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羊膜移植治療眼表疾病機理的研究進展

來源:中華醫學研究雜志 作者:黃超平 2011-6-29

摘要: 【摘要】 羊膜移植現已被廣泛應用于治療眼表疾病,如翼狀胬肉、化學傷、瞼球粘連以及角膜潰瘍(包括感染性角膜潰瘍和神經營養不良性角膜潰瘍)等, 并已被證實羊膜移植用于翼狀胬肉手術能減少翼狀胬肉復發。用于治療瞼球粘連,可減少瘢痕形成以重建眼表。本文就羊膜移植治療眼表疾病的機理進行綜述。 【關鍵詞......


【摘要】  羊膜移植現已被廣泛應用于治療眼表疾病,如翼狀胬肉、化學傷、瞼球粘連以及角膜潰瘍(包括感染性角膜潰瘍和神經營養不良性角膜潰瘍)等, 并已被證實羊膜移植用于翼狀胬肉手術能減少翼狀胬肉復發。用于化學傷和角膜潰瘍,可促進角膜上皮增生和修復以及抑制新生血管形成。用于治療瞼球粘連,可減少瘢痕形成以重建眼表。本文就羊膜移植治療眼表疾病的機理進行綜述。

【關鍵詞】  羊膜移植;眼表疾病;進展

 羊膜移植最早由Davis1910年報道用于治療燒傷的皮膚。1940年De Roth首先使用帶有絨毛膜的羊膜治療結膜缺損6例,結果5例羊膜發生了進行性萎縮、自溶而失敗。后來未見更多的相關報道。在1995年Kim和Tseng改進取材方法和保存方法后才獲得成功。1997年Lee等報道在臨床上應用保存的人羊膜移植術可有效地治療角膜潰瘍。人羊膜移植漸漸推廣應用于眼科臨床,尤其是應用于治療眼表疾病,已成為治療眼表疾病重要而有效的方法之一。但其治療眼表疾病的機理目前仍不十分清楚,現就以下幾個方面對人羊膜移植治療眼表疾病的機理進行綜述。

  1 低抗原性

  人羊膜無血管和淋巴管, 故相對于帶有血管和淋巴管的組織來說其抗原性低。1981年,Akle CA、Adinofli M及Welsh KI等將羊膜移植于皮膚下,6周內未見炎性細胞浸潤、肉芽組織增生及新生血管形成。1982年,Adinofli M及Akle CA等用免疫熒光染色技術在新鮮及試管內培養的人羊膜上皮細胞內均未發現HLA-A、B、C和DR抗原以及β2-微球蛋白的表達, 而用更敏感的放射生物技術檢測, 才發現微量HLA-A、B、C和DR抗原以及β2-微球蛋白的表達。后來的研究發現人羊膜上皮細胞表達I型HLA抗原和含有I型HLA的mRNA。Houlihan JM等研究發現人羊膜上皮細胞表達HLA-E和HLA-G。而Hammer A等[1]研究發現羊膜上皮表達經典HLA- I和HLA-G。Kubo M等[2]也發現在冷藏的羊膜中的上皮細胞、間充質細胞、纖維母細胞均表達I型HLA抗原,一些纖維母細胞出乎意料地表達II類HLA抗原。羊膜移植到角膜緣處,雖然有一些CD4+和CD8+ T細胞圍繞羊膜移植物,但其反應是溫和的。而移植到角膜內,所有的羊膜移植物均未被排斥且保持透明,也無宿主細胞浸入。相反所有移植到角膜內的皮膚移植物均在3周內被排斥。這些研究雖未證實人羊膜無抗原性,但表明其抗原性低。所以在同種異基因移植中不易引起排斥反應[3]。

