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病毒載量檢測在艾滋病診斷中的應用

來源:《中華醫學研究雜志》 作者: 2009-8-24
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摘要: 【摘要】 目的 研究病毒載量檢測在輔助蛋白印跡(WB)實驗結果為“HIV-1抗體不確定”樣本診斷中的應用,以完善艾滋病確證實驗。方法 對我省2003年至今部分HIV抗體確認實驗為不確定樣本進行病毒載量檢測,對部分檢測對象進行隨訪觀察,分析WB結果為不確定者是否感染HIV。結果 23個不確定樣本通過病毒載量檢測有20......


【摘要】  目的 研究病毒載量檢測在輔助蛋白印跡(WB)實驗結果為“HIV-1抗體不確定”樣本診斷中的應用,以完善艾滋病確證實驗。方法 對我省2003年至今部分HIV抗體確認實驗為不確定樣本進行病毒載量檢測,對部分檢測對象進行隨訪觀察,分析WB結果為不確定者是否感染HIV。結果 23個不確定樣本通過病毒載量檢測有20人最終確認為HIV感染或艾滋病病人,3人未感染HIV,為非特異性抗體交叉反應。結論 對WB實驗結果為HIV抗體不確定樣本,可通過病毒載量檢測來輔助確診是否感染HIV,并通過流行病學調查及臨床表現等輔助診斷手段發現出現不確定結果的原因,為及時提供檢測后咨詢和免費抗病毒治療以及母嬰阻斷等措施提供實驗依據。

【關鍵詞】  病毒載量;HIV;不確定;診斷

The application of virus load test in the diagnosis of AIDS

    LIU Hong-lu, LAI Wen-hong, YUAN Dan, et al.Sichuan Center for Disease Control and Prevention, Chengdu 610041,China

    【Abstract】  Objective  To study the application of virus load test in the diagnosis of AIDS for the unconfirmed samples in western blot (WB). Methods  Some of unconfirmed samples in WB from 2003 in Sichuan were selected. Conducted virus load test for all the selected samples and follow-up survey part of samples to figure out whether the subjects were infected HIV. Results  20 samples from 23 were confirmed as HIV infected or AIDS patients, three of 23 were non-infections and the unconfirmed results were produced by the unspecific reaction.Conclusion  Virus load test can be applied as a helpful measure to diagnose HIV infection. When combined with epidemiology survey and clinic manifestations, virus load test can provide experimental basis for conduction post-test counselling, free antivirus therapy and mother-infant dissemination block.

    【Key words】  virus load test; HIV; unconfirmed; diagnosis

    2003年,針對我國艾滋病防治的嚴峻形勢,國家開始對艾滋病病人及感染者實行“四免一關懷”政策。享受“四免一關懷”政策的前提必須是診斷為艾滋病病人或感染者,但目前我國艾滋病的診斷主要是運用蛋白印跡實驗檢測血清或血漿中是否產生HIV抗體[1],檢測結果分為三種,“陽性”、“陰性”和“不確定”,“不確定”結果常常給醫生決定是否進行抗病毒治療以及孕婦是否進行母嬰阻斷等帶來困擾,也給檢測對象帶來痛苦,如何盡早準確地判定檢測對象是否感染HIV,是我們檢測人員研究的方向。HIV病毒載量檢測可定量檢測HIV核酸,與抗體檢測比特異更好,且HIV核酸在體內產生的時間比抗體早,此方法結合流行病學調查以及臨床表現,運用于蛋白印跡實驗中“不確定”結果樣本的檢測,可對受試者做出更準確的判斷。

  1  材料與方法

    1.1  樣本  23份樣本來自我省各篩查實驗室篩查結果為陽性的樣本。

    1.2  儀器和試劑  (1)蛋白印跡儀為新加坡GENELABS公司AUTOBLOT-SYSTEM36、Auto Blot20,半制動核酸提取儀為生物梅里埃NucliSens Mini MAG,病毒載量儀為生物梅里埃Easy-Q(374-2675G)。(2)所有批次WB確認試劑為MP生物醫學亞太私人有限公司蛋白印跡試劑盒,均經過國家藥品、生物制品檢定所批檢合格。(3)核酸提取試劑為生物梅里埃lysis buffer、magnetic extraction reagents試劑盒。(4)NASBA擴增試劑為生物梅里埃EasyQ HIV-1試劑盒。

