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噬菌體展示技術在血栓與止血方面的應用

來源:中華醫學研究雜志 作者:張 馳(綜述),寧 勇(審校) 2011-6-29

摘要: 【摘要】 血栓是血液成分在血液循環中于血管或心臟內膜表面形成的血液凝塊或沉積物,導致循環障礙。噬菌體展示技術是將編碼外源編碼序列插入改建噬菌體載體的外殼蛋白基因中,以融合形式共同表達與噬菌體表面的一種技術,是一種高效的篩選體系。本文簡介了相關方面的技術運用與研究進展。 【關鍵詞】 血栓......


【摘要】  血栓是血液成分在血液循環中于血管或心臟內膜表面形成的血液凝塊或沉積物,導致循環障礙。噬菌體展示技術是將編碼外源編碼序列插入改建噬菌體載體的外殼蛋白基因中,以融合形式共同表達與噬菌體表面的一種技術,是一種高效的篩選體系。本文簡介了相關方面的技術運用與研究進展。

【關鍵詞】  血栓與止血;噬菌體展示技術;血栓形成;綜述

 【Abstract】 Thrombosis is a blood component which formed blood clots or sediment on the surface of the intima in blood vessels or the heart in the blood circulation, leading to circulatory disturbance. Phage display technology is to insert the coding sequence encoding conversion of exogenous phage coat protein gene carrier to form a common expression of fusion phage of a technology, is a highly efficient screening system. This paper describes the use of related technical and research progress.

  【Key words】 thrombosis and haemostasis;phage display;thrombophilia;review

  血栓、止血與臨床各科之間的聯系和滲透都非常緊密,從基因水平闡明那些遺傳性和先天性,甚至某些獲得性血栓和出血疾病的發生發展機制已經成為當今該領域的研究潮流。噬菌體展示技術將外源蛋白融合表達于噬菌體顆粒表面,展示的外源多肽可保持相對獨立的空間結構和生物活性。這無疑為血栓與止血學的深入研究提供了強大的工具。

  1 噬菌體展示技術的原理及在血栓與止血方面應用特點概述

  1.1 噬菌體展示技術的原理

  噬菌體作為一種病毒,具有侵入宿主細胞,表達自身衣殼蛋白進行自我復制的能力。利用噬菌體衣殼蛋白基因的特點將編碼外源多肽或蛋白質的基因與噬菌體衣殼蛋白基因融合,從而使需要表達的多肽或蛋白質以融合蛋白的形式展現在噬菌體表面,而被展示的多肽可保持相對的空間獨立性和生物學活性[2]。再通過親和富集等方法篩選表達特異的蛋白或多肽的噬菌體,最后通過宿主菌把特異性蛋白或多肽表達出來。

  1.2 在血栓與止血方面的應用特點

  由于該技術最大的優點就是直接將基因型和表型,分子結合活性與噬菌體的可擴增性聯系到一起,通過配體的特異性親和力或與特異性酶結合剪切性,獲得所需要的多肽或蛋白。因此,它在血栓與止血領域中非常適用于凝血系統與抗凝系統的相關蛋白間相互作用研究、相關因子的抗原分析和抗體制備、多肽類抗凝藥與止血藥的研發及血栓與出血性疾病的臨床早期實驗室診斷技術等方面的廣泛研究與應用。

