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重組人睫狀神經因子(rhCNTF)短期應用對谷氨酸鈉肥胖大鼠血脂的影響

來源:《中華醫學研究雜志》 作者:郭淑芳,韓國柱,李衛平,周 勤 2008-7-4

摘要: 【摘要】 目的 研究短期應用rhCNTF對谷氨酸鈉肥胖大鼠血脂的影響。方法 建立MSG大鼠模型:出生d1的SD大鼠,雌雄兼用,皮下注射谷氨酸鈉(MSG)3mg/(g·d),連續5天,正常對照組皮下注射等容積生理鹽水。3月齡時將肥胖動物隨機分5組:分別皮下注射rhCNTF300μg/(kg·d)(高劑量組)、100μg/(kg·d)(中劑量......


【摘要】  目的 研究短期應用rhCNTF對谷氨酸鈉肥胖大鼠血脂的影響。方法 建立MSG大鼠模型:出生d1的SD大鼠,雌雄兼用,皮下注射谷氨酸鈉(MSG)3mg/(g·d),連續5天,正常對照組皮下注射等容積生理鹽水。3月齡時將肥胖動物隨機分5組:分別皮下注射rhCNTF300μg/(kg·d)(高劑量組)、100μg/(kg·d)(中劑量組)、30μg/(kg·d)(低劑量組),西布曲明灌胃8mg/(kg·d)(陽性對照組),稀釋液1.0ml/(kg·d)(肥胖對照組);模型組和對照組均給予生理鹽水1ml/(kg·d),連續給藥10天。末次給藥后24h,同時動物禁食過夜后,在水合氯醛麻醉下,測體重、身長,計算LI;斷頭后取腹部脂肪稱重、計算脂肪系數(脂肪重/體重);腹主動脈取血離心后得血清測總膽固醇(膽固醇氧化酶-過氧化物酶法)、甘油三酯(GPO-PAP法)、高密度脂蛋白(沉淀法)、血糖(GOD-PAP法)和血清胰島素(放射免疫測定法)水平;斷頭后取腹部脂肪稱重、計算脂肪系數(脂肪重/體重)。結果 ⑴ 造模:正常大鼠(189.40±38.72)g,谷氨酸鈉肥胖大鼠平均體重(246.72±36.67)g,(P<0.001);LI分別為289.27±9.05和304.42±9.64(P<0.001)。說明造模成功。 ⑵ 藥物實驗結果:高、中劑量給藥組體重、LI、脂肪系數、血總膽固醇、甘油三酯、血糖明顯下降達,到統計學要求的顯著性;胰島素水平也有所下降,但未達到統計學要求的顯著性(P>0.05)。結論 rhCNTF 30~300μg/(kg·d)皮下注射連續用藥10天,對谷氨酸鈉肥胖大鼠具有明顯的減肥降脂作用,可能對2型糖尿病肥胖有效。

【關鍵詞】  重組人睫狀神經因子;谷氨酸鈉肥胖大鼠;降脂作用;降血糖作用


    Antilipemic effect of recombinant human ciliary neurotrophic factor on obesity rats induced by monosodium glutamate

    GUO Shu-fang, HAN Guo-zhu, LI Wei-ping, et al. Department of pharmacology, Dalian Railway Hygiene School, Dalian 116001,China

    【Abstract】  Objective  To investigate the short-term antilipemic effect of recombinant human ciliary neurotrophic factor (rhCNTF) on obesity rats induced by monosodium glutamate (MSG). Methods  Obesity models were established by hypodermic injection of MSG to newborn rats. rhCNTF was used at 30~300μg·kg s.c. once a day for 10 days. The body weight and food intake were monitored everyday.  After final administration, rats were narcotized with choral hydrate, then the body length and weight were measured to calculate Lee’s index. Blood was sampled through abdominal aorta to assay the serum levels of glucose and lipids. Fat around kidney and genitals and in abdominal cavity was collected for calculation of fat index. Results  The body weight and Lee’s index of MSG-rats were significantly higher than those of normal rats, indicating that MSG-Obesity model was established successfully. The short-term administration of high and middle dose of rhCNTF resulted in a significant and dose-dependent reduction of body weight, Lee’s index, fat index, serum triglyceride (TG) and tatal cholesterol (TC), as opposed to profoundly increased high density lipoprotein-cholesterol (HDL-C) in comparison with obese saline-treated control. It also produced a significant hypoglycemic activity. Conclusion  rhCNTF has a significant and dose-dependent antilipemic effect in MSG-rats. This agent is rapid in onset of action. Along with the antilipemic effect, rhCNTF also produces a significant hypoglycemic activity.

