者診斷均符合2001年中國抗癌協會肝癌專業委員會修訂的肝癌臨床診斷標準［2］。正常對照組為111名健康獻血員，是無血緣關系的隨機人群，男80例，女31例，平均年齡（38±7.6）歲。無原發性心、肺、腎疾病及高血壓病，肝酶譜正常，病毒標記物陰性。
1.2 標本采集 兩組研究對象每個個體各抽取5ml靜脈血，用ACD抗凝。以2000r/min離心10min，血細胞-20℃保存。
1.3 基因組DNA的抽提 用QIAamp Blood DNA快速提取試劑盒（QIAGEN公司），按試劑盒說明書，從外周靜脈血淋巴細胞提取基因組DNA，溶于200～400μl TE中，-20℃保存備用。用紫外分光光度計測定DNA濃度及純度，A260/A280為1.6～1.8。
1.4 PCR/SSP技術測定 采用Biotest DR，SSPtray試劑盒（廣州永益生物技術有限公司）擴增HLA-DR等位基因DNA片段。PCR反應體系、循環條件、操作方法，按試劑盒操作說明書進行。PCR擴增結束后，用0.5×TBE作電泳液，150V電泳15min,放置紫外燈下觀察、照相、分析、判斷結果。
1.5 統計學方法 等位基因頻率（檢測樣本數×2）用直接計數法計算，病例組與正常對照組間基因頻率差異的統計學意義用r×c表χ2檢驗，如果四格表中有期望值＜5,用Fisher精確概率法計算P值,相對危險度(relative risk,RR)用Haldare修正公式計算。
2 結果
HLA-DR等位基因檢測,原發性肝癌組HLA-DR8、DR11等位基因頻率較正常對照組明顯升高（DR8:14% VS 7.2%,RR=2.28 P=0.017）,(DR11:10% VS 4.5% RR=2.65 P=0.015)。原發性肝癌組HLA-DR15、DR13等位基因頻率顯著低于正常對照組（DR15:7.4% VS 17%,RR=0.34,P=0.001）,(DR13:7.2% VS 15%，RR=0.18 P=0.004)。 HLA-DR其他等位基因在兩組之間差異無顯著性，見表1。表1 原發性肝癌組及正常對照組HLA-DR等位基因頻率（略）注:*P<0.01,＃P<0.05
3 討論
原發性肝癌有家庭集聚現象，提示高發家庭成員體內可能存在導致癌變的內環境。HLA等位基因的多態性是決定機體免疫應答能力重要的遺傳因素，其產物在不同水平參與和介導機體的抗原識別與提呈，決定不同個體對抗原免疫應答的差異，是目前已知人類最為復雜的多態性遺傳系統。
有關HLA-DR與原發性肝癌關系的研究少見報道。我們的研究結果顯示：在原發性肝癌組HLA-DR15、DR13等位基因頻率顯著低于正常對照組,提示HLA-DR15、DR13等位基因可能與原發性肝癌的抵抗有關,可能為原發性肝癌的保護基因。
以往的研究已經證實，乙型肝炎病毒（HBV）及丙型肝炎病毒（HCV）的感染是導致原發性肝癌的重要原因之一［3］。國外研究發現，HLA-DR13在HBV清除中發揮重要作用［4］;而且，HLA-DR13也與抗HCV感染有關［5,6］;程元橋等［7］發現HLA-DR15為乙肝后肝硬化的抵抗基因；提示HLA-DR13、DR15可能是通過病毒清除或者抑制病毒復制來發揮對機體的保護作用。
本研究結果表明特異性遺傳背景可增加或降低人群患原發性肝癌的危險性,反映了原發性肝癌可能的遺傳背景,這一結果將為今后研究原發性肝癌的發病機理和判斷預后提供新的線索,并為原發性肝癌患者行肝移植提供理論依據。
【參考文獻】
1 Ricci G, Colombo C, Ghiazza B,et al.HLA、B、C、DR and DQ expression and hepatoeellular carcinoma:study of 205 Italian subjects.Cancer Lett,1995,98(1):121-125.
2 中國抗癌協會肝癌專業委員會、原發性肝癌的臨床診斷與分期標準.中華肝臟病雜志,2001,9(6):324-325.
3 Kitamura T,Watanabe S,Sato N,et al.Liver regeneration,liver cancers and cyclins.J Gastroenterol Hepatol,1998,13(1):S96-99.
4 Karan MA, Tascioglu NE, Ozturk AO, et al. The role of HLA antigens in chronic hepatitis B virus infection.J Pak Med Assoc,2002,52(7): 253-256.
5 Martinetti M, Pacati I, Cuccia M, et al. Hierarchy of baby-linked immunogenetic risk factors in the vertical transmission of hepatitis C virus.Int J Immunopathol Pharmacol,2006,19(5):369-378.
6 Bosi I, Ancora G, Mantovani W,et al.HLA DR13 and HCV vertical infection. Pediatr Res,2002,51(3):746-749.
7 程元橋，林菊生，黃麗紅，等.人類白細胞抗原DRB1等位基因與乙肝后肝硬化遺傳易感的研究.中華醫學遺傳學雜志,2003,20（3）：247-249.
作者單位：310003 浙江杭州，浙江大學醫學院附屬第一醫院浙江省器官移植重點研究實驗室
