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DNA甲基化與腫瘤

來源:《中華醫學研究雜志》 作者: 2009-8-24

摘要: 【摘要】 DNA甲基化是指由DNA甲基轉移酶介導,在胞嘧啶(C)的第五位碳原子上加上一甲基基團,使之變成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的化學修飾過程。DNA甲基化作用的發生和甲基化水平的高低主要取決于DNA甲基化酶。 【關鍵詞】 DNA。甲基化。...


【摘要】  DNA甲基化是指由DNA甲基轉移酶介導,在胞嘧啶(C)的第五位碳原子上加上一甲基基團,使之變成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的化學修飾過程。DNA甲基化作用的發生和甲基化水平的高低主要取決于DNA甲基化酶。涉及到個體的發育、細胞增殖、分化、基因組印記、X染色體失活、基因表達調控和堿基突變等多方面的生物學功能,具有重要的生物學意義[2]。

【關鍵詞】  DNA;甲基化;腫瘤

DNA甲基化是指由DNA甲基轉移酶介導,在胞嘧啶(C)的第五位碳原子上加上一甲基基團,使之變成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的化學修飾過程。這種修飾反應主要發生在CpG二核苷酸的胞嘧啶。在真核生物DNA中,5-甲基胞嘧啶是唯一天然存在的酶性修飾堿基,哺乳動物中5-甲基胞嘧啶約占C總量的2%~7%[1]。CG二核苷酸是最重要的甲基化位點,在基因組中呈不均勻分布,存在高甲基化區、低甲基化區和非甲基化區。DNA甲基化作用的發生和甲基化水平的高低主要取決于DNA甲基化酶。不同于原核DNA甲基化酶的是,真核DNA甲基化酶只有一種,即5-胞嘧啶甲基轉移酶。此酶分子量較大,對蛋白水解酶非常敏感,故對它的研究較晚。Riggs在l975年提出DNA甲基化酶應存在兩類,一類是維持型DNA甲基化酶,以半甲基的雙鏈DNA為底物,在未甲基化的DNA鏈的對稱位點上(如CG)完成甲基化,可確保甲基化方式的遺傳。另一類為從頭甲基化酶,則作用于非甲基化的DNA鏈,產生半甲基化的DNA。甲基化通過圖式和數量的改變,在生物遺傳信息的調節過程中起重要作用。涉及到個體的發育、細胞增殖、分化、基因組印記、X染色體失活、基因表達調控和堿基突變等多方面的生物學功能,具有重要的生物學意義[2]。

    1  甲基化胞嘧啶的分布和CpG島

    真核性染色體組并非均一地被甲基化,而是在非甲基化區域中散在甲基化的區域。二核苷酸CpG在染色體組中地出現頻率為5%~10%。在包括人在內的大多數脊椎動物中,大約70%~80%CpG位點中包含甲基化的胞嘧啶[3]。這些甲基化區域為典型的大塊型染色質,提示它們為含有組蛋白成分,核小體構型及相關轉錄因子的新近復制DNA。與此相反,染色體組中有一些稱作CpG島的小區域,這些區域未被甲基化,GC豐富(60%~70%),CpG/GpC至少為0.6,區域跨度為0.5~5Kb不等,出現頻率為1/100Kb。含有CpG島的染色質通常被高度乙酰化,缺乏組蛋白H1,包含一個無核小體區域。

    在鼠和人所有基因中,大約一半包含有CpG島。CpG二核苷酸聚集區域稱為CpG島(CpG island)。CpG島長約0.5~2.0Kb,呈不連續分布。理論上講,CpG二核苷酸含量應有1/16,但由于生物學上的C-G抑制現象,實際上哺乳動物細胞基因組中C-G含量僅為1%,但C-G抑制現象并不適用于CpG島[4]。整個基因組中,CpG島通常位于基因的啟動子區域,故亦稱5’-CpG島。與其他CpG二核苷酸不同,正常情況下CpG島是以非甲基化形式存在的。