    1.3  實驗方法

    1.3.1  確證實驗  蛋白印跡試驗,過夜法,試驗步驟及結果判定均參照試劑盒說明書,HIV抗體不確定的判定標準為出現任何病毒特異性條帶,但不足以被判斷為陽性。

    1.3.2  核酸提取  (1)將裂解緩沖液(lysis buffer)放置室溫或37℃孵箱10min,使結晶完全融化,編上與樣本對應的號,離心試管10s 1500g,分別加入200μl待測樣本(如果是陳舊樣本需振蕩后離心取上清),震蕩,15℃~30℃放置10min,離心10s 1500g。(2)槍頭盡量靠近管底分別加入20μl內參(Calibrator)渦旋。(3)振蕩帶磁粉的硅膠懸浮液(Silica),分別加入50μl硅膠懸浮液,即刻混勻,放置室溫10min。(4)離心試管2min 1500g,棄上清。加400μl清洗緩沖液 1(Wash Buffer 1),重懸沉積硅膠,移入標記好的1.5ml離心管。(5)以STEP1的速度于NucliSens mini MAG上清洗30s后,棄上清液。(6)用清洗緩沖液1重復洗1次。加入500μl清洗緩沖液2洗30s,2次。(7)加500μl清洗緩沖液3洗15s,棄上清。(8)加25μl洗脫緩沖液,放入恒溫振蕩器(1,400rpm),(60±2)℃孵育5min。(9)將離心管放入磁盤,移核酸提取液到編好對應號的干凈EP管作為模板,切忌取到硅膠顆粒。

    1.3.3  NASBA技術的核酸擴增[2]  (1)引物和酶先取出在室溫放置5min。(2)取45μl酶稀釋液(ENZdil)加入含酶(ENZ)的小球中(不能劇烈震蕩,然后離心)。(3)取90μl引物稀釋液(PRMdil)加入含引物和探針(PRM)的小球中(立即震蕩,不可離心)。(4)稀釋后的引物分裝到上機管,每管90μl;酶加管蓋上,每孔45μl,分別在管內加入5μl模板。(5)將加入模板的上機管放入孵育器,65℃孵育2min,41℃孵育2min。(6)蓋上上機管管蓋,離心(短暫),混勻,離心(短暫)。(7)放入孵育器,41℃孵育2min。(8)編程,上機運行,結果打印。

  2  結果

    2.1  基本信息和WB實驗結果  23份樣本經WB確認實驗,結果均為HIV-1抗體不確定,其中13份樣本進行了2次以上WB確認。9號由于首次檢測時自述除因血友病常輸血外,無其他可能感染途徑,我們在工作中發現和了解到個別3條帶最后卻變為HIV抗體陰性的情況[3],慎重起見在結果判定上沒直接判為陽性而是不確定,可后來時間跨度近8個月的2次隨訪檢測條帶均未出現任何進展,因而進行核酸檢測。23份樣本中性別分布:男15例,占65.22%;女8例,占34.78%。年齡分布:20歲以下2例,占8.70%;20~30歲(含20歲)7例,占30.43%;30~40歲(含30歲)8例,占34.78%;40歲(含40歲)以上5例,占21.74%。送檢人群:自愿咨詢檢測者(VCT)5例,占21.74%;臨床病人7例(臨床病人主要表現為艾滋病機會性感染),占30.43%;孕婦2例,占8.70%;一般人群6例,占26.09%;其他3例,占13.04%(詳見表1)。

    2.2  病毒載量檢測結果、目前狀況及可能感染途徑  23份樣本進行病毒載量檢測,結果16份擴增出了HIV核酸,另外7份樣本未檢測到。7例臨床病人HIV核酸均為陽性,載量水平在19 000~1 000 000IU/ml;5例VCT的HIV核酸也為陽性,載量水平在1 300~1140 000IU/ml;2例孕婦未檢測到HIV核酸。從13例了解到感染途徑來看,性傳播11例,包括男男同性性行為(MSM)和異性性行為,占主導地位;另外2例為母嬰傳播和輸血傳播。為了證實判斷結果的正確性,我們對部分能隨訪到并愿意接受檢測的人進行了隨訪和檢測,3例臨床病人和1例嬰兒已經死亡,另外4例WB條帶已進展到確認足以判斷為陽性,均與結合病毒載量檢測結果做出的判斷相吻合(詳見表2)。 表1  四川省2003—2008年部分HIV-1抗體不確定結果信息登記表表2  不確定樣本病毒載量檢測結果及綜合結果判定登記表

