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人用流感疫苗的研究現狀及發展前景

來源:中華醫學研究雜志 作者:孫珊珊,南文龍,田明堯,韓佳麗,李 洋,龍 川,姜 伏,霍暢 2011-6-29

摘要: 【摘要】 流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。每年流感的流行都會造成巨大的人力和物力損失。流感疫苗的接種依然是預防流感病毒感染的主要手段,本文主要針對流感的滅活疫苗、細胞培養疫苗及減毒活疫苗、DNA疫苗、表位基礎疫苗、通用疫苗、人用禽流感疫苗的當前應用和研究狀況及發展前景進行了簡要綜述......


【摘要】  流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。每年流感的流行都會造成巨大的人力和物力損失。流感疫苗的接種依然是預防流感病毒感染的主要手段,本文主要針對流感的滅活疫苗、細胞培養疫苗及減毒活疫苗、DNA疫苗、表位基礎疫苗、通用疫苗、人用禽流感疫苗的當前應用和研究狀況及發展前景進行了簡要綜述。

【關鍵詞】  流感疫苗;研究進展

1933年流感病毒首次被用于感染了實驗動物雪貂,開始了人類對流感病毒的認知。數十年來,流感病毒的流行已給人類社會帶來無法估量的損失。20世紀中流感的4次全球性大流行,其結果更是災難性的。自1952年來每年WHO會依據流感病毒的變異規律推薦出的用于下一年度疫苗生產用流感病毒疫苗株。近年來禽流感病毒不斷突破種屬限制感染人類,令流感的流行情況變得更加復雜。

  疫苗的使用依然是預防流感的有效手段,臨床上主要應用的是用雞胚生產的三價滅活疫苗。此外,亞單位疫苗,細胞培養疫苗,減毒疫苗也已經在一些國家中生產應用。最近,人用禽流感滅活疫苗獲得了FDA的批準使用。但至今流感的防治仍是一個全球性的難題,各國的學者們仍在對新型流感疫苗進行探索。

  1 滅活疫苗

  1941年流感病毒滅活疫苗在美國首次被批準使用, 1945年在美國民眾中開始廣泛應用。全球各國長期的使用經歷證實滅活流感疫苗是安全有效的。根據純化工藝可將其分為全病毒疫苗、裂解疫苗和亞單位疫苗。目前,使用的流感疫苗主要是經雞胚培養的滅活三聯裂解疫苗,成分包括甲型流感病毒H1N1株、H3N2株和乙型流感病毒株。研究表明,通常使用流感滅活疫苗可在70%~90%青年人中誘導血清HA抗體產生,而僅可在30%~70%老年人中可誘導血清HA抗體[1]。

  單獨使用滅活疫苗,可能存在激發的細胞免疫水平低下,僅能對抗原相配病毒株產生免疫保護,無法有效在老年人中誘生高水平的抗體等缺陷。學者們開始嘗試在流感滅活疫苗中添加各種不同類型的佐劑,如MF59、ODN、CAMPs、ISCOM、GM-CSF、IL-2等,佐劑的使用有效提高了滅活疫苗的免疫效力。MF59(唯一獲準的人用佐劑)是目前正在應用的一種極具潛力的佐劑。其誘發的抗體水平可達未加佐劑組的1.5倍,同時該抗體具有較好的交叉保護性,對變異的同亞型流感毒株也可產生保護[2]。

  2 細胞培養疫苗

  以雞胚為基質生產流感疫苗需要復雜的純化過程以減少人們對雞胚蛋白產生的變態反應;另外雞胚難于大規模生產以滿足流感大流行突發需求。因此,哺乳動物細胞系被應用于流感疫苗的生產,以哺乳動物細胞為基質制備疫苗具有無外源因子污染,易于規模化生產,能較好的維持病毒抗原穩定等優點。 目前,用于流感疫苗生產的細胞系包括MDCK和Vero兩種。

