摘要: 【摘要】 目的 探討骨髓源性肝干細胞（BMDLSC）移植對肝纖維化病變的影響。方法 16只酒精性肝纖維化雌性小鼠隨機分為移植組和對照組，移植組小鼠（n=8）接受同基因型雄性小鼠的骨髓CD117+Lin-細胞移植，對照組小鼠（n=8）接受等體積的Buffer2液輸注。術后30天活殺小鼠進行肝功能、肝組織HE染色和VG染色、肝組織Y染......
【摘要】 目的 探討骨髓源性肝干細胞（BMDLSC）移植對肝纖維化病變的影響。方法 16只酒精性肝纖維化雌性小鼠隨機分為移植組和對照組，移植組小鼠（n=8）接受同基因型雄性小鼠的骨髓CD117+Lin-細胞移植，對照組小鼠（n=8）接受等體積的Buffer2液輸注。術后30天活殺小鼠進行肝功能、肝組織HE染色和VG染色、肝組織Y染色體和白蛋白雙重原位雜交等檢查。結果 移植組的肝功能和肝結構恢復顯著優于對照組,肝內纖維數量顯著少于對照組，既帶Y染色體又表達白蛋白的雙陽性細胞僅在移植組的肝組織中出現。結論 BMDLSC移植可以顯著改善小鼠酒精性肝纖維化病變的結構與功能。
【關鍵詞】 CD117+Lin-細胞移植；酒精性肝纖維化；小鼠
The action of bone marrow CD117+Lin-cell transplantation on alcoholic liver fibrosis in mice
LIAO Cai-ji, LIAO Cai-xian, ZHANG Shou-hua, et al. Department of Surgery One, Red Cross Hospital of Baiyun District of Guangzhou City, Guangzhou 510545,China
【Abstract】 Objective To explore the action of transplantation of bone marrow-derived liver stem cells（BMDLSC）on hepatic fibrosis induced by alcohol in mice. Methods 16 female mice with alcoholic liver fibrosis were randomly divided into group A and B. The mice in group A(n=8) received syngeneic male bone marrow CD117+Lin- cell transplantation. The mice in group B(n=8) received isovolumetric Buffer 2 solutions infusion. The examinations of hepatic function, hepatic tissue stained by HE and VG, double in situ hybridization of albumin and Y-chromosome were performed at the 30th day postoperatively.Results Double labelling positive cells were seen only in group A. The hepatic function and morphosis restoration in group A were significantly better than those in group B. The number of intrahepatic fibers in group A were markedly less than those in group B. Conclusion BMDLSC transplantation could ameliorate remarkably the hepatic structure and function of the mice with alcoholic liver fibrosis.
【Key words】 CD117+Lin- cell transplantation; alcoholic liver fibrosis; mouse
最近唐浩等［1］學者發現，小鼠骨髓源性肝干細胞（BMDLSC）移植對放射性肝損傷具有良好的修復作用，并且可以有效預防放射性肝纖維化形成。但是，對于已經出現的肝纖維化病變，BMDLSC移植可否使其發生變化？目前尚不清楚，也未見報道。筆者為此對肝纖維化小鼠接受骨髓CD117+Lin-細胞移植后的變化進行了觀察，發現骨髓CD117+Lin-細胞移植可以顯著改善小鼠酒精性肝纖維化病變的結構與功能。
1 材料與方法
1.1 小鼠酒精性肝纖維化模型的建立 SPF級純系BALB/C雌性小鼠，體重15～18g。參照蘇俊等［2］介紹的方法，給予54度白酒灌胃，每天2次，持續16周。第1～3周每次8ml/kg白酒灌胃，第4～7周每次10ml/kg，第8～16周每次12ml/kg。同時將54度白酒用蒸餾水配制成含酒精10% (v/v)白酒作為實驗小鼠的唯一飲料。
1.2 小鼠分組 （1）移植組:為酒精性肝纖維化雌性小鼠接受同系雄性小鼠骨髓CD117+Lin-細胞移植組，8只小鼠。（2）對照組:為酒精性肝纖維化雌性小鼠接受等體積Buffer2液輸注組，8只小鼠。