  2 良好的基底膜替代物

  在移植手術中羊膜可作為一個載體起著生物支架作用,即起著基底膜的作用。羊膜的基底膜中含有IV型膠原、整合素、板層體等成分, 這些成分在上皮細胞向基底膜的附著及上皮細胞的移行、增殖和分化中都起著重要的作用[4]。羊膜、結膜和角膜的基底膜中層黏連蛋白-1、層黏連蛋白-5、纖維連接蛋白和Ⅶ型膠原的分布是相同的。且羊膜基底膜中的 IV型膠原的α亞鏈的分布與結膜中的分布相同,只與角膜基底膜中的分布不相同。所以羊膜同結膜可能有共同的基底膜成分, 故其可作為結膜基底膜的替代物[5]。在羊膜上培養的兔結膜上皮細胞主要呈現一個非杯狀細胞結膜上皮的表型[6],但其不能誘導結膜上皮細胞轉分化成角膜上皮細胞[7]。由于羊膜在鞏膜上形成了連續性膠原薄墊片, 其可能具有抑制結膜下纖維化的機械屏障的功能,通過羊膜移植, 為病變組織提供了健康的上皮下基質環境, 可以促進正常結膜上皮化, 防止廣泛性結膜下纖維化瘢痕形成[8]。在翼狀胬肉及瞼球粘連等手術中,羊膜覆蓋在裸露的鞏膜表面,有利于結膜上皮的生長、移行,從而有利于眼表重建。同時羊膜具有極強的抗結膜間粘附效果也有助于防止瞼球粘連,有利于穹隆部結膜囊的成形[9]。

  3 促進上皮增殖、分化和生長

  羊膜中含有許多促進上皮增殖、分化和生長的細胞因子。在保存的人羊膜中,逆轉錄PCR顯示人羊膜中含有表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、角質細胞生長因子( KGF)、肝細胞生長因子( HGF)、轉化生長因子α(TGF-α) 、轉化生長因子β1(TGF-β1)、轉化生長因子β2(TGF-β2)、轉化生長因子β3(TGF-β3)以及KGF受體(KGFR)和HGF受體(HGFR)的mRNA, 而ELISAS結果顯示人羊膜中含有EGF、 bFGF、KGF、HGF、TGF-α、TGF-β1和TGF-β2等七種細胞因子[10]。這些細胞因子,特別是EGF、bFGF、KGF和HGF在羊膜移植治療眼表創傷中起著重要的作用。

  3.1 EGF 是Cohen1962年報道的從小鼠頜下腺提取到一種熱穩定蛋白, 它可以對眼瞼和門齒的發育產生刺激作用[11],對表皮生長具有直接作用, 對多種組織來源的上皮細胞亦有很強的促分裂活性,還能刺激各種間質細胞增殖。EGF通過與其受體(EGFR)結合后被活化并傳導細胞內信號發揮生物學作用。人角膜廣泛表達EGFR[12],Savage首先證明了EGF可以刺激角膜上皮增生, 在傷口愈合中能刺激角膜上皮細胞增殖、趨化和移行。

  3.2 bFGF 是一種具有很強的促進細胞生長作用的因子,能在極低濃度下起作用,具有廣泛的生物學效應。其參與網狀內皮組織及結締組織的修復,對神經系統亦有營養作用,在胚胎發育中具有促進細胞增殖和分化的功能,還參與內分泌及生殖功能的調節。此外, FGF能促進角膜上皮細胞和角膜細胞分裂、趨化、移行和傷口愈合。人和動物眼中存在著的FGF主要由bFGF起作用,它的作用比aFGF強10~100倍。FGF存在兩類受體(FGFR):一種是高親和力受體,一種是低親和力受體。FGFR也分布于人角膜組織中。

  3.3 KGF 由Rubin等分離提純的26至28KD的單鏈多肽, 并被證實有促進上皮細胞的增殖與分化,維持細胞骨架的穩定等作用。Sotozono等的實驗表明,KGF明顯地促進了兔角膜上皮細胞的分裂、增殖。KGF可以促進角膜上皮細胞與內皮細胞的分裂、增殖, 但不能促進成纖維細胞的增殖,其受體大多分布在角膜上皮細胞。

  3.4 HGF 可作用于多種組織細胞,具有促進細胞有絲分裂、運動以及組織器官的形態發生等作用。 對于角膜上皮細胞而言,HGF同樣具有促進其增殖、運動、分化等作用。HGF生物活性的發揮是通過與其受體結合, 經過信號轉導實現的, 其在角膜上皮細胞轉導途徑為HGF激活Ra MAPK(mitogen-activated protein kinase)途徑[13]。角膜內皮細胞和纖維細胞可產生HGF并表達HGFR, 角膜上皮細胞僅表達HGFR,而角膜成纖維細胞分泌的HGF可通過旁分泌途徑作用于角膜上皮細胞。HGF不僅在角膜生理平衡方面發揮作用, 而且在角膜的損傷修復過程中起著同樣重要的作用。