  2 噬菌體展示技術在出血性疾病中的應用與發展

  2.1 關于血小板的膜受體、抗體及其相關疾病的研究

  特發性血小板減少性紫癜(ITP)是最常見的自身免疫性出血疾病,但分子級的相關自身抗體知道的卻很少。因此,ITP的診斷性試驗和治療缺乏特異性[3]。為了避免傳統的B細胞無限增值法導致的技術缺陷Jessica H. Roark[4]等克隆全部組基因,克隆了血小板自身抗體;并檢測了免疫球蛋白基因的用法,克隆形成能力和抗體特異性。噬菌體展示文庫是由2個慢性ITP病人的脾細胞建成,并且細胞表面競爭性篩選被用來分離幾組獨特的lgG血小板特異性自身抗體。綜合研究結果表明:由遺傳限制性和高特異性輕重鏈產物的結合而純系擴張的B細胞產生的多種多樣血小板抗體決定著與ITP相關的血小板活性抗體的發展。ADAMTS13富半胱氨酸域/間隔域含有一段主要與獲得性TTP(血栓性血小板減少性紫癜Thrombotic Thrombocytopenic Purpura)病人抗體結合的位點。為了研究這種抗體的異質性對富半胱氨酸域的反應,B.M.LUKEN[5]等構建了V基因免疫球蛋白噬菌體庫用來從一位獲得性TTP病人的免疫球蛋白譜中分離單克隆抗ADAMTS13抗體。連接可變區重鏈和輕鏈,表達成單鏈抗體與含有脫整聯蛋白/血小板反應素1/富半胱氨酸域/間隔域的ADAMTS13片段進行結合篩選。分析得到的單鏈抗體揭示出多功能B細胞克隆產生的抗體直接作用于間隔域是可行的,同時表明具有相似抗原特異性的抗體也存在于其他獲得性TTP病人中。血小板膜受體的單克隆抗體已經被廣泛地應用于分析受體結構和功能。人功能阻斷性抗體已經被用于抗血小板藥物的研發。Y.Hagay[6]等從用絲狀噬菌體展示的單鏈抗體庫中通過篩選全部的血小板分離了人相關單克隆抗體。他們得到八條不同的與血小板結合的抗原。有兩條可以被純化作為scFV(單鏈抗體),并且它們相互競爭結合到完整的血小板上。這些數據表明了從人scFvs噬菌體庫用全血小板篩選可以用于分離功能性抗血小板GPIb抗體,這將有利于發展新的血栓治療與診斷的策略。

  2.2 在各型血友病中的應用

  在獲得性血友病中與VⅢ因子凝結的多克隆自身抗體(阻斷劑)被制造出來了。Christoph Kessel[7]等用噬菌體隨機肽庫在病人的血漿中篩選模擬表位小肽以鑒定阻斷劑抗原表位。獲得的肽段序列與FVⅢ上A2和A1區域構象結合。隨著更多的病人標本被篩選分析,更多的FVⅢ的免疫決定域被知道。這不僅可用于獲得性血友病,同樣也可與A型血友病相比照。Edward N. van den Brink等用V基因噬菌體展示方法對人抗FVⅢ抗體進行分子分析,鑒別出一段緊接著A2區酸性區域的新抗原表位[8], 也用該方法從VH1種系基因中找到了人對FVⅢ的C2區特異性抗體[9]。

  3 噬菌體展示技術在血栓形成與血栓性疾病中的應用與發展

  β3-整合蛋白參與經由αⅡbβ3[glycoprotein (GP)IIb-GPIIIa]的血小板積聚,并在血管再生中是經由內皮αvβ3。有抗聚集和促血管生長作用的交叉反應配體(這兩種反應在外周血管疾病中有令人滿意的效果)。為了研究體內外兩條人重組Fab片段的抗聚集和促血管生長作用,特別是β3-整合蛋白,R. ESCHER[10]等通過噬菌體展示技術獲得重組Fab片段。觀察到了在無血小板活性條件下,兩條人Fab自身抗體片段與一段完整GPIIb-GPIIIa受體結合的特異性和高親和力。劑量依賴性纖維蛋白原與GPIIb-GPIIIa結合及血小板聚集被完全抑制了。找到了第一條有全部抗聚集性質的完全人抗GPIIb-GPIIIa的Fab片段,并且不激活血小板。這條片段的研究獲得可能代表了一種新的工具對外周血管血栓病的研究。

