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骨髓CD117+Lin-細胞移植對小鼠酒精性肝纖維化的影響*

來源:《中華醫學研究雜志》 作者: 2009-8-24

摘要: 【摘要】 目的 探討骨髓源性肝干細胞(BMDLSC)移植對肝纖維化病變的影響。方法 16只酒精性肝纖維化雌性小鼠隨機分為移植組和對照組,移植組小鼠(n=8)接受同基因型雄性小鼠的骨髓CD117+Lin-細胞移植,對照組小鼠(n=8)接受等體積的Buffer2液輸注。術后30天活殺小鼠進行肝功能、肝組織HE染色和VG染色、肝組織Y染......


【摘要】  目的 探討骨髓源性肝干細胞(BMDLSC)移植對肝纖維化病變的影響。方法 16只酒精性肝纖維化雌性小鼠隨機分為移植組和對照組,移植組小鼠(n=8)接受同基因型雄性小鼠的骨髓CD117+Lin-細胞移植,對照組小鼠(n=8)接受等體積的Buffer2液輸注。術后30天活殺小鼠進行肝功能、肝組織HE染色和VG染色、肝組織Y染色體和白蛋白雙重原位雜交等檢查。結果 移植組的肝功能和肝結構恢復顯著優于對照組,肝內纖維數量顯著少于對照組,既帶Y染色體又表達白蛋白的雙陽性細胞僅在移植組的肝組織中出現。結論 BMDLSC移植可以顯著改善小鼠酒精性肝纖維化病變的結構與功能。

【關鍵詞】  CD117+Lin-細胞移植;酒精性肝纖維化;小鼠

The action of bone marrow CD117+Lin-cell transplantation on alcoholic liver fibrosis in mice

    LIAO Cai-ji, LIAO Cai-xian, ZHANG Shou-hua, et al. Department of Surgery One, Red Cross Hospital of Baiyun District of Guangzhou City, Guangzhou 510545,China

    【Abstract】  Objective  To explore the action of transplantation of bone marrow-derived liver stem cells(BMDLSC)on hepatic fibrosis induced by alcohol in mice. Methods  16 female mice with alcoholic liver fibrosis were randomly divided into group A and B. The mice in group A(n=8) received syngeneic male bone marrow CD117+Lin- cell transplantation. The mice in group B(n=8) received isovolumetric Buffer 2 solutions infusion. The examinations of hepatic function, hepatic tissue stained by HE and VG, double in situ hybridization of albumin and Y-chromosome were performed at the 30th day postoperatively.Results  Double labelling positive cells were seen only in group A. The hepatic function and morphosis restoration in group A were significantly better than those in group B. The number of intrahepatic fibers in group A were markedly less than those in group B. Conclusion  BMDLSC transplantation could ameliorate remarkably the hepatic structure and function of the mice with alcoholic liver fibrosis.

    【Key words】  CD117+Lin- cell transplantation; alcoholic liver fibrosis; mouse

    最近唐浩等[1]學者發現,小鼠骨髓源性肝干細胞(BMDLSC)移植對放射性肝損傷具有良好的修復作用,并且可以有效預防放射性肝纖維化形成。但是,對于已經出現的肝纖維化病變,BMDLSC移植可否使其發生變化?目前尚不清楚,也未見報道。筆者為此對肝纖維化小鼠接受骨髓CD117+Lin-細胞移植后的變化進行了觀察,發現骨髓CD117+Lin-細胞移植可以顯著改善小鼠酒精性肝纖維化病變的結構與功能。

    1  材料與方法

    1.1  小鼠酒精性肝纖維化模型的建立  SPF級純系BALB/C雌性小鼠,體重15~18g。參照蘇俊等[2]介紹的方法,給予54度白酒灌胃,每天2次,持續16周。第1~3周每次8ml/kg白酒灌胃,第4~7周每次10ml/kg,第8~16周每次12ml/kg。同時將54度白酒用蒸餾水配制成含酒精10% (v/v)白酒作為實驗小鼠的唯一飲料。

    1.2  小鼠分組  (1)移植組:為酒精性肝纖維化雌性小鼠接受同系雄性小鼠骨髓CD117+Lin-細胞移植組,8只小鼠。(2)對照組:為酒精性肝纖維化雌性小鼠接受等體積Buffer2液輸注組,8只小鼠。

    1.3  小鼠骨髓CD117+Lin-細胞分選  BALB/C雄性小鼠8只,無菌條件下獲取股骨和脛骨骨髓,收集骨髓細胞懸液。經裂解紅細胞、8℃條件下離心、尼龍膜過濾等處理,獲得骨髓細胞懸液。應用免疫磁珠分選法[3],第一步采用陰性分選,從骨髓細胞懸液中分選出Lin-細胞,即CD3ε、CD4、CD8a、CD45R、Gr21、Ter-119、CD11b陰性細胞。第二步采用陽性分選,從Lin-細胞中分選出CD117+Lin-細胞。最后用Buffer2液(pH7.2 PBS+0.5%BSA +2mmol/L EDTA)重懸細胞,并將細胞濃度調節至1×109/L。

    1.4  CD117+Lin-細胞移植  移植組小鼠均經尾靜脈注入CD117+ Lin-細胞懸液250μl(2.5×105個細胞),對照組小鼠均經尾靜脈注入250μl Buffer2液。

    1.5  觀察指標與檢測方法  移植后30天,活殺小鼠進行如下檢測。

    1.5.1  肝功能測定  內容包括丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、 天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、白蛋白(ALB)。