  MDCK細胞系是最早獲準應用于人流感疫苗的細胞系。Genzel Y采用微載體懸浮技術在無血清培養基中,培養MDCK收獲了高滴度的流感病毒,無血清培養基的使用可以減少在病毒感染前需洗滌去除血清和更換培養基的過程[3]。Solvay公司使用MDCK生產的流感疫苗已經在荷蘭上市。

  Vero細胞系是一種生物制品標化的傳代細胞系,并可用1200L的大型發酵罐進行培養,極大方便了疫苗的生產。大量的臨床實驗表明,Vero細胞試制的流感疫苗有較高的免疫原性,安全可靠。

  3 減毒活疫苗

  減毒活疫苗的使用模擬了病毒侵入機體的狀況,可有效誘導細胞免疫、體液免疫、黏膜免疫的產生,免疫保護持久并廣泛,與滅活疫苗相比能更好應對變異流感病毒的攻擊。

  美國和俄羅斯科研人員通過將流感病毒在雞腎原代細胞和雞胚中于25℃反復傳代,獲得了最早的冷適應“種子株”。大量臨床實驗證明,冷適應減毒流感疫苗具有很好的遺傳穩定性,對成百上千萬人群接種后,證實是安全有效的,而且冷適應減毒流感疫苗比滅活苗更適用于兒童。冷適應減毒流感疫苗在俄羅斯已進入臨床應用,在美國2003年獲得FDA批準。

  通過對NS蛋白和M蛋白改造,可以獲得理想的減毒株。通過截短流感病毒NS1片段,降低了NS1對IFN-r活性的抑制作用,獲得的流感病毒在雞胚和小鼠生長明顯減弱,小鼠和豬在免疫后均獲得了對野生型流感病毒的免疫保護。而缺陷流感NS2,所得到的復制缺陷株同樣保護94%的小鼠抵抗病毒致死性攻擊[4]。

  4 DNA疫苗

  核酸疫苗因能夠同時刺激機體體液免疫和細胞免疫而倍受研究者的青睞,美國國立衛生研究院和世界衛生組織都強調核酸疫苗是流感疫苗的一個重要研究方向。DNA疫苗具有容易操作,穩定,安全的優點,快速易于構建的特點使DNA疫苗能更快應對流感病毒抗原變異的狀況。

  在諸多動物如小鼠、雞、雪貂、豬等實驗中,發現基于流感HA和NA的DNA疫苗主要通過誘生抗體來對機體產生免疫保護。單獨采用HADNA疫苗通過基因槍或肌肉注射的方式免疫小鼠后,可產生高水平的抗HA抗體,抗體類型以IgG1為主,并能維持達1年半之久。通過黏膜免疫,則可在鼻黏液中檢測出抗HA的分泌型IgA。HADNA疫苗產生的抗體可保護免疫動物較好抵御同源病毒的攻擊,保護率達100%。而單獨使用NADNA疫苗產生的保護作用較單獨使用HADNA疫苗弱,但可對具有相同NA亞型,而不同HA亞型的病毒產生交叉保護。采用NP和MDNA可誘生的強烈CD8+CTL和CD4+Th細胞免疫反應,并在抵御病毒攻擊中起到重要保護作用。NP和M基因的保守性,又決定了其DNA疫苗可產生更好的交叉保護能力。

  由于自然狀態下流行野毒株HA和NA常會發生變異,會致所構建的HA或NA DNA疫苗保護力下降,而NP和M基因雖保守,但單獨使用時保護力又相對較差。研究者們常常采用兩種或多種DNA疫苗聯合免疫的策略。聯合使用HA、NA,HA、NA和M1,HA和NP,NA、NA和NP的DNA疫苗均獲得了良好的效果。Xie 等在pBudCE4.1載體不同啟動子下表達HA和M1的DNA疫苗單獨免疫,與同載體分別表達HA和M1的兩種DNA聯合免疫相比,具有更好的免疫保護作用,推斷可能是DNA疫苗轉染進入細胞后,在同一細胞內既表達了HA蛋白又表達了M1蛋白,模擬了自然狀態下病毒侵入的情況,從而產生協同作用[5]。