    【Key words】  Recombinant human ciliary neurotrophic factor (rhCNTF); obesity rats induced by MSG; antilipemic effect; hypoglycemic activity

    睫狀神經營養因子(Ciliary neurotrophic factor,CNTF)最初是從雞的睫狀體中提取出來的,是一種由200個氨基酸組成的分子量23000的蛋白多肽,因可維持雞副交感神經節的存活而得名[1,2]。因在治療肌側索硬化癥(ALS)過程中顯示出明顯的減肥效應而受到醫務工作者的重視。rhCNTF是由美國Regeneron公司開發的第二代基因工程新藥。是全世界第一個進入臨床檢驗的基因工程神經營養因子藥物,在促進運動神經元發育并防止受損運動神經元的退變方面具有獨特的作用。動物實驗已證實該藥對肥胖動物模型、2型糖尿病肥胖動物模型有效[3],具有顯著的降血糖、降血脂作用。

    1  材料與方法

    1.1  材料

    1.1.1  藥物  rhCNTF 粉針劑:由上海萬興生物制藥有限公司提供。規格:2mg/支,純度:98.6%,批號:20031001。鹽酸西布曲明粉劑,購自南京長澳制藥有限公司,批號:030102,純度:99.7%。

    1.1.2  受試動物  SD母仔大鼠,由大連醫科大學動物中心提供。

    1.1.3  飼料

    1.1.3.1  基礎飼料  大麥粉20%,脫水菜10%,豆粉20%,酵母1%,骨粉5%,麩粉16%,玉米粉16%,魚粉10%,食鹽2%(由沈陽市于洪區動物實驗飼料廠生產)。

    1.1.3.2  營養飼料  由本科研組自行配制,每100g基礎飼料中添加奶粉10g,豬油10g,雞蛋1只,新鮮黃豆芽250g,混勻后蒸20min,加濃魚肝油10滴(含維生素A 17000U,維生素D 1700U)拌勻制成餅狀,置于70℃烤箱烘24h即成。

    1.1.4  儀器  電子天平(上海精密科學儀器有限公司,FA/JA型電子天平,精確度0.0000g),LD5-2A離心機(北京醫用離心機廠制造),754分光光度計(上海精密科學儀器有限公司),恒溫水浴箱(北京市醫療設備總廠)。

    1.1.5   試劑  總膽固醇試劑盒購自上海榮盛生物技術有限公司,批號:20040101;高密度脂蛋白試劑盒購自上海榮盛生物技術有限公司,批號:20031101;血糖試劑盒均購自上海榮盛生物技術有限公司361500,甘油三酯試劑盒購自浙江東甌生物工程有限公司,批號:00031;125I-胰島素放射免疫分析藥盒購自中國原子能科學研究院。

    1.2  方法

    1.2.1  谷氨酸鈉大鼠模型的建立  出生d1的SD大鼠,雌雄兼用,皮下注射谷氨酸鈉(MSG)2mg/(kg·d),連續5天,正常對照組皮下注射等容積生理鹽水。斷乳后分籠飼養,模型組給予營養飼料,正常組給予基礎飼料。

    1.2.2  分組與給藥  模型建立后,正常組隨機取10只分為1組,模型大鼠50只隨機分成5組,每組大鼠10只,雌雄各半,分別為:(1) 正常對照組:頸背部皮下注射(SC)稀釋液1.0ml/(kg·d);(2) 肥胖對照組:頸背部皮下注射(SC)稀釋液1.0ml/(kg·d);(3) 高劑量組:頸背部皮下注射(SC)rhCNTF 300μg/(kg·d);(4) 中劑量組:頸背部皮下注射(SC)rhCNTF 100μg/(kg·d);(5) 低劑量組:頸背部皮下注射(SC)rhCNTF 30μg/(kg·d);(6) 陽性對照組:灌胃(ig)鹽酸西布曲明8mg/(kg·d)。

    1.2.3  實驗步驟及測定指標  整個實驗過程中,動物房溫度控制在(21±1)℃,濕度控制在45%~55%之間。造模期間每天早8:30通風換氣,9:00稱取動物的投食量及剩食量及撒食量,計算動物每日進食量。每3天稱各大鼠體重1次。3月齡時將肥胖動物隨機分5組:分別皮下注射rhCNTF300μg/(kg·d)(高劑量組)、100μg/(kg·d)(中劑量組)、30μg/(kg·d)(低劑量組);西布曲明灌胃8mg/(kg·d)(陽性對照組);模型組和對照組均給予生理鹽水1ml/(kg·d)。連續給藥10天。末次給藥后24h,同時動物禁食過夜后,在水合氯醛麻醉下,測體重、身長,計算Lee’s指數;腹主動脈取血,離心(3000r/min×10min)后得血清測總膽固醇(膽固醇氧化酶-過氧化物酶法)、甘油三酯(GPO-PAP法)、高密度脂蛋白(沉淀法)、血糖(GOD-PAP法)和血清胰島素(放射免疫測定法)水平;斷頭后取腹部脂肪(腹膜后、腎周、腹股溝周圍)稱重、計算脂肪系數(脂肪重/體重)。