  血小板糖蛋白Ibα與VWF的相互作用是血小板黏附的一個早期重要反應。血小板與膠原結合的直接方式是經過膠原的α2β1受體,糖蛋白IV和VI。間接的方式是在膠原與血小板vWF受體(GPIb/IX/V復合物)間vWF形成一座橋。這兩種方式都是維持血小板在高剪切力下粘附性所必需的[11]。Paul A. McEwan[12]等報道了一種介于GpIbα和一強力阻滯肽間復合物的結構。這條肽段局限于與vWF結合域重疊。它有效地起抑制作用是通過穩定一段在vWF結合域上形成擴大的β發夾結構的調節環的可交替α螺旋結構。這段結構明確了一條先前未被識別出的GPIbα結合域并且表現出了一種可發展作用于GPIbα-vWF變構作用的抗血小板靶向制劑。鐮刀紅細胞對血管內皮細胞及皮下基質的高粘附性可能在鐮刀紅細胞血管閉塞的發病機制中起到重要作用。為了獲得與凝血酶敏感蛋白(TSP)結合的抗體,Nicholas A.Watkins[13]等篩選了展示在絲狀噬菌體表面的人scFVs高多樣性文庫。經過三輪的淘選,6條能與純化TSP結合的獨特scFVs被用ELISA分離出來。這為鐮刀紅細胞與TSP黏附時這段區域的作用提供了依據。

  4 噬菌體展示技術在血栓與止血預防與治療中的應用與發展

  (膠原)Collagen-vWF-GPIb/IX/V軸在血栓形成中起到很重要的作用,它表現出一種具有可開發前景的新型抗凝藥的目標。T.SZANTO等[14]用一隨機直線型七肽庫來篩選鑒定了可能干擾vWF-collagen綁定的小片段。他們得到了一個和vWF具有特異的并且有劑量依賴性的結合方式的克隆體。繼續研究證明了這是第一條與vWFc區結合的拮抗多肽,并能在高剪切力下抑制血小板的黏附與聚集;這條肽鏈有望開發為可口服的主導抗凝產品。像很多其他酶一樣,屬于凝血酶/胰蛋白酶家族的成員,存在與特定的酶激活段結合時的特異性選擇問題。因此,這類抑制性藥物就可能會增加不良藥物和高副作用的風險。Dennis[15]等通過天然肽的噬菌體庫找到了抗凝肽段。它與VIIa因子激活段明顯區別的一段牢固結合。這種展示也許是一類可以解決這類問題的方法。肝素被廣泛用作抗凝劑。Els M. A. van de Westerlo[16]等運用噬菌體展示技術篩選了半合成scFV文庫no.1,獲得了19條獨特的人抗肝素抗體。選擇半合成文庫的優勢在于GAGs包括肝素很大程度上沒有免疫原性,因此使用平常抗體產生技術一般很難成功。抗體在肥大細胞內是有與肝素反應活性的。噬菌體抗體庫的篩選提供了獨特的工具用來研究肝素及相關GAGs結構、位點和功能;并且有的結果可用作阻斷劑使用。

  5 噬菌體展示技術在血栓與止血實驗室檢查中的應用與發展

  HIV-1相關血小板減少癥(HIV-1-ITP)是常見的HIV-1感染的并發癥。Klaus Koefoed[17]等用從由3個HIV-1-ITP病人免疫血清構建的免疫球蛋白G噬菌體文庫,分離出一大組經過未固定血小板篩選的人單克隆抗體。由于暴露了的talin-H免疫顯性表位可作為疾病相關進程的結果。talin-H抗體和相關的免疫復合物會對HIV-1-ITP的診斷提供價值。

  6 噬菌體展示技術在血栓與止血方面研究應用的展望

  噬菌體肽庫技術將傳統的表位研究大大簡化。將抗體作為受體暴露于肽庫中,篩選并分析所得到的能與特異性抗體相結合的重組噬菌體肽的序列,再經過與抗原序列相比較,也就得到了抗原決定簇的定位。該方法用于定位VWF、受損的血小板及特異性抗FVⅢ抗體的抗原表位,得到特異性小肽分子與患者體內的抗體相結合,就可以快速、高特異性地診斷相關疾病或中和某些抗體,用于治療免疫性疾病[18]。雖然目前該類診斷與治療試劑用于臨床還較少,但如上所述,研究者們正在以分子水平不斷開發具有普遍診斷和治療價值的免疫優勢抗原表位。

  噬菌體抗體庫可不經過免疫直接利用抗原篩庫,其容量大,篩選能力強,可直接克隆得到抗體基因使得人源化單抗容易制備[19]。血小板的黏附、聚集、釋放是血栓形成的重要環節。拮抗血小板膜糖蛋白對防治血栓性疾病具有重要意義。 雖然噬菌體技術不能進行氨基酸的修飾,只能合成 L型氨基酸,不能對蛋白質進行糖基化加工,密碼子表達偏性,庫容量限制[20],較長的外源肽段易隨機折疊等許多不足,但相信隨著該技術的不斷發展和自我完善,其在血栓與止血領域的運用價值也會不斷增加,診斷治療性產品最終會走向臨床。

【參考文獻】
   1 H. Rasche Haemostasis and thrombosis: an overview.European Heart Journal Supplements,2001,3:Q3-Q7.

