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抗毒素F(ab‘)2含量檢測方法的改進研究

來源:中華醫學研究雜志 作者:馮 泓,徐 英,熊琳娜,張 金Δ 2011-6-29

摘要: 【摘要】 目的 為了準確檢測抗毒素類制品的F(ab‘)2含量,客觀地反映制品的純度。方法 采用了中檢所血清室提供的方法(以下稱為改良法)和2005版《中華人民共和國藥典》三部中F(ab‘)2測定方法(以下稱為原方法),用以上兩種方法分別對15批破傷風抗毒素進行了3次測定。結果 兩種方法的結果差異有顯著性(P<0。......


【摘要】  目的 為了準確檢測抗毒素類制品的F(ab')2含量,客觀地反映制品的純度。方法 采用了中檢所血清室提供的方法(以下稱為改良法)和2005版《中華人民共和國藥典》三部中F(ab')2測定方法(以下稱為原方法),用以上兩種方法分別對15批破傷風抗毒素進行了3次測定。結果 兩種方法的結果差異有顯著性(P<0.05)。原方法檢測結果普遍低于改良法,而且電泳時間長至7~8h,電泳區帶較寬,分辨率低。結論 改良法不僅電泳時間短、分離效果好,而且結果真實可靠,能夠真實反映制品的F(ab')2含量,同時也能準確的確定血漿經過胃酶消化正常生產制品中含有不同分子量的聚集體、聚合體、Fab、Fc片段以及小分子量雜質及其含量范圍,實驗結果表明改良法優于原F(ab')2測定方法。

【關鍵詞】  抗毒素; F(ab')2;電泳

 【中圖分類號】  R446.69        【文獻標識碼】  A        【文章編號】  1680-6115(2010)01-0010-03

  

  Improvement on determination method for antitoxin F (ab ')2

  FENG Hong,XU Ying, XIONG Lin-na , et al.

  Lanzhou Institute of Biological Products, Lanzhou 730046, China

  【Abstract】  Objective  In order to check the content of F(ab')2 in antitoxin precisely , and objectively reflect the purity of products. Methods  Measured 15 batches of tetanus antitoxin three times by two different ways respectively, one way was called improved method, which was provided by the Department of Serum Products,National Institute for the Control Of Pharmaceutical and Biological Products, the other was from Pharmacopoeia of the People's Republic of China. Results  Two methods were significantly different(P<0.05). The content tested from 2005 edition of Pharmacopoeia of the People's Republic of China was generally lower than the improved method, and the electrophoresis time was as long as 7~8 hours, electrophoresis zone was wide and the distinguishability was low. Conclusion  The new method improve the electrophoresis speed greatly, the effect of separation is good, and the results are accurate and reliable, which can truly reflect the content of product F(ab')2 and also determined the content scope of  the aggregates, polymers, Fab, Fc fragments and small MW impurities in products which have been digested by gastric enzyme. The test result shows that the improved method is much better than the former one.

  【Key words】  antitoxin;F(ab')2;electrophoresis

  

  精制白喉、破傷風、氣性壞疽、肉毒抗毒素類制品均分別由各該類抗毒素的馬血漿經胃酶消化后提純制得的液體或凍干抗毒素球蛋白制劑,分別用于各相應疾病的預防和治療。抗毒素免疫血漿在胃酶的消化下,IgG分子被切割為F(ab')2和Fc兩個片段,不具生物學特性的又不耐熱的Fc段經加溫變性而除去,留下的即為具有生物學特性且能中和相應毒素的抗毒素F(ab')2[1],制品中完整IgG的存在,會導致病人對外來蛋白的敏感性,因此,F(ab')2含量檢測準確與否,直接關系到評價生產工藝及制品質量的好壞,F(ab')2檢測方法的改進對生產工藝的指導作用不可忽視,建立更加有效的F(ab')2檢測方法,客觀、準確地評價生產工藝及產品質量,是抗毒素類制品質量控制的有效方法。

  1  材料與方法

  1.1  材料

  1.1.1  儀器和設備  DYY-Ⅲ電泳儀一套(垂直板型);UMAX Powerlook 2100XL型掃描儀。

  1.1.2  試劑  原方法試劑見2005版《中華人民共和國藥典》三部附錄Ⅷ F。改良法試劑:30%丙烯酰胺溶液:取丙烯胺29g,甲叉雙丙烯酰胺1g, 加水使溶解成100ml;分離膠緩沖液(1.5mol/L  Tris  pH 8.8 溶液):取Tris 18.17g,去離子水溶解,濃鹽酸調pH值至8.8,加水定容至100ml;濃縮膠緩沖液(1mol/L  Tris  pH 6.8 溶液):取Tris 12.11g,去離子水溶解,濃鹽酸調pH值至6.8,加水定容至100ml;10% 過硫酸銨:取過硫酸銨1g,去離子水定容至10 ml;10% SDS:取 SDS 10g,去離子水定容至100 ml;Tris-甘氨酸電泳緩沖液:取 Tris15.1g,甘氨酸94g,10% SDS 50ml,去離子水定容至1000ml,電泳時5倍稀釋使用。樣品緩沖液:取 4% SDS 0.4ml,20%甘油2ml,用Tris(pH 6.8)定容至10ml;電泳染色液:取考馬斯亮藍R-250 1.25g,乙醇250ml,冰醋酸100ml,去離子水定容至500 ml;電泳脫色液:取乙醇200ml,冰醋酸100ml,去離子水定容至1000ml。