    1.5.2  肝組織病理學檢查  內容包括HE染色和VG染色檢查。

    1.5.3  肝組織白蛋白mRNA和Y染色體Sry DNA雙重原位雜交檢查  探針由天津瀚洋生物有限公司提供。ALB mRNA探針序列為:5’-TTGGCAAGTT  CCGCCCTGTC  ATCTGCGC (TAMRA紅色熒光標記),小鼠Y染色體性別決定基因(Sry)DNA探針序列為:5’-GCTGGGATGC AGGTGGAAAA GCCTTACAG(FAM綠色熒光標記)。雜交方法按照試劑盒所附方法進行,在同一張組織切片上先后進行ALB mRNA雜交和Sry DNA雜交。熒光顯微鏡觀察結果。胞漿內含綠色顆粒表示該細胞含Y染色體,胞漿內含紅色顆粒表示該細胞表達白蛋白,胞漿內含黃色顆粒表示該細胞既含Y染色體又表達白蛋白。

    1.6  統計學方法  數據以x±s表示,分析比較采用t檢驗

    2  結果

    2.1  各組小鼠移植后30天的肝功能結果  見表1。表1  移植組與對照組小鼠在術后30天的肝功能變化 注:*P為移植組與對照組比較結果

    2.2  肝組織的病理學改變  對照組小鼠肝組織HE染色顯示,大量肝細胞脂肪變性,胞漿透明。肝小葉點狀壞死,匯管區纖維細胞增生,肝小葉內可見纖維間隔,假小葉形成。肝組織VG染色顯示,肝內纖維重度增生,肝小葉內、匯管區及肝竇內均有較多粉紅色膠原纖維沉積,見圖1。移植組小鼠肝組織HE染色顯示,肝細胞輕度濁腫變性,肝小葉內無壞死灶,偶見少量纖維索,肝竇區無明顯炎性浸潤,匯管區纖維增生明顯,無明顯假小葉形成。肝組織VG染色顯示,肝內纖維中度增生,匯管區及肝竇內都有粉紅色膠原纖維沉積,但數量均顯著少于對照組,見圖2。

    2.3  肝組織白蛋白和Y染色體雙重原雜交結果  對照組結果見圖3,沒有含黃色顆粒的雙陽性細胞。移植組結果見圖4,可見含黃色顆粒的雙陽性細胞呈散在分布。

    3  討論BMDLSC是近年才發現的一群細胞,屬于骨髓干細胞的一個亞群,但這個亞群的確切表型特征至今還沒有闡明。CD34、CD90、CD117、CD133、Sca-1、CXCR4都有可能是BMDLSC的表面標志[4,5],但都不可能是該亞群的特征性標志,因為這些細胞都是異質細胞群,不是均質細胞。筆者曾利用移植試驗法對骨髓干細胞中的BMDLSC進行篩選,證明CD117+Lin-細胞是一群富含BMDLSC的骨髓干細胞亞群[6]。對于肝纖維化病變,BMDLSC移植可否使其發生逆轉?目前還未見報道。在本實驗中,肝組織HE染色顯示,移植組的肝組織結構修復顯著優于對照組;肝組織VG染色顯示,移植組的肝內纖維數量顯著少于對照組。提示酒精性肝纖維化小鼠在接受BMDLSC移植后,肝纖維化病變的結構在發生改建,肝內纖維化在減少,肝組織結構在恢復。結合本實驗中移植組的肝功能恢復顯著優于對照組,表明BMDLSC移植對小鼠酒精性肝纖維化的結構與功能具有顯著改善作用。在本實驗中,移植組的小鼠肝組織中出現既帶Y染色體又表達白蛋白的雙陽性細胞,表明移植的BMDLSC已經在肝內定居并且產生了新的肝細胞。

【參考文獻】
  1 唐浩,廖彩仙,周杰,等. 小鼠 C-kit+ Lin- 骨髓細胞移植生成肝細胞的實 驗研究.南方醫科大學學報,2006,26(5):567-98.

2 蘇俊, 廖彩仙, 周杰,等. 構建適合骨髓衍生肝干細胞移植的小鼠酒精性肝纖維化模型.中國組織工程研究與臨床康復,2007,11(4):649-652.

3 張春興, 廖彩仙, 張守華,等. 免疫磁珠分選骨髓衍生肝干細胞亞群c-Kit+lin-.中國組織工程研究與臨床康復,2007,11(7):1232-1234.

4 Crosby HA. Human hepatic stem-like cells isclated using c-kit or CD34 can differentiate into biliary epithplium. Gastroenterology,2001,120:534-544.

5 Kucia M, Wysoczynski M, Ratajczak J, et al.Identification of very small embryonic like (VSEL) stem cells in bone marrow. Cell Tissue Res,2008,331(1):125-34.

6 廖彩仙,唐浩,周杰,等.小鼠骨髓源性肝干細胞篩選及其分化潛能的研究. 中華肝膽外科雜志,2007,13(9):614-616.


作者單位:廣東廣州,廣州市白云區紅十字會醫院外一科 廣東廣州,南方醫科大學南方醫院肝膽外科


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