  2 Brian K.Kay,Phage Display of Peptides and Proteins:A Laboratory Manual.America:Academic Press,1996:2-9.

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  4 Jessica H. Roark,James B.Bussel,Douglas B.Cines,et al. Genetic analysis of autoantibodies in idiopathic thrombocytopenic purpura reveals evidence of clonal expansion and somatic mutation. Blood, 2002, 100(4): 1388-1398.

  5 B. M. LUKEN, P. H. P. KAIJEN, E. A. M. TURENHOUT,et al.Multiple B-cell clones producing antibodies directed to the spacer and disintegrin/thrombospondin type-1repeat1 (TSP1) of ADAMTS13 in a patient with acquired thrombotic thrombocytopenic purpura. Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2006,4(11): 2355-2364.

  6 Y.Hagay,J.Lahav,A.Levanon,et al. Function-modulating human monoclonal antibodies against platelet-membrane receptors isolated from a phage-display library.Journal of Thrombosis and Haemostasis,2003,1(8):1829-1836.

  7 Christoph Kessel Dr,Wolfhart Kreuz,Katharina Klich,et al. Multimerization of Peptide Mimotopes for Blocking of Factor VIII Neutralizing Antibodies. ChemMedChem 2009,4(8):1364-1370.

  8 Edward N.van den Brink,Ellen A.M.Turenhou,et al. Molecular analysis of human anti-factor VIII antibodies by V gene phage display identifies a new epitope in the acidic region following the A2 domain.Blood,2000,96(2):540-545.

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  10 R. ESCHER, T. CUNG, M. STUTZ, et al. Antiaggregatory and proangiogenic effects of a novel recombinant human dual specificity anti-integrin antibody.Journal of Thrombosis and Haemostasis,2009,7(3):460-469.

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  12 Paul A.McEwan,Robert K.Andrews,Jonas Emsley. Glycoprotein Ib inhibitor complex structure reveals a combined steric and allosteric mechanism of von Willebrand factor antagonism.Blood,2009, 114(23):4883-4885.

  13 Nicholas A.Watkins,Lily M.Du,J.Paul Scott,et al.Single-chain antibody fragments derived from a human synthetic phage-display library bind thrombospondin and inhibit sickle cell adhesion.Blood,2003,102(2):718-724.

  14 SZANTO, T; VANHOORELBEKE, K.; TOTH, G et al. Identification of a VWF peptide antagonist that blocks platelet adhesion under high shear conditions by selectively inhibiting the VWF-collagen interaction.Journal of Thrombosis and Haemostasis,2009,7(10):1680-1687.

  15 Dennis MS, Eigenbrot C, Skelton NJ,et al. Peptide exosite inhibitors of factor VIIa as anticoagulants.Nature,2000,404(6777):449-50.

  16 Els M. A. van de Westerlo, Toon F. C. M. Smetsers, Michel A. B. A. Dennissen, et al. Human single chain antibodies against heparin: selection, characterization, and effect on coagulation.Blood, 2002,99(7):2427-2433.

  17 Klaus Koefoed,Henrik J. Ditzel Identification of talin head domain as an immunodominant epitope of the antiplatelet antibody response in patients with HIV-1-associated thrombocytopenia.Blood,2004,104(13): 4054-4062.

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  19 Jessica L,Teeling, Ruth R, French, Mark S, et al. Characterization of new human CD20 monoclonal antibodies with potent cytolytic activity against non-Hodgkin lymphomas.Blood, 2004, 104 :1793-1800.

  20 Philippa M. O'Brien and Robert Aitken Antibody Phage Display Methods and Protocols. America: Humana Press,2002:5-12.

  


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