摘要: 【摘要】 目的 應用流式細胞術檢測外周血白細胞HLA-B27，并結合臨床診斷，尋求診斷強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)的最適合臨界值。方法 應用美國Beeton Dickinson公司流式細胞儀檢測95例AS患者、226例非AS(包括腰腿背痛患者87例，其他SPA患者62例，類風濕性關節炎43例，風濕性關節炎34例)患者及50例健......
【摘要】 目的 應用流式細胞術檢測外周血白細胞HLA-B27，并結合臨床診斷，尋求診斷強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)的最適合臨界值。方法 應用美國Beeton Dickinson公司流式細胞儀檢測95例AS患者、226例非AS(包括腰腿背痛患者87例，其他SPA患者62例，類風濕性關節炎43例，風濕性關節炎34例)患者及50例健康體檢者的外周血HIA-B27表達強度。結果 以美國BD公司試劑設定的界值≥熒光強度147道數為準，僅58例AS患者(61.05％)HLA-B27陽性，其中有17例檢測值在140～146道數之間；非AS組中，HLA-B27陽性11例(4．87％)；健康對照組HLA-B27陽性3例(6．00％)。結論 以進口試劑盒設置的臨界值為準,AS組陽性率過低，與臨床不符，影響一部分AS患者的早期診斷。如降低其臨界值，提高流式細胞術檢測HLA-B27抗原的陽性率，更符合臨床診斷,有利于AS患者的診斷和治療。
【關鍵詞】 HLA-B27；流式細胞術；強直性脊柱炎；臨界值
The settting of flow cytometer assay critical value for HLA-B27 in patients with ankylosing spondylitis
WANG Li, LIU Hong, XIA Wei-min.
The Department of Laboratory, ZiBo Central Hospital, Zibo 255036，China
【Abstract】Objective The flow cytometer assay was used to investigate the express levels of HIA-B27 in patients with ankylosing spondylitis (AS) and according to the clinical diagnosis to discuss the clinical signification of the setting of clinical value to the diagnosis of AS. Methods Flow cytometer from American BD company was used to test the express levels of HLA-B27 from 95 patients with AS, 226 non-AS patients, and 50 healthy control. Results According to the critical value of BD (≥147)，there were only 58 positive cases (61.05％) in AS group and there were 17 AS patients whose HLA-B27 levels were between 140 and 146, there were 11 positive case (4.87%) in non-AS group, and there were 3 positive cases (6.00％) in healthy group. Conclusion The positive rate in AS group is too low, which didn't correspond with the clinical diagnosis. The critical value of importing reagent box is so high that a large amount of padents were let off. If we lower the critical value, the positive rate of HLA-B27 with flow cytometer could be raised and flow cytometer can be more useful to the clinical diagnosis and differential diagnosis.
【Key words】HIA-B27; flow cytometer assay; ankylosing spondylitis; critical value
強直性脊柱炎(ankylosingspondyli,AS)是以中軸關節慢性炎癥為主的全身性自身免疫性疾病，主要累及骶髂關節、髖關節、椎間關節、肋間關節，而以骶髂關節病變最多見，常可致畸。AS診斷主要建立在影像學檢查的基礎上，缺乏實驗室特異性診斷指標，給早期診斷帶來困難。HLA-B27是人類白細胞抗原B位點上的一個重要等位基因。早在20多年前，人們就已發現HLA-B27抗原的表達與強直性脊柱炎密切相關［1，2］。AS患者HLA-B27的陽性率達90%以上，而正常人群HLA-B27的陽性率僅為3%～12%。因此HLA-B27的檢測已成為臨床診斷和鑒別診斷AS的重要輔助手段。近年來，流式細胞儀以其強大精確的細胞分析能力，被認為是當前分析HLA-B27最好的方法之一［3］，在臨床上的應用日益廣泛。由于不同種族人群中HLA-B27的陽性率不同，進口試劑盒使用的判斷陰陽性的臨界值可能并不適用于亞洲人。因此有必要調查分析適用于本地的臨界值。筆者使用美國BD公司的流式細胞儀與試劑盒檢測HLA-B27，以其臨界值判斷陰、陽性，發現其陽性率偏低，有可能漏診一部分患者。因此筆者結合臨床診斷，探討分析臨界值設置對AS診斷的影響，以尋求更適合的參考臨界值。
1 材料與方法
1.1 檢測對象
2007年5月—2009年7月我院門診及住院AS患者95例，其中男74例，女21例，年齡14～58歲，均符合AS診斷標準（采用1984年紐約修訂AS診斷標準）。非AS患者226例（包括腰腿背痛患者87例，其他SPA患者62例，類風濕性關節炎43例，風濕性關節炎34例），健康對照組50例。