  5 表位為基礎的疫苗

  隨著生物化學、分子免疫學及基因工程技術的發展,出現了以表位為基礎開發的流感疫苗。表位疫苗可以通過選擇正反應表位避免副反應表位,減少了疫苗毒副作用,提高了安全性,增強了免疫針對性。

  目前,已鑒定出的來源于不同種屬動物,如小鼠、人、雞、山羊、雪貂、獼猴等,來源于不同毒株的流感各類表位600多條。Arnon等以HA91~108B細胞表位,NP55~69Th表位,NP147~158CTL表位為組分,于減毒沙門菌鞭毛蛋白中進行了表達,以純化的鞭毛懸液免疫小鼠誘生了特異性的細胞和體液免疫,并保護小鼠抵抗致死和亞致死性病毒感染,所提供的保護達7個月。賈雷立等構建的復合多表位DNA疫苗和雞痘病毒重組疫苗在免疫小鼠后,獲得了高水平的針對表位的抗體,細胞免疫水平CD4+和CD8+T細胞水平顯著升高[6]。而進一步研究發現,雖然某些表位能誘發強烈的CTL活性,卻不能抵御病毒的攻擊,Sherry R等發現表位HA332~340,M1128~135,PA224~233免疫小鼠后能誘導脾臟中表位特異性CD8+T細胞的增加,但在病毒攻擊后卻推遲了病毒的清除[7]。表位疫苗雖然具有很多優點,但表位發揮功能的機制及強弱,表位的基因限制性,表位與表位間協同作用等問題尚不完全清楚,甚至某些已鑒定的表位本身還存在爭議,表位疫苗需要更深入的研究。

  6 通用疫苗

  流感抗原變化非常迅速,每年各大疫苗公司都要更新疫苗株,到準備好新的疫苗,其生產周期往往需要9個月,人群則需要每年進行免疫接種。如果某一流感大流行株出現,如H5N1禽流感變異株,在制備匹配疫苗的過程中,就可能已造成上百萬人死亡。“通用流感疫苗”-一次接種即能在數年甚至一生的時間中抵抗各種亞型流感的攻擊,即是其研發的初衷。

  由于HA和NA屬于流感病毒表面蛋白,變異性強。最近的研究普遍認為M2和NP是通用疫苗的開發的基礎。盡管M2是一種較弱的抗原,但將其與合適的載體耦聯如乙肝核心抗原,在小鼠實驗中成功抵御了流感病毒的攻擊[8]。通過脂質粒包裹純化的M2e(M2胞外域),可在H5、H1、H6、H9亞型流感之間產生交叉保護作用[9]。雖然迄今為止,還沒有開發出一種針對人的通用流感疫苗產品,但M2和NP的研究在該領域是極具前景的。

  7 人用禽流感疫苗

  甲型 H1N1 流感疫情爆發以來,全球各國都關注疫苗的研發和生產。我國北京科興于6月8日正式獲得由美國CDC提供的甲型H1N1流感疫苗生產用毒株NYMC X-179A,當晚即啟動了種子批制備工作,6月15日正式開始第一批疫苗的生產。

  近幾年, H5N1亞型禽流感病毒在家禽中流行,并不斷造成人類感染及死亡。2007年4月美國FDA首次批準了法國Sanof pasteur公司以越南患者體內分離的A/Vietnam/1203/2004株禽流感病毒生產的滅活疫苗。葛蘭素史克公司開發了含佐劑的H5N1滅活疫苗證實具有很好的交叉保護力。中國科興公司開發的H5N1人用禽流感滅活疫苗已于2008年初完成二期臨床。Holman DH等還進行了腺病毒載體細胞培養滅活疫苗的探索[10]。但目前所有針對H5N1亞型開發的人用禽流感疫苗僅僅是作為戰略儲備,只在可能發生H5N1大流行時由政府統一發放,并不會在市場上出售。

