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D-氨基半乳糖誘導大鼠急性肝衰竭模型的實驗研究*

來源:《中華醫學研究雜志》 作者: 2009-8-24

摘要: 【摘要】 目的 篩選D-氨基半乳糖(D-Gal)造模的最佳劑量,比較不同劑量D-Gal造成的大鼠急性肝損傷模型的優越性,為保肝新藥的篩選提供合適的實驗動物模型和理論依據。方法 采用64只SD大鼠,以D-Gal作為肝損傷試劑,建成急性肝損傷動物模型,以血液生化、肝功能、肝組織學的改變為觀察指標,篩選大鼠最佳用藥劑量,并觀察D......


【摘要】  目的 篩選D-氨基半乳糖(D-Gal)造模的最佳劑量,比較不同劑量D-Gal造成的大鼠急性肝損傷模型的優越性,為保肝新藥的篩選提供合適的實驗動物模型和理論依據。方法 采用64只SD大鼠,以D-Gal作為肝損傷試劑,建成急性肝損傷動物模型,以血液生化、肝功能、肝組織學的改變為觀察指標,篩選大鼠最佳用藥劑量,并觀察D-Gal所致大鼠肝損傷的動態變化。結果 本實驗條件下,D-Gal 800mg/kg為大鼠的最適劑量,此劑量建立的肝損傷模型肝組織形態變化顯著且死亡率低。結論 D-Gal 800mg/kg誘導大鼠急性肝損傷模型最適用于保肝新藥的篩選與評價。

【關鍵詞】  肝損傷;模型;D-氨基半乳糖;大鼠

The empirical study of acute hepatic failure rat model induced by D-galactosamine

    FAN Xu, FANG Nian.The First People's Hospital of Taizhou City, Taizhou 318020,China

    【Abstract】  Objective  To optimize the dosage of D-galactosamine (D-Gal) to make a rat model of hepatic injury as a tool for the development of hepatic drug. Methods  The model was induced with different doses of D-Gal in 70 rats. The levels of ALT and AST were determined by using automatic biochemical analyzer liver specimens were processed for pathological examination. Results  Comprehensive evaluation of the results showed that the use of D-Gal500mg/kg in rats could induce stable models with low mortality. Conclusion  The hepatic injury model induced with D-Gal500mg/kg in rats is recommended for hepatic pharmaceutical studies.

    【Key words】  hepatic injury; model;D-galactosamine; rat

    肝細胞損傷引起的肝功能障礙在臨床比較多見,如病毒性肝炎、重癥消耗性疾病及藥物中毒等。隨著保肝新藥的不斷問世,有必要建立一種相對穩定的肝損傷動物模型,用以篩選藥品、比較療效并探討作用機理。人們習慣將CCl4致肝損傷模型作為篩選具有保肝降酶作用藥物的常用模型之一[1~3]。而D-氨基半乳糖(D-galactosamine,D-Gal)作為急性肝損傷工具藥,僅需給藥1次,較CCl4方便,目前已被廣泛用于小鼠和大鼠肝損傷模型制備,但其造成肝損傷的劑量,國內外報告差別較大(100~2300mg/kg)[3,4],且D-Gal所致的肝損傷模型動物的血清轉氨酶量存在很大的個體差異。為此,本實驗對比D-Gal致大鼠肝損傷實驗,就D-Gal致動物肝損傷的優越性及最佳劑量選擇進行探討。

    1  材料與方法

    1.1  材料

    1.1.1  藥品與試劑  臨用前將D-Gal(Sigma公司產品)加生理鹽水配成10%的D-Gal溶液,用0.……01mol/L NaOH調pH至7.2~7.4。

    1.1.2  動物  健康SD大鼠64只,體重180~220g,由徐州醫學院實驗動物中心提供。

    1.1.3  主要儀器  全自動生化分析儀(美國杜邦)。

    1.2  實驗方法

    1.2.1  大鼠D-Gal最佳劑量的篩選  40只大鼠按體重隨機分成4組,每組10只,3個實驗組分別一次性腹腔注射D-Gal,劑量依次為600mg/kg體重(D600組)、800mg/kg體重(D800組)、1000mg/kg體重(D1000組);對照組給以等量的生理鹽水。24h后采血測肝功能,并解剖肉眼觀察肝臟表面病變,H-E染色觀察肝臟病變。