1.2 儀器與試劑
FACSCalibur流式細胞儀為美國B-D公司產，熒光標記抗體Anti-HLA-B27-FITC/CD3-PE,10*溶血劑，FL1Calibration beads 均為美國B-D公司產品。
1.3 檢測方法
1.3.1 標本處理
取肝素抗凝全血50μl 和Anti-HLA-B27-FITC/CD3-PE30ul于流式檢測管中，充分混勻，室溫下避光反應20min，加1*溶血劑2ml混勻，室溫下避光反應10min，(1500r/min)離心5min，棄上清，加PBS洗滌（1500r/min）離心5min棄上清，加1%多聚甲醛（PFA）200μl固定待測。
1.3.2 檢測
打開HLA-B27自動分析軟件，用Calibration beads 調試儀器，成功后上樣。在FSC-FL2 的點圖上確定CD3強陽性細胞群體的位置，并設定一個CD3+淋巴細胞門，后根據FSC設定光散射門，除去FSC過大或過小的細胞,自動計數15000個細胞，隨后計算FSC/FL2 門內細胞抗HLA-B27-FITC信號的平均熒光強度（FMI），并與desition marker的值相比較，大于或等于為陽性，小于為陰性。
2 結果
2.1 95例AS患者和226例非AS患者HLA-B27抗原檢測結果
見表1。表1 95例AS患者和226例非AS患者HLA-B27抗原檢測結果（略）
利用FCM檢測95例AS患者HLA-B27，以B-D公司設定的界值≥147為準，AS組HLA-B27的陽性率僅為61.05%, 遠遠低于文獻報道，39.0%的AS患者HLA-B27檢測結果為陰性,這樣有可能造成一部分患者漏診。17.89%的患者，其HLA-B27檢測平均熒光強度值在140～146之間，這一部分檢測結果接近界值，所占比例也較高。非AS組中HLA-B27抗原陽性率為4.87%，有5.31%的非AS患者其HLA-B27抗原檢測結果在140～146道數之間。健康對照組陽性率為6 %（3/50）。
2.2 采用B-D公司流式細胞儀檢測結果與臨床診斷符合情況
見表2。表2 采用B-D公司流式細胞儀檢測結果與臨床診斷符合情況（略）
3 討論
強直性脊柱炎是一種嚴重危害人體健康的全身性疾病。流行病學資料顯示，本病的發病高峰年齡為20～30歲，40歲以后發病少見，男性比女性多見。過去認為AS是一種較少見的脊柱疾病，隨著風濕病學在我國的起步和發展，認識到本病在國內并不少見。由于本病起病緩慢而隱匿，首發癥狀多為十分常見的臨床癥狀，如腰痛或外周關節痛，臨床上容易誤診。目前臨床AS診斷通常采用紐約標準或1984年紐約修訂分類標準，但二者對影像學檢查依賴較大，要求有肯定的骶髂關節炎，臨床實踐證明二者標準皆過于嚴格，滿足其條件者病情均非早期。自1973年發現HLA-B27和強直性脊柱炎具強相關性以來，其在AS診斷中的作用日益受到重視，但對于HLA-B27在AS臨床診斷中所占權重一直有所爭議［4］。另外，雖然流式細胞儀在檢測HLA-B27中得到越來越廣泛的應用，但其陽性臨界值多參考國外標準，中國人群有關參考值少見報道。因此，尋求HLA-B27的參考值及其在AS中的診斷價值顯得十分重要。筆者的研究結果顯示：AS患者最小發病年齡為14歲，高峰發病年齡為18～37歲（占80%），男女比例是3.52：1，男性明顯多于女性，與以往報道一致［5］。在非AS組，包括腰腿背痛，風濕、類風濕性關節炎和其他SPA患者，HLA-B27均有一定的陽性率，符合文獻報道，說明HLA-B27陽性并非一定是AS，而HLA-B27陰性也不能完全排除AS。分析本次研究數據可以發現，以美國B-D公司試劑盒給出的臨界值≥147作為判斷陽性的標準，AS患者的HLA-B27陽性率為61.05%，有38.95%的AS患者HLA-B27檢測結果為陰性，這部分患者很可能被漏診。同時，有17.89%的患者檢測HLA-B27熒光強度道數在140～146之間，非常接近臨界值。如果以≥140為臨界值，則其陽性率提高到79%。表2比較了應用不同臨界值時的診斷效能，在應用原臨界值≥147時，靈敏度為0.61，特異度為0.95，當把臨界值調整為≥140時，其靈敏度提高到0.79，而特異度降低也不多。若將臨界值調整為≥130，其靈敏度升幅不大，僅為0.82，但其特異性下降明顯，診斷效能明顯降低。由于早期診斷AS有助于早期干預治療并改善其預后，所以，盡管調整臨界值為≥140后，損失了一部分特異性，但有助于AS患者的早期診斷，有更大的臨床意義。同時，調整臨界值后，非AS組HLA-B27陽性率未見明顯提高，僅為10.18%，與多數報道相符。由于流式細胞術檢測HLA-B27抗原的熒光強度與樣本T細胞表面HLA-B27抗原表達量有關，同時存在人種差別和個體差別，進口試劑盒是以白種人為樣本設定的臨界值，是否適合中國人群有待考證，筆者認為它的臨界值設定偏高，可能會使一部分AS患者漏診，將其臨界值調整為≥140道數更為符合本地區情況，但仍需進一步加大樣本量驗證并尋求更精確的界值。
【參考文獻】
1 Mcmichel A，Bell J．HLA一27：a diease-associated immune re-sponse gene．Res Immunol，1991，142(5-6)：475-482．
2 Liu Y，Li J，Chen B，et al．Familial aggregation ankylnsing spondylitis in Southern China．Rheumatol，2001，28(3)：550-554．
3 Levering W H，wind H，sintnicolaas K，et al. Flow cytometric HLA-B27 screening： cross-reactivity pattems of commercially available anti-HIA-B27 monoclonal antibodies with other HLA-B antigens．Cytometry，2003，54：28-38．
4 Sweeney S，Gupta R，Taylor G，et a1．Tatal hip Ahmplasty in ankylosing Spotdylitis：outcome in 340 patients．J R heumtd，2001，28(8)：1862.
5 倪吳花,胡曉霞，章圣輝,等．強直性脊柱炎867例HLA-27的表達及意義．實用醫學雜志，2008，24(9)：1511．
作者單位：255036 山東淄博,淄博市中心醫院檢驗科