  帶有上皮的羊膜比不帶有上皮的羊膜具有更高水平的EGF、KGF、HGF和bFGF的含量,提示這些生長因子為上皮來源[10]。因此,在羊膜取材過程中保持其上皮的完整性及保存過程中盡量維持其上皮的活性。此外,羊膜作為培養基能擴大角膜上皮神經生長因子信號的作用,在嚴重的神經性角膜潰瘍中,羊膜移植能促進角膜上皮快速形成[14]。

  4 含有促進角膜上皮細胞黏附的小分子物質

  人羊膜含有層黏連蛋白-5,其α3鏈以190-kDa和160-kDa的形式存在、其β3鏈以145-kDa的形式存在、其γ2鏈主要以105-kDa的形式存在,極少以155-kDa的形式存在。相似的層黏連蛋白-5的分布亦存在角膜上皮細胞中,層粘連蛋白-5 α3鏈和γ2鏈能增強角膜上皮細胞黏附力,其黏附功能的調節可能與羊膜下的角膜上皮細胞分泌的細胞因子有關[15]。

  5 參與細胞外基質(ECM)、基質金屬蛋白酶(MMPs)/

  金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP-s)、細胞因子、細胞間復雜的網絡調節控制機制,以適應眼表組織重塑和創傷修復對ECM動態平衡的需要,同時抑制瘢痕形成

  5.1 MMPs 是一組參與ECM降解的蛋白酶 不同種屬或細胞間同種MMPs的生物學特性變異非常小,幾乎能降解除蛋白多糖以外的全部的ECM成分,其主要作用為降解基質蛋白, 按其作用底物的不同而被分為四大類: 膠原酶、明膠酶、基質溶素及膜型MMPs。逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)顯示人羊膜上皮細胞和間充質細胞都表達四種TIMPs[16],TIMPs是近年發現的一組抑制MMPs活性的糖蛋白,細胞外基質中TIMPs是MMPs活性最重要的特異性抑制因子, 現已發現4種TIMPs, 分別命名為TIMP 1、TIMP 2、TIMP 3及TIMP 4, 且具有器官特異性[17]。TIMPs分為兩個功能區,其N端功能區的半胱氨酸殘基與MMPs的鋅離子活性中心結合, 其C端功能區與MMPs的其他部位結合, 以1∶1的比例形成復合體, 從而阻斷MMPs與底物結合,抑制酶的活性。TIMP不僅能與酶的催化位點結合, 使酶失活, 還能與酶原的某些位點結合,阻止酶原的活化[18]。近來發現,TIMPs除能抑制MMPs活性外,還具有其他生理功能,如TIMP 2抑制細胞增殖, TIMP 3誘導細胞凋亡[19]。MMPs/TIMPs的表達受多種細胞因子的調節,多數生長因子都可促進MMPs基因的表達與合成, 如EGF、bFGF、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素-1α(IL-1α)和血小板源性生長因子(PDGF)等。如: IL-1、TNF-2、ECF、TGF-α、FGF等可上調MMP-1、MMP-3的表達;而TGF-β、γ-干擾素(IFN-γ)及IL-4則可下調其表達。但TGF-β可促進MMP-2和TIMP的表達, 這種不同的調節作用可能有利于組織的重塑和創傷的修復。