    2  DNA甲基轉移酶

    將甲基轉移至胞嘧啶環的酶稱為胞嘧啶5-甲基轉移酶(Dnmt)。目前已經發現和鑒定了三種DNA甲基轉移酶,Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3,其中Dmnt3又有a、b兩種亞型[5]。Dnmts家族中起主要作用的有Dnmtl、Dnmt3a和Dnmt3b三種酶。Dnmtl主要是維持甲基化狀態,Dnmt3a和Dnmt3b則具有使未甲基化的DNA重新甲基化的作用。DNA甲基轉移酶作用的靶點是DNA中回文結構的CpG。在新近復制的DNA分子中,DNA呈半甲基化狀態,即親鏈甲基化、子鏈未甲基化。哺乳動物DNA甲基轉移酶與這種半甲基化底物有高度親和性。

    3  研究DNA甲基化的方法

    3.1  酶切法  該法是檢測基因組DNA甲基化水平的一種常用方法。提取基因組DNA,采用對5-甲基胞嘧啶敏感的限制性核酸內切酶作用于基因組DNA。對于不存在甲基化的DNA標本,核酸內切酶會在識別序列處切斷DNA雙鏈;對于存在甲基化的DNA標本,則不能切斷DNA,然后以瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果。不同的核酸內切酶識別序列不一樣,根據實驗目的選擇不同的核酸內切酶。

    3.2  限制酶PCR(restriction enzyme PCR)  基因組DNA分別經甲基化敏感和非敏感的核酸內切酶酶切后為模板,用待檢甲基化位點外側序列為引物進行擴增。甲基化敏感的內切酶酶切后的DNA若存在甲基化,則會擴增出包含有甲基化CpG位點的片段;若不存在甲基化則不會有任何片段擴出。當用甲基化非敏感的內切酶酶切后的DNA為模板時,不論該部位是否甲基化都不應有片斷擴出。

    3.3  甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR,MS PCR)  該法是檢測基因組DNA甲基化水平的一種常用方法,原理是DNA經亞硫酸氫鈉處理后,非甲基化的胞嘧啶轉變為尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不變。在PCR反應時,有兩套不同的引物對:其一引物序列來自經處理后的甲基化DNA鏈,若用該對引物能擴增出片段,說明該檢測位點發生了甲基化;另一引物來自經處理后的非甲基化DNA鏈,若用該對引物能擴增出片段,說明該檢測位點沒有甲基化。兩對引物都具有很高的特異性,與未經處理的DNA序列無互補配對。

    3.4  Southern 印跡法  Southern印跡是用甲基化敏感和非敏感的核酸內切酶對DNA進行酶切,對不同位點CpG甲基化的分析需選擇針對該位點特異的核酸內切酶,酶切后的片段經電泳分離后轉移至尼龍膜上,然后用與目的片段特異的探針進行雜交,經顯影后即可分析待檢片段的甲基化狀態。

    以上介紹的只是一些常用的方法,現在還開展了一些新的快速方法如:亞硫酸鹽測序、變性高效液相色譜、PCR熒光變性曲線分析等[6]。

    4  DNA甲基化和轉錄抑制

    在大量的基因中觀察到胞嘧啶甲基化與轉錄反相關,但其確切的作用機制尚不十分清楚。目前有三種可能的機制來解釋DNA甲基化對轉錄的抑制:第一種機制是DNA甲基化直接參與干擾特異轉錄因子與各自啟動子的識別位置結合;第二種機制是通過在甲基化DNA上結合上特異的轉錄阻遏物,或稱為甲基-CpG結合蛋白而起作用的;第三種甲基化抑制機制是改變染色質結構[7]。

    5  DNA甲基化與腫瘤

    5.1  腫瘤細胞中C-T突變  CpG位點是腫瘤中癌基因和抑癌基因突變的熱點。例如在已經調查的人類腫瘤中,p53基因在50%以上的實體瘤中存在突變,而約24%的突變發生在CpG位點,為C-T突變。該突變在結腸癌中幾乎達到50%。CpG二核苷酸自發突變的頻率遠高于其他二核苷酸。5-mCpG二核苷酸中的5-mC能以較高的速率脫氨基轉換為T,非甲基化C也可以脫氨基轉換為U,但是DNA需要經過2次復制周期后,C才能突變為T,所以C突變為T的速率低于5-mC突變為T的速率。雖然5-mC轉換為T的純速率較C只高約兩倍,但實際情況是5-mC突變為T的速率比非甲基化C高10~40倍,因為5-mCpG的高突變率還有其他原因:第一,5-mC和C自發脫氨基分別形成T:G錯配對和U:G錯配對,由于U不是DNA的正常成分,U:G錯配對易被U-DNA糖基化酶識別而被切除,再經β-DNA聚合酶修復,使U:G錯配對恢復為C:G配對。而T:G錯配不易被T-DNA糖基化酶切除,因而發生C-T突變。第二,DNA復制后產生少量T:G-T:A的錯誤修復,使原來的C:G變成了T:A。另外,DNA甲基轉移酶1(DNA methyltransferasel,Dnmtl)具有酶促5-mC或C轉變為T的作用,也增加了C-T突變。