    1.2.2  D-Gal致肝臟損傷的動態觀察  24只大鼠隨機分為4組,每組6只,除空白對照組外,其余18只均一次性腹腔注射D-Gal 600、800、1000mg/kg體重,分別于給藥后72h測肝功能,觀察肝臟形態學改變。

    1.2.3  檢測指標  在檢測時間點,動物分別采靜脈血2ml, 分離血清,全自動生化分析儀測定丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)。

    1.2.4  肝臟病理檢查  各組實驗動物采血處死后立即解剖摘取肝臟,肉眼觀察肝臟表面病理變化,并固定于4%甲醛溶液中,取材后流水沖洗,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋切片,HE染色,光學樹脂膠封片,光鏡下觀察。

    1.3  統計學處理  數據用均數±標準差(x……±s)以及均數向量表示,肝功能比較,用Stata9.0軟件進行多變量方差分析(multivariate analysis of variance, MANOVA)。

  2  結果

    2.1  D-Gal對大鼠肝組織形態學影響  腹腔給予不同劑量的D-Gal 24h后小劑量組D600大鼠肝臟色澤較空白對照組淺白,其他沒有明顯改變,D800、D1000組大鼠肝臟表面病理改變明顯,色澤灰白,并有彌漫白色小點或白色壞死病灶,部分大鼠肝臟增大,其程度隨D-Gal劑量的增加而加重,D1000組有1只大鼠死亡。HE染色鏡下有不同程度病變,隨D-Gal劑量增加,病變加重。大劑量組有肝細胞廣泛壞死。壞死的肝細胞解離,胞質嗜酸或呈空泡狀,核碎裂、崩解,壞死細胞間及匯管區有少量中性粒細胞、單核細胞及淋巴細胞浸潤,并有脂肪變性改變。

    2.2  不同劑量的D-Gal對大鼠ALT、AST的影響  不同劑量組大鼠血清AST、ALT均明顯增高,隨劑量增加增高明顯,與空白對照組相比較差異均具有顯著性(P<0.01)(見表1)。綜合肝功能與形態學改變,D-Gal 800mg/kg劑量組肝損傷明確,這一劑量可作為篩選藥物用實驗劑量。表1  不同劑量的D-Gal對大鼠肝功能的影響

    通過Stata9.0軟件先對三組大鼠的肝功能進行多變量方差分析(multivariate analysis of variance, MANOVA)結果:Wilks lambda統計量(W)=0.……0831, F值=13.02,查F界值表,F0.01,(9.70)=2.……67。F>F0.01,(6.70)所以P<0.01。認為三組大鼠的肝功能差異有顯著性。

  3  討論

    肝細胞內許多物質代謝過程與磷酸尿嘧啶核苷密切相關,足量的磷酸尿嘧啶核苷是維持肝細胞正常代謝及生物轉化功能的必要物質,如果發生耗竭,可以引起肝細胞損傷甚至壞死。D-Gal是一種肝細胞磷酸尿嘧啶核苷干擾劑,通過競爭生成二磷酸尿苷半乳糖使磷酸尿苷耗竭,導致物質代謝障礙,引起肝細胞變性、壞死[5]。因此,用D-Gal作為致毒物可制成特異性肝損傷模型。肝損傷動物模型的建立是篩選保肝藥物的關鍵步驟之一。本實驗結果表明,采用D-Gal誘導大鼠做急性肝衰竭動物模型, D-Gal 劑量800mg/kg為大鼠的最適劑量,此劑量建立的肝損傷模型肝組織形態變化顯著且死亡率低,更適用于保肝新藥的篩選與評價。

【參考文獻】
  1 侯艷寧,粱曉莉,程桂芳,等.干擾花生四烯酸的藥物對實驗性肝損傷的影響.解放軍藥學學報,1999,15(1):13-16.

2 張孝衛,耿秀蘭,黃麗華,等.四氯化碳致大鼠、小鼠肝損傷的對比實驗.基礎醫學與臨床,2003,3(3):351-352.

3 楊新波,黃正明,曹文斌,等.CCl4,D-Gal,ANIT致小鼠肝損傷模型的實驗研究.世界華人消化雜志,1998,6(1):19-20.

4 黃正明,楊新波,曹文斌,等.化學性及免疫性肝損傷模型的方法學研究.解放軍藥學學報,2005,21(1):42-46.

5 湯新慧,高靜.實驗性肝損傷的損傷機制.中西醫結合肝病雜志,2002,12(1):53-55.

(編輯:李 木)


作者單位:臺州市科技局資助項目(編號:051KY28) 318020 浙江臺州,臺州市第一人民醫院感染科


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