  5.2 抑制TGF-β信號系統的表達 哺乳動物中的TGF-β有3種不同的同分異構體, 即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3,它們分別由不同的基因編碼, 這些TGF-β的成熟的多肽片段具有很高的結構同一性, 同時也具有相似的生物學作用。TGF-β1、TGF-β2被人類眼前段所表達, 它們的生物學作用是通過與其受體結合而發揮。在傷口愈合過程中, 基質成纖維細胞通常被活化,該活化過程包括細胞內收縮裝置的表達。這些收縮裝置主要由α 平滑肌肌動蛋白(α-SM)、α-輔肌動蛋白、肌球蛋白等組成的細胞內F-肌動蛋白微絲束。其中,α -SM水平的高低代表成纖維細胞活化的程度,而Tseng等[20]證實了TGF-β是重要的α-SM上調因子。此外TGF-β可以促進細胞外基質如: 膠原、蛋白聚糖及纖維連接蛋白等的合成與沉積和促進蛋白酶抑制劑及細胞粘附受體的合成,以及減少蛋白酶的合成,這些作用雖然加速了傷口愈合,但也促使了瘢痕形成。而TGF-β1在減少蛋白酶的合成和促進蛋白酶抑制劑的合成中起著主要作用, 羊膜移植治療兔角膜重度堿燒傷, 早期可降低基質TGF-β1mRNA的表達, 起到部分減輕基質混濁的作用[21]。羊膜能抑制TGF-β信號系統、DNA的合成及隨后的肌成纖維細胞分化,在保存羊膜上培養的角膜及角膜緣纖維母細胞早在接觸羊膜8h開始,它們的TGF-β1、β2、β3和TGF-βⅡ型受體轉錄子以及TGF-β1、β2蛋白均被抑制,這種抑制在羊膜移植24h后更為顯著[20]。羊膜表層也能抑制正常結膜的纖維母細胞和翼狀胬肉纖維母細胞中的TGF-β信號系統,它能顯著地抑制正常結膜的纖維母細胞和翼狀胬肉纖維母細胞中的TGF-β2、β3和所有三型TGF-β受體轉錄子的表達,以及α-SM、β1-整合素轉錄子和CD44轉錄子的表達均被顯著地抑制[22]。羊膜移植用于眼表重建能抗瘢痕形成,也能部分解釋為什么胎兒的傷口愈合是無瘢痕[20]。

  6 羊膜中含有抑制新生血管因子和抗炎蛋白

  免疫組織化學研究證實新鮮制備的人羊膜上皮細胞、間充質細胞及羊膜基質致密層都含有TIMP家族所有成員。這些物質在羊膜移植中起著抑制新生血管因子和抗炎效應[16]。在羊膜上培養的角膜緣上皮細胞其IL-α1和IL-β1的轉錄子和蛋白的表達顯著性地減少,羊膜可顯著性抑制脂多糖所誘導IL-α1和 IL-β1的上調作用,這可以部分解釋羊膜移植能減少眼表疾病的炎癥[23]。角膜堿燒傷后可引起大量多形核白細胞浸潤, 其在吞噬壞死組織過程中, 釋放大量活性物。角膜堿燒傷后早期實施羊膜移植術能有效抑制自由基的生成及增強SOD的活力, 新鮮羊膜較保存羊膜含有更多的活性成分, 因而能更有效地減少自由基對組織的損傷[24]。

  7 羊膜能抑制角膜細胞凋亡

  在角膜創傷的早期愈合階段,羊膜能抑制角膜細胞凋亡,從而減輕創傷后角膜的混濁[25]。此外羊膜能抑制角膜上皮細胞凋亡,有利于眼表疾病角膜上皮的修復。

  8 抗感染作用

  羊膜覆蓋在眼表創面可起著屏障作用,同時羊膜具有強大的粘附能力可阻止微生物的移行。Talmi等認為羊膜強大的粘附能力和移植后與植床的緊密接觸(通過彈力蛋白-纖維連接)是羊膜具有抗微生物特性的主要原因, 通過緊密接觸, 宿主自身的防御機制得以發揮作用, 從而降低術后感染的發生率。

  總之,羊膜移植治療眼表疾病的機制是非常復雜的,既含有促進血管形成的生物活性物質,又含有抑制血管形成的生物活性物質;既含有TGF-β1、β2和β3,又能抑制眼表TGF-β1、β2和β3的形成及活性;既含有利于細胞外基質合成的活性物質,又能抑制細胞外基質的合成與沉積。羊膜自身和所含有的生物活性物質形成的這一個復雜的生物學作用,既有利于眼表重建,又能抑制新生血管和瘢痕形成。

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