    5.2  腫瘤中的低甲基化  通常在腫瘤形成早期或腫瘤結構形成之前,整個基因組甲基化水平降低,而且特定的癌基因在人類腫瘤中也出現低甲基化。例如,bcl-2基因在慢性B淋巴細胞白血病中的低甲基化和k-fas基因在肺癌、結腸癌中的低甲基化與它們的高水平表達有關。異常高表達的基因表現為低甲基化狀態,說明低甲基化在腫瘤發生中起一定作用。可能在細胞群體中,那些本來就顯示低甲基化的細胞具有形成腫瘤的優勢,DNA低甲基化可能是導致腫瘤形成的祖先細胞克隆擴大的關鍵因素之一。

    5.3  腫瘤抑制基因的高甲基化  除點突變、基因缺失外,啟動子區高甲基化導致轉錄失活是腫瘤中抑癌基因失活的一種表現。腫瘤抑制基因的高甲基化作為基因失活的機制首先在人類散發性視網膜母細胞瘤Rb基因中證實,此后的研究表明Rb基因啟動子區的高甲基化直接抑制了啟動子的活性。在大多數實體瘤中p16的5'-CpG島存在高甲基化。用5-氮雜胞苷(能減少基因中的甲基化位點)處理p16高甲基化的細胞株,可以使其重新具有轉錄活性。現在已發現許多基因在腫瘤中因高甲基化而失活,如p15、APC、THBSl等。

    5.4  誘導染色體的不穩定性  Chen等在分析缺乏DNA甲基轉移酶1(Dnmtl)的胚胎干細胞時,發現染色體重組或丟失導致其基因丟失率比野生型細胞要高得多,表明低甲基化可導致染色體不穩定。Lengauer等把富合CpG的β-半乳糖苷酶基因用逆轉錄病毒導入10個結腸癌細胞株,5個沒有表達β-半乳糖苷酶,這些細胞株都為錯配修復缺陷型(MMR-),而MMR+細胞株可表達該基因,用5-氮雜胞苷處理,誘導MMR-細胞β-半乳糖苷酶基因的表達,通過Southern分析表明MMR-細胞株為MET+(有甲基化能力),而MMR+為MET-。因此認為MMR+細胞株無甲基化能力,直接促使了整個染色體的獲得和丟失,從而導致了腫瘤發生、發展所必需的基因組不穩定[8,9]。