  1.1.3  方法  原方法見2005版《中華人民共和國藥典》三部附錄Ⅷ F。改良法: 10%分離膠、5%濃縮膠配制見表1、表2,聚合30min左右。表1 10%分離膠配制 表2 5%濃縮膠配制

  1.2  供試品處理  稀釋供試品約2mg/ml后,取50μl,加樣品緩沖液50μl,混勻后100℃水浴加熱。上樣:每一孔內加入經處理的供試品25μl。電泳:采用80V垂直恒壓電泳,待溴酚藍電泳至底部時停止電泳。染色:將凝膠放入染色液中染色。脫色:將凝膠放入脫色液中平緩搖動4~8h,期間應更換脫色液3~4次。凝膠掃描分析:脫色充分后,用凝膠掃描系統對凝膠進行拍照,用軟件分析F(ab')2和各雜帶的含量。

  1.3  統計學分析  采用配對t檢驗,P<0.05為差異有顯著性。

  2  結果

  2.1  兩種方法檢測破傷風抗毒素F(ab')2含量凝膠分離結果比較  見圖1,圖2。

  圖1、圖2分別為10批制品分別用原方法和改良法凝膠分離的結果。從圖中可以看出:相同的樣品在不同方法下的分離結果不同,原方法分離模糊,電泳區帶寬,分辨率低;改良法分離清晰,電泳區帶窄,分辨率高[4]。圖1原方法凝膠分離結果 圖2改良法凝膠分離結果

  2.2  原方法與改良法凝膠掃描結果對比  見圖3,圖4。圖3、圖4分別為原方法、改良法凝膠掃描結果。從圖中可以看出:同一樣品在不同方法下的分離效果不同,導致其掃描結果不同。原方法顯示除過F(ab')2峰的雜峰數目少但含量高, F(ab')2百分含量相對較低;改良法則顯示除過F(ab')2峰的雜峰數目多,雜峰含量低, F(ab')2百分含量相對較高。圖3  原方法凝膠掃描結果   圖4  改良法凝膠掃描結果2.3  原方法和改良法  檢測的F(ab')2含量結果的比較見表1。
  表1為采用原方法和改良法分別對15批破傷風抗毒素進行檢測,每一樣品做3次,每次做雙份,檢測結果顯示:原方法檢測結果普遍低于改良法檢測結果。對兩種方法進行統計學分析,可以得出,兩種方法結果差異有統計學意義(t=16.78  t(14,0.05)= 2.145,P<0.05)。表1原方法和改良法檢測的F(ab')2含量結果的比較(略)
  
  3  結論

  改良法能夠真實反映制品的F(ab')2含量,同時也能準確確定血漿經過胃酶消化正常生產制品中含有不同分子量的聚集體、聚合體、Fab、Fc片段以及小分子量雜質及其含量范圍,實驗結果表明改良法優于原F(ab')2測定方法。

  4  討論

  用2005版《中華人民共和國藥典》三部中F(ab')2測定方法檢測的F(ab')2含量,其檢測結果普遍低于用中檢所血清室提供的方法檢測的F(ab')2含量,而改良法由于使用了濃縮膠,使得樣品分離清晰,電泳區帶窄,分辨率高,因此,改良法更能客觀、準確的地評價產品質量,其分離結果更為真實,分析結果更為可靠;同時,改良法由于電泳時間大大縮短,使得樣品分析時間縮短,這樣,更便于實際工作使用,提高工作效率。另外,15批破傷風抗毒素檢測結果還顯示:分離區帶中無IgG條帶顯現,凝膠掃描圖譜中也沒有IgG峰出現。由此說明免疫血漿經過胃酶將IgG徹底消化為F(ab')2、Fab、Fc片段以及小分子量多肽,經過純化后的制品對人體更為安全,同時也說明現行生產工藝較為安全可靠,改良法已被2010版《中華人民共和國藥典》定為檢測F(ab')2含量的法定方法。

【參考文獻】
   1 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典(三部).北京:化學工業出版社,2005:附錄44.

  2 趙鎧,章以浩,李河民.醫學生物制品學,第2版.北京:人民衛生出版社,2007:1144.

  3 楊樹勤.衛生統計學.北京:人民衛生出版社,1985.

  4 郭堯君.蛋白質電泳實驗技術, 第2版.北京:科學出版社,2005.

  


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