    整個實驗過程中對動物的自發活動、體征及有無腹瀉等情況進行觀察,并記錄。各測得指標均以SPSS11.0統計軟件分析。

    2  結果

    2.1  谷氨酸鈉肥胖大鼠模型的建立  給藥前正常大鼠(189.40±38.72)g,模型組肥胖大鼠平均體重(246.72±36.67)g,(P<0.001);LI分別為304.42±9.64和289.27±9.05(P<0.001)。說明谷氨酸鈉肥胖大鼠模型建立成功。

    2.2  rhCNTF對谷氨酸鈉肥胖大鼠減肥作用

    2.2.1  短期應用rhCNTF對谷氨酸鈉肥胖大鼠的體重的影響      給藥后短周期給藥組體重:肥胖對照組(260.2±38.3)g,高劑量組為(200.4±26.3)g(P<0.01 vs 肥胖組),中劑量組為(215.4±30.8)g(P<0.05 vs 肥胖組)。連續應用rhCNTF 10天,谷氨酸鈉肥胖大鼠的體重出現了明顯下降的趨勢,作用呈劑量依賴性。如圖1所示。

    2.2.2  短期應用rhCNTF對谷氨酸鈉肥胖大鼠進食量的影響  短期應用rhCNTF后大鼠進食量明顯減少,作用具有明顯的量效關系和時效關系。連續給藥前4~5天進食量呈持續下降狀態;接著四天左右進食量變化不大,以后呈穩定緩慢回升狀態。具體如圖2所示。

    2.2.3  短期應用rhCNTF對谷氨酸鈉肥胖大鼠Lee’s指數和脂肪系數的影響      短期應用rhCNTF 后各組大鼠測得Lee’s指數 :肥胖對照組323.7±9.2、高劑量組298.4±14.5(P<0.01 vs肥胖對照組),中劑量組305.2±8.2(P<0.01 vs肥胖對照組),低劑量組313.5±11.3(P<0.05 vs肥胖對照組);脂肪系數: 肥胖對照組6.05±1.65,高劑量組3.74±1.91(P﹤0.01),中劑量組4.54±1.51(P﹤0.05);肥胖對照組的Lee’s指數和脂肪系數均明顯大于正常對照(P﹤0.01),應用rhCNTF后Lee’s指數和脂肪系數均明顯減小,呈劑量依賴性。如表1所示。表1  短周期應用rhCNTF后體重、李氏指數、脂肪系數圖表(略)注:與正常對照組比較,##P<0.01;與肥胖對照組比較,*P<0.05,**P<0.01

    2.2.4  短期應用rhCNTF對谷氨酸鈉肥胖大鼠血脂的影響  肥胖模型組的膽固醇、甘油三酯明顯高于正常對照組(P<0.01);而高密度脂蛋白則明顯低于正常對照組(P<0.01)。短期應用rhCNTF后模型組的膽固醇、甘油三酯明顯降低,與肥胖對照組比差異有顯著性(P<0.01或P<0.05);而高密度脂蛋白則明顯升高。如表2所示。表2  短期應用rhCNTF對谷氨酸鈉肥胖大鼠血脂的影響 (略)注:與正常對照組比較,##P<0.01;與肥胖對照組比較,*P<0.05,**P<0.01

    2.2.5  短期應用rhCNTF對谷氨酸鈉肥胖大鼠血糖、胰島素的影響  谷氨酸鈉肥胖大鼠胰島素抵抗、胰島素水平、血糖值均明顯高于正常對照組(P<0.01),應用rhCNTF后血糖值下降。高劑量組為11.09±1.28,中劑量組為8.95±1.00,與肥胖對照組比差異有顯著性(P<0.01)。胰島素水平亦出現下降現象,但未能達到統計學上的顯著性(P>0.05)。如表3所示。表3  短期應用rhCNTF對谷氨酸鈉肥胖大鼠血糖、胰島素的影響 (略)注:與正常對照組比較,#P<0.05,##P<0.01;與肥胖對照組比較,**P<0.01