    3  討論

    艾滋病由于其特殊性,漏診和誤診都可能給感染者或篩查為假陽性的檢測對象帶來很大的痛苦,也可能對社會造成危害。晚期艾滋病病人或窗口期感染者被診斷為“HIV-1抗體不確定”時,無法享受國家的“四免一關懷”政策;盡快將“HIV-1抗體不確定”者區分為是否感染了HIV就顯得尤為重要。基于NASBA技術發展起來的Easy-Q病毒載量檢測,其靈敏度高[4],由于針對檢測HIV核酸所設計的引物非常特異,特異性達99.7%[5],完全的成品試劑盒,人為影響因素非常小,結果非常穩定等特點是普通PCR所不能替代的,可用于幫助確定WB實驗中的“HIV-1抗體不確定”結果。

    3.1  病毒載量檢測可用于窗口期感染者的發現  從艾滋病病毒的動力學模式來看,窗口期感染者由于體內還沒產生出足夠檢測出來的抗體,這時候卻會出現病毒血癥[6],因此核酸檢測可能發現窗口期感染者[7,8]。1號是我省首次運用病毒載量檢測出來的窗口期感染者,也是當時全國首例VCT檢測出來的窗口期感染者,該感染者自述暴露時間清晰,僅10余天就能檢測出病毒載量。1號樣本第1次進行病毒載量檢測是2006年12月6日的樣本,發現陽性后,再回顧性檢測了其前2次樣本,第1次樣本檢測結果為錯誤10,由于樣本量太少,做完此次實驗已將樣本用完,無法進行重復實驗,從擴增曲線來看有一條非常豎直的擴增曲線,而內參卻未能擴增出來,Easy-Q有個檢測范圍,50IU/ml~300萬IU/ml,分析原因可能是該樣本已超過載量檢測限。2號、6號、7號、16號和1號均是自愿咨詢檢測者,均是篩查陽性,確認為不確定,但載量檢測結果都很高;1號、6號、7號隨訪檢測發現其WB抗體確認條帶現在已經進展為全帶或足夠判定為陽性,這幾個檢測對象應該是新近感染上HIV的,屬于抗體產生,但不足以判定陽性。在平常工作中如果發現以VCT形式前來檢測的對象要考慮其為窗口期或新近感染。病毒載量檢測可以推廣運用到一些重要行業中的HIV檢測,比如血站、單采漿站等[9]。

    3.2  病毒載量檢測可發現晚期艾滋病病人  艾滋病病毒主要攻擊人體免疫細胞,最終導致免疫系統被破壞,免疫功能喪失。本次研究發現,一些感染者不知道自己已經感染上HIV,到了艾滋病晚期出現許多機會性感染,在醫院進行檢查HIV抗體篩查為陽性,這時進行WB確認實驗,可能出現不確定結果,而且有的檢測對象反復多次進行確認實驗,結果均為“HIV-1抗體不確定”,這時感染者身體非常脆弱,就算把他們的機會性感染治好了,由于WB確認結果為不確定,病人無法獲得免費抗病毒治療,而且臨床醫生也會因為抗逆轉錄病毒藥物的毒副作用和一些人劇烈的身體反應,不敢給病人隨便使用抗病毒治療藥物,像這樣的晚期艾滋病病人如果不能盡快確診,并及時進行抗病毒治療,他們的生命將很快終結。艾滋病發病晚期病毒載量會非常高,通過病毒載量檢測可以輔助診斷是艾滋病導致一些機會性感染?還是因為其他疾病引起的類似艾滋病癥狀。3號、5號、9號、10號、11號、15號均是臨床病人,WB確認為不確定,而載量檢測結果均非常高。在對待這樣的臨床病人上,如果其具有典型臨床癥狀,流行病學又支持,出現WB確認結果為不確定時候,就應考慮其已經到了艾滋病晚期,盡快進行載量或核酸檢測以指導臨床醫生正確用藥。