  8 其他研究中疫苗

  流感病毒樣粒子疫苗―通過將流感表面抗原HA、NA、M1重構組裝,缺失病毒的遺傳物質,即形成了病毒樣粒子,在機體免疫遞呈中病毒樣粒子可以模擬天然病毒的狀態,從而增強機體免疫應答的水平。de Bruijn IA的研究顯示,病毒樣粒子疫苗可同時激活體液和細胞免疫,其所具有的免疫原性與佐劑添加疫苗相當[11]。相關產品Inflexal-V已經在瑞士和意大利使用。此外,Treanor JJ進行了重組桿狀病毒表達HA的三價流感疫苗的研究[12]。眾多先前的研究說明,采用重組DNA技術來開發泛保護性的流感疫苗是很具潛力的。

  9 小結

  從人類發現流感病毒至今已有75年的歷史,但每年流感的防治依然是全球性關注的問題,每年流感高發季節,仍會造成巨大人力和物力的損失。在以使用滅活疫苗為主的大背景下,各大疫苗公司及研究單位紛紛進行著新型疫苗的探索。DNA重組技術、反向遺傳技術的成熟,將流感疫苗的開發推入了一個新時期,以此構建與流行野毒匹配的疫苗株制作的滅活疫苗,減毒疫苗紛紛開始投入使用,并獲得了良好的效果。隨著人們對流感病毒本身認知的不斷深入,更逐步形成了開發流感疫苗的新思路,在此指導下研究的新型表位疫苗、通用疫苗、病毒樣粒子疫苗、DNA疫苗等紛紛涌現。相信不久的將來人類定會在與流感的抗爭中獲得最終的勝利。

【參考文獻】
   1 Bardiya N, Bae J H. Influenza vaccines: recent advances in production technologies. Appl Microbiol Biotechnol, 2005,67(3): 299-305.

  2 Ansaldi F, Bacilieri S, Durando P, et al. Cross-protection by MF59TM-adjuvanted influenza vaccine: Neutralizing and haemagglutination-inhibiting antibody activity against A(H3N2) drifted influenza viruses. Vaccine,2008, 26(12):1525-1529.

  3 Genzel Y, Olmer RM, Schafer B, et al. Wave microcarrier cultivation of MDCK cells for influenza virus production in serum containing and serum-free media. Vaccine, 2006, 24 (35-36) :6074-6087.

  4 Watanabe T, Watanabe S, Neumann G, et al. Immunogenicity and protective efficacy of replication-incompetent influenza virus-like particles. J Virol, 2002, 76(2):767-773.

  5 Xie H, Liu T, Chen H. Evaluating the vaccine potential of an influenza A viral hemagglutinin and matrix double insertion DNA plasmid .Vaccine ,2007,25 (44) :7649-7655.

  6 賈雷立,金寧一,魯會軍.流感復合多表位疫苗的設計及小鼠免疫研究.廣西農業生物科學.2006,25(9):209-210.

  7 Crowe S R, Miller S C, Woodland D L. Identification of protective and non-protective T cell epitopes in influenza.Vaccine ,2006,24 (4) :452-456.

  8 De Filette M, Min Jou W, Birkett A, et al. Universal influenza A vaccine: optimization of M2-based constructs. Virology,2005,337(1):149-161.

  9 Ernst WA, Kim HJ, Tumpey TM, et al. Protection against H1, H5, H6 and H9 influenza A infection with liposomal matrix 2 epitope vaccines.Vaccine,2006,24 (24): 5158-5168.

  10 Holman DH, Wang D, Raja NU, et al. Multi-antigen vaccines based on complex adenovirus vectors induce protective immune responses against H5N1 avian influenza viruses. Vaccine (2008), doi:10.1016/j.vaccine,2008,02.053.

  11 Bruijn IA, Nauta J, Gerez L, et al. The virosomal influenza vaccine Invivac: immunogenicity and tolerability compared to an adjuvanted influenza vaccine (Fluad) in elderly subjects. Vaccine, 2006,24(44-46):6629-6631.

  12 Treanor JJ, Schiff GM, Hayden FG, et al. Safety and immunogenicity of a baculovirus-expressed hemagglutinin influenza vaccine: a randomized controlled trial. JAMA,2007,297(14):1577-1582.

  


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