    2.3  其他  在實驗過程中各大鼠大便性狀正常,未觀察到糞便變稀;未見大鼠出現毛色晦暗、腹瀉、行為異常等不良反應

    3  討論

    谷氨酸鈉肥胖大鼠是下丘腦性肥胖,是由于大劑量谷氨酸鈉選擇性地破壞了大鼠下丘腦腹內側核的飽食中樞,致使大鼠進食量增加,而出現腹型肥胖。另外,我們也注意到模型組的動物在整個實驗過程中自發活動顯著減少,這說明交感神經處于抑制狀態,這對于導致大鼠肥胖癥的發生也有幫助[4]。下丘腦肥胖模型伴有的顯著特征為胰島素抵抗,高胰島素血癥[5,6]。肥胖者脂肪細胞的增大能導致胰島素作用受損,但其確切機制不明。近年來國外的研究發現,脂肪細胞不僅是被動的能量儲存器,而且是內分泌系統的活躍組成部分,能分泌多種激素、細胞因子和其他蛋白物質,共同影響機體的能量平衡,如瘦素(leptin)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、纖溶酶原激活物抑制因子-1、補體D(adipsin)、脂肪細胞補體相關蛋白(adiponectin)等。2001年發現的脂肪細胞分泌的胰島素抵抗因子(resistin)被認為是肥胖與胰島素抵抗的重要中間環節[7]。高胰島素血癥的產生主要是由于下丘腦內側核破壞,使迷走神經處于受刺激狀態,刺激胰腺分泌胰島素增加。胰島素是促脂肪生成激素,能促進脂肪前體細胞分化,所以體內胰島素水平升高進一步加重肥胖,造成惡性循環[8]。另外又有報道,破壞腹內側核會使交感神經處于一種抑制狀態,交感神經因子也是高胰島素血癥發病的重要因素之一。下丘腦性肥胖雖然與人類的肥胖癥不盡相同,但研究表明人類的重度肥胖癥類似于動物丘腦下部性肥胖[9,10]。

    rhCNTF是由美國Regeneron公司開發的第二代基因工程新藥,實驗結果顯示:rhCNTF短期用藥(連續用藥10天)后各項檢測指標均支持藥物的減肥降脂作用,表現為體重、Lee’s指數和脂肪系數、膽固醇、甘油三酯、血糖均明顯降低,同時高密度脂蛋白升高,統計學上達到了顯著性(P﹤0.01或P﹤0.05)。胰島素抵抗緩解,血清胰島素水平降低,但未能達到統計學上的顯著性。原因可能與測得值標準差較大有關,我們應用的125I-胰島素放射免疫分析藥盒為用于人類的,如果是大白鼠專用藥盒可能結果會較理想。這一作用提示,rhCNTF可能對2型糖尿病肥胖有效。

【參考文獻】
  1 Barbin G, Manthorpe M, Varon S.Purification of chick eye ciliary neurotrophic factor.J Neurochm, 1984,43:1468-1478.

2 Lin LFH, Mismer D, Lile JD, et al.Purification, cloning, and expression of ciliary neurotrophic factor.Science,1989,246:1023-1025.

3 Isabelle Gloaguen, Patrizia Gosta, Anna Demartis, et al. Ciliary neurotrophic factor corrects obesity and diabetes associated with leptin deficiency and resistance. Proc Natl Acad Sci USA, 1997,94:6456-6461.

4 Terutake NAKAGAWA, Kiyoharu UKAI, Tadashi OHYAMA, et al. Effects of Chronic Administration of Sibutramine on Body Weight, Food Intake and Motor Activity in Neonatally Monosodium Glutamate-Treated Obese Female Rats:Relationship of Antiobesity Effect with Monoamines. Exp Anim,2000,49(4):239-249.

5 Hirata AE, Andrade IS, Vaskevicius P, et al.Monosodium glutamate (MSG)-obese rats develop glucose intolerance and insulin resistance and insulin resistance to peripheral glucose uptake.Braz J Med Biol Res, 1997, 30(5):671-674.

6 丁世英,申竹芳,謝明智.MSG肥胖大鼠胰島素抵抗特征的初步研究.中國藥理學通報.2001,17(2):181-185.

7 Steppan CM, Bailey ST, Bhat S, et al.The hormone resistin links obesity to diabetes .Nature, 2001, 409(6818):307-312.

8 楊建梅,高妍,李長紅,等.游離脂肪酸、胰島素對脂肪前體細胞分化的影響.北京醫科大學學報,1998,30(3):276-278.

9 Bunyan J. The Induction of Obesity in Rodents by Means of Monosodium Glutamate. Br J Nutr, 1976,35:25.

10 錢伯初. 肥胖動物模型的制備原理和方法.中國藥理學通報,1993,9(1):75.


作者單位:116001 遼寧大連,大連鐵路衛生學校藥理教研室


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