    6  與DNA甲基化有關的臨床和治療

    在腫瘤中高頻率出現的甲基化基因可以作為臨床診斷、病程監控的分子標志物。腫瘤中DNA甲基化改變與臨床具有潛在的關聯,這種變化是微小轉移的一個敏感指標,在這種情況下也具有一定預后價值。既然某些特定生長相關基因的點突變和基因表達缺失與DNA甲基化機制有關,那么修正基因的甲基化狀態就有可能成為一新的腫瘤治療途徑。去甲基化治療腫瘤的設想是建立于以下基礎上的:(1)理論上,無突變或缺失、僅出現高甲基化的生化抑制基因如能重新表達,細胞生長抑制功能就會得到重建。(2)正常體細胞中,受CpG島甲基化機制控制表達的基因較少,因此,誘導基因組去甲基化,將不會造成各種基因的不適當表達。(3)甲基化異常所致滅活的基因對DNA甲基化抑制劑非常敏感,易重新活化。目前已知的胞嘧啶甲基化轉移酶特異抑制劑為5-氮雜胞苷。最近,將此藥應用于臨床治療高危MDS患者,取得了一定療效,但同時存在著不容忽視的毒副作用。為此,有必要考慮進行藥物聯用和尋找新的DNA胞嘧啶甲基化轉移酶抑制劑。Cote等應用全反式維甲酸和5-雜氮胞苷協同作用DLD-l大腸癌細胞系,有效地抑制了腫瘤細胞的生長。主要是5-雜氮胞苷先使DLD-l細胞中甲基化的維甲酸受體基因重新表達,隨后全反式維甲酸發揮其藥理學作用。有學者應用硫代磷酸化的MeTase反義核酸抑制Y1腎上腺皮質瘤細胞內MeTase mRNA的表達,從而可降低胞嘧啶DNA甲基化轉移酶的活性。在體外MeTase反義核酸以劑量依賴性的方式抑制Y1細胞的生長。將此反義核酸注射人LAF1同系小鼠腹腔,可顯著抑制Yl腫瘤細胞的生長,并能降低MeTase水平,同時誘導腎上腺皮質特異性基因C21的去甲基化,使該基因重新得到表達[10,11]。據此,我們認為積極尋找新的DNA甲基化轉移酶抑制劑,加強去甲基化誘導腫瘤的基礎研究具有十分重要的意義。總之,腫瘤的發生不僅與多種基因的遺傳性改變有關,而且多基因的異常甲基化引起的表遺傳改變也起很大的作用。腫瘤發生是多基因的遺傳和表遺傳共同起作用的結果。由以上研究結果可以看出,目前人們正在對甲基化進行不斷的深入的研究,并且取得了較大的進展。

    7  問題與展望

    DNA甲基化在脊椎動物中起著重要的調節作用。有充分的證據說明DNA甲基化在發育和細胞分化過程中對特異基因的靜止起重要作用。5-mC固有的誘變性、低甲基化激活原癌基因、高甲基化使腫瘤抑制基因轉錄失活、由于不能重新甲基化而引起的染色體分離過程中的缺失等因素均可導致腫瘤形成。DNA甲基化的選擇性調節在臨床上可以用來預防和治療腫瘤。要制定安全有效的針對改變DNA甲基化的治療策略,必需徹底搞清楚對甲基化和去甲基化過程起特異性調節作用的因素。同樣,搞清楚參與DNA甲基化誘導基因靜止的因素可以使試圖選擇性調節基因表達的努力變得更為容易[12]。最近的研究已經將DNA甲基化和組蛋白乙酰基作用兩種整體機制聯系起來,但仍須對DNA甲基轉移酶、去甲基酶、甲基胞嘧啶結合蛋白、組蛋白去乙酰基作用及基因轉錄靜止之間的復雜聯系作進一步研究。

【參考文獻】
  1 李素婷.真核生物甲基化狀態.河北醫學,1999,5(10):85-87.

2 張恒,何成強.哺乳動物DNA甲基化的功能與作用.生命的科學,2002,22(3):218-220.

3 趙向前,趙霖,馮玉全.DNA甲基化異常與腫瘤.腫瘤防治研究,1999,26(2):152-154.

4 周永寧,徐采樸.CpG島甲基化與胃腸道腫瘤.世界華人消化雜志,2003,11(1):65-71.

5 劉澤軍,江海宏.DNA甲基轉移酶.生命科學,2002,14(3):141-143.

6 范保星.DNA甲基化檢測方法.國外醫學·遺傳學分冊,2002,25(2):99-101.

7 劉澤軍,前川真人.DNA甲基化的3種可能轉錄抑制機制.生命的化學,2002,22(1):35-36.

8 林立,佘朝富.DNA甲基化及其在腫瘤中的作用.國外醫學.臨床生物化學與檢測學分冊,2002,23(5):278-280.

9 朱益民,來茂德.DNA甲基化在腫瘤發生中的作用.浙江大學學報:醫學版,2003,32(2):162-166.

10 劉永忠.DNA甲基化與腫瘤發生、治療的研究進展.中國癌癥雜志,1999,9(3):258-260.

11 白堅石,何忠效.DNA甲基化作用對細胞癌變的影響.生理學進展,2000,31(1):50-52.

12 范保星,張開泰.DNA甲基化與腫瘤.國外醫學:分子生物學分冊,2002,24(3):139-143.

(編輯:張 犁)


作者單位:433100 湖北潛江,潛江市中心醫院藥劑科


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