    3.3  載量檢測可用于排除HIV假陽性抗體的孕婦  我國目前規定建卡孕產婦均需進行HIV檢測,孕婦由于其所處時間的特殊性,盡快確診是否感染了HIV顯得非常重要,如果感染了HIV可能就涉及妊娠終止或母嬰阻斷,而未感染HIV卻得到“HIV-1抗體不確定”結果也將導致孕婦在心理和生理上受傷害,也容易對胎兒造成影響。本次研究發現,2例WB結果為“HIV-1抗體不確定”的孕婦病毒載量檢測均是陰性,結合流行病學資料,最終判定其為陰性。我省平常使用抗體檢測,并追蹤隨訪發現,孕婦可能會因為懷孕體內激素分泌等因素出現非特異性抗體交叉反應,本次研究結果表明,病毒載量檢測可以對“HIV-1抗體不確定”結果的孕婦進行輔助診斷,以確診或排除HIV感染。

    3.4  載量檢測可應用于嬰兒早期診斷  感染HIV的母親生育的小孩,由于從母體帶有HIV抗體,因此在18個月內進行抗體確認實驗,就算得到陽性結果也無法判斷其是否真正感染HIV,我國目前推薦的是如果不同時間2次核酸檢測陽性就可以確診其感染了HIV。本次研究發現,13號,其父母均為HIV感染者,他第1次檢測時未滿18個月,結果盡管為“HIV-1抗體不確定”,但未出具報告。第2次檢測時已經滿18個月,結果仍然是“HIV-1抗體不確定”,病毒載量檢測為41000IU/ml,從而判斷其已經感染上HIV。本計劃3個月后再對其進行一次復查,結果該小孩一直不間斷的生病最后死亡。

    3.5  載量檢測也可用于普通人群非特異性抗體交叉反應的排除  18號~23號是我省HIV感染情況非常嚴重的地區普通人群檢測中篩查結果陽性,WB確認為不確定的樣本,從本次研究結果來看,在普通人群中也常常存在非特異性抗體的交叉反應,進行核酸檢測可以用于輔助診斷[10]。

    3.6  一個值得關注的問題  隨著社會的發展,人們的包容度不斷提高,我國男男同性性行為逐漸增多,從本次研究結果來看,男男性行為較易造成HIV的傳播。本次研究23人中MSM占21.74%,無論窗口期還是艾滋病晚期,確證結果為不確定的檢測者同過載量檢測最終結果均為陽性。MSM人群“HIV-1抗體不確定”樣本感染HIV的可能性更大,該人群的艾滋病檢測和控制需加大關注力度。

    綜上所述,病毒載量檢測可以替代普通PCR進行核酸檢測,可以用于WB確認結果為不確定樣本的輔助診斷,及時確定檢測對象是否感染HIV,在艾滋病防治工作中發揮重要的作用。

【參考文獻】
  1 《全國艾滋病檢測技術規范》(2004年版).中國疾病預防控制中心,2004,08.

2 NASBA NucliSens System 操作手冊.

3 楊成勇,劉翌.HIV-1抗體蛋白印跡確認與核酸檢測復核對比研究.病毒學報,2006,22(2):114-117.

4 黃怡,張建敏.人類免疫缺陷病毒感染的實驗室診斷.實用醫學雜志,2004,11(10):2206.

5 http://www.jekmed.com/readp.php?wid=183.

6 Murthy KK,Henrard DR,Eichberg JW, et al. Redefining the HIV-infectious window period in the chimpanzee model:evidence to suggest that viral nucleic acid testing can prevent blood-borne transmission. Transfusion, 1999,39(7):688-693.

7 強來英,林旭東,裴麗健,等.人類免疫缺陷病毒感染抗體檢測窗口期血清的檢出.中國輸血雜志,2001,14(6):340-342.

8 軟光萍,安梅,楊孝順,等.輸血難以避免病毒感染窗口期危險.國外醫學·臨床生物化學與檢驗學分冊,2005,26(7): 441-444.

9 潘品良,許文燕,張麒,等.集合HIV RNA RT-PCR方法驗證及其在IDUS中窗口期檢測的應用.中國艾滋病性病,2007,13(3):198-200.

10 黑發欣,張啟云,孫偉東,等. 病毒載量檢測有助于排除人免疫缺陷病毒抗體可疑結果中的非感染者.中華預防醫學雜志,2008,1:43-46.

(編輯:宋 冰)


作者單位:中國第四輪全球基金艾滋病項目(項目編號:CHN-405-G05-H) 610041 四川成都,四川省疾病預防控制中心(Δ通訊作者)


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