1.3 小鼠骨髓CD117+Lin-細胞分選 BALB/C雄性小鼠8只，無菌條件下獲取股骨和脛骨骨髓，收集骨髓細胞懸液。經裂解紅細胞、8℃條件下離心、尼龍膜過濾等處理，獲得骨髓細胞懸液。應用免疫磁珠分選法［3］，第一步采用陰性分選，從骨髓細胞懸液中分選出Lin-細胞，即CD3ε、CD4、CD8a、CD45R、Gr21、Ter-119、CD11b陰性細胞。第二步采用陽性分選，從Lin-細胞中分選出CD117+Lin-細胞。最后用Buffer2液（pH7.2 PBS+0.5%BSA +2mmol/L EDTA）重懸細胞，并將細胞濃度調節至1×109/L。
1.4 CD117+Lin-細胞移植 移植組小鼠均經尾靜脈注入CD117+ Lin-細胞懸液250μl(2.5×105個細胞)，對照組小鼠均經尾靜脈注入250μl Buffer2液。
1.5 觀察指標與檢測方法 移植后30天，活殺小鼠進行如下檢測。
1.5.1 肝功能測定 內容包括丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、 天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、白蛋白(ALB)。
1.5.2 肝組織病理學檢查 內容包括HE染色和VG染色檢查。
1.5.3 肝組織白蛋白mRNA和Y染色體Sry DNA雙重原位雜交檢查 探針由天津瀚洋生物有限公司提供。ALB mRNA探針序列為：5’-TTGGCAAGTT CCGCCCTGTC ATCTGCGC (TAMRA紅色熒光標記)，小鼠Y染色體性別決定基因（Sry）DNA探針序列為：5’-GCTGGGATGC AGGTGGAAAA GCCTTACAG（FAM綠色熒光標記）。雜交方法按照試劑盒所附方法進行，在同一張組織切片上先后進行ALB mRNA雜交和Sry DNA雜交。熒光顯微鏡觀察結果。胞漿內含綠色顆粒表示該細胞含Y染色體，胞漿內含紅色顆粒表示該細胞表達白蛋白，胞漿內含黃色顆粒表示該細胞既含Y染色體又表達白蛋白。
1.6 統計學方法 數據以x±s表示，分析比較采用t檢驗。
2 結果
2.1 各組小鼠移植后30天的肝功能結果 見表1。表1 移植組與對照組小鼠在術后30天的肝功能變化 注：*P為移植組與對照組比較結果
2.2 肝組織的病理學改變 對照組小鼠肝組織HE染色顯示，大量肝細胞脂肪變性，胞漿透明。肝小葉點狀壞死，匯管區纖維細胞增生，肝小葉內可見纖維間隔，假小葉形成。肝組織VG染色顯示，肝內纖維重度增生，肝小葉內、匯管區及肝竇內均有較多粉紅色膠原纖維沉積，見圖1。移植組小鼠肝組織HE染色顯示，肝細胞輕度濁腫變性，肝小葉內無壞死灶，偶見少量纖維索，肝竇區無明顯炎性浸潤，匯管區纖維增生明顯，無明顯假小葉形成。肝組織VG染色顯示，肝內纖維中度增生，匯管區及肝竇內都有粉紅色膠原纖維沉積，但數量均顯著少于對照組，見圖2。
2.3 肝組織白蛋白和Y染色體雙重原雜交結果 對照組結果見圖3，沒有含黃色顆粒的雙陽性細胞。移植組結果見圖4，可見含黃色顆粒的雙陽性細胞呈散在分布。
3 討論BMDLSC是近年才發現的一群細胞，屬于骨髓干細胞的一個亞群，但這個亞群的確切表型特征至今還沒有闡明。CD34、CD90、CD117、CD133、Sca-1、CXCR4都有可能是BMDLSC的表面標志［4，5］，但都不可能是該亞群的特征性標志，因為這些細胞都是異質細胞群，不是均質細胞。筆者曾利用移植試驗法對骨髓干細胞中的BMDLSC進行篩選，證明CD117+Lin-細胞是一群富含BMDLSC的骨髓干細胞亞群［6］。對于肝纖維化病變，BMDLSC移植可否使其發生逆轉？目前還未見報道。在本實驗中，肝組織HE染色顯示，移植組的肝組織結構修復顯著優于對照組；肝組織VG染色顯示，移植組的肝內纖維數量顯著少于對照組。提示酒精性肝纖維化小鼠在接受BMDLSC移植后，肝纖維化病變的結構在發生改建，肝內纖維化在減少，肝組織結構在恢復。結合本實驗中移植組的肝功能恢復顯著優于對照組，表明BMDLSC移植對小鼠酒精性肝纖維化的結構與功能具有顯著改善作用。在本實驗中，移植組的小鼠肝組織中出現既帶Y染色體又表達白蛋白的雙陽性細胞，表明移植的BMDLSC已經在肝內定居并且產生了新的肝細胞。
【參考文獻】
1 唐浩，廖彩仙，周杰，等. 小鼠 C-kit+ Lin- 骨髓細胞移植生成肝細胞的實 驗研究.南方醫科大學學報，2006，26(5):567-98．
2 蘇俊, 廖彩仙, 周杰，等. 構建適合骨髓衍生肝干細胞移植的小鼠酒精性肝纖維化模型.中國組織工程研究與臨床康復,2007,11(4):649-652.
3 張春興, 廖彩仙, 張守華，等. 免疫磁珠分選骨髓衍生肝干細胞亞群c-Kit+lin-.中國組織工程研究與臨床康復,2007,11(7):1232-1234.
4 Crosby HA. Human hepatic stem-like cells isclated using c-kit or CD34 can differentiate into biliary epithplium. Gastroenterology,2001,120:534-544.
5 Kucia M, Wysoczynski M, Ratajczak J, et al.Identification of very small embryonic like (VSEL) stem cells in bone marrow. Cell Tissue Res，2008，331(1):125-34.
6 廖彩仙，唐浩，周杰，等.小鼠骨髓源性肝干細胞篩選及其分化潛能的研究. 中華肝膽外科雜志，2007，13(9):614-616.
作者單位：廣東廣州，廣州市白云區紅十字會醫院外一科 廣東廣州，南方醫科大學南方醫院肝膽外科
