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H5N1型禽流感疫苗研發最新進展

來源:中華醫學研究雜志 作者:周韻嬌作者單位:200240上海,復旦大學附屬上海市第五 2013-2-26

摘要: 【摘要】 H5N1是A型流感病毒的一個亞型,也是近年來引起禽流感暴發的高致病性禽流感病毒。在亞太地區肆虐的H5N1型禽流感病毒存在接觸傳染到人的病例,引起了研究人員的高度關注。疫苗免疫是預防高致病性禽流感的重要防線,因此研制高效、安全、實用的禽流感疫苗迫在眉睫,成為世界養禽業關注的焦點。目前廣泛應用的......


【摘要】  H5N1是A型流感病毒的一個亞型,也是近年來引起禽流感暴發的高致病性禽流感病毒。在亞太地區肆虐的H5N1型禽流感病毒存在接觸傳染到人的病例,引起了研究人員的高度關注。疫苗免疫是預防高致病性禽流感的重要防線,因此研制高效、安全、實用的禽流感疫苗迫在眉睫,成為世界養禽業關注的焦點。目前廣泛應用的安全高效的H5N1亞型禽流感病毒的常規滅活疫苗存在著自身的缺點,因此新型疫苗的研發就顯得尤為重要。流感病毒反向遺傳操作系統的建立為新型流感疫苗的研制提供了有力工具。從1997年首例人感染H5N1病毒以來,經過十幾年的不斷探索,流感疫苗取得了顯著成就。本文就目前國內外H5N1亞型禽流感病毒疫苗的開發進展做一綜述。

【關鍵詞】  H5N1禽流感;疫苗;反向遺傳技術;最新進展

 自1878年,首次報道禽流感病例以來,該病毒在全球范圍內擴散。1997年香港爆發的H5N1型高致病性禽流感是首次出現的高致病性禽流感感染人類并造成死亡的病例[1]。隨后,H5N1在東南亞地區蔓延擴散,給家禽養殖業造成巨大損失,并且威脅到了人類社會的公共健康。

  有效的疫苗接種是保護人群及其他易感動物免受流感攻擊的主要醫療干預手段。由于人類尚缺乏針對H5N1高致病性禽流感病毒的免疫力,在可預見病毒流行的條件下,如果能夠快速足量提供疫苗,就可以降低發病率和死亡率。我國在應對高致病性禽流感的防制上,主要采取滅活疫苗免疫的策略,并取得了較好的控制效果。因此,禽流感疫苗的開發和生產則成為預防禽流感大流行的重要舉措。目前使用的疫苗包括滅活疫苗、基因工程活疫苗和DNA疫苗[2]。

  1 H5N1亞型禽流感病毒的分子生物學特點

  高致病性禽流感(highly pathogenic avian influenza,HPAI)是由正黏病毒科流感病毒屬A型流感病毒引起的禽類烈性傳染病。根據病毒核心外的兩種抗原即血凝素(H)與神經氨酸酶(N)的不同可區分為不同亞型,H5N1就是A型流感病毒的一個亞型,也是近年來引起禽流感暴發的高致病性禽流感病毒。禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)最顯著的生物學特性就是亞型眾多,變異頻繁,其分子機制涉及點突變引起的抗原漂移和不同亞型毒株同源重組產生新亞型所引起的抗原轉變。目前已知AIV有15個HA亞型和9個NA亞型。

  1.1 病毒的基因組結構

  禽流感病毒基因組由8個線狀的單鏈負義RNA片段組成,編碼10種病毒蛋白[3],分別為聚合酶(PB2、PB1、PA)、血凝素(HA)、神經氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基質蛋白(M1、M2)、非結構蛋白(NS1、NS2)。通過對其毒株8個片段的測序發現,它們存在一些共同的特點,即所有基因片段的5′端前13個核苷酸均相同,序列為GGAACAAAGAUGAppp5′,3′端也有12個高度保守的核苷酸,序列為3′HO-UCGUUUUCGUCC-5',在這些共有序列中,可部分互補,形成鍋柄環狀結構,該結構是病毒RNA聚合酶結合所必需的核苷酸識別位點。

  1.2 血凝素蛋白(Hemagglutinin,HA)的結構與功能

  血凝素蛋白是病毒表面的主要糖蛋白,也是病毒最主要的表面抗原,可以誘生保護性抗體及細胞免疫,是當前疫苗的主要成分[4]。HA分子通常有6~10個糖基化位點,4個結構域,即信號肽、胞漿域、跨膜域、胞外域,是流感病毒所有蛋白中最重要的一個,具有凝集多種動物紅細胞的性質。

  HA蛋白包括HA1蛋白(47kD)和HA2蛋白(29kD)。HA1上含有HA最主要的5個抗原位點,也是禽流感病毒和細胞表面特異性受體結合的主要位點[5,6]。HA1的變異是導致禽流感病毒發生抗原漂移和抗原轉變的主要原因[7,8]。研究表明HA1上的某個氨基酸變異可以直接導致禽流感病毒由禽類向人類傳播[9]。

  HA與病毒的毒力甚為密切相關,是病毒吸附于易感細胞表面受體的工具,其能否被裂解為蛋白HP(rHA1)和MP(rHA2)是感染細胞的先決條件[10]。

  1.3 非結構蛋白(nonstructural protein,NS)的結構與功能

  NS為非結構蛋白,由第八節段NS基因編碼,編碼2種病毒非結構蛋白NS1和NS2[11]。流感病毒NS1蛋白有兩個比較重要的功能區:A區為氨基酸的RNA結合區,NS1蛋白可通過此區與不同種類的RNA相結合,B區為分子羧基端的效應區,此區可與宿主細胞核蛋白相互作用,抑制細胞核mRNA的運輸[12,13]。兩種蛋白大量存在于感染的細胞中,NS1主要在核內,NS2主要在胞漿內,在病毒粒子內不存在這兩種蛋白成分[14]。NS1相對分子質量約為26kDa,在病毒感染的細胞中含量豐富,病毒復制早期即有NS1蛋白的大量表達,提示NS1蛋白在病毒復制及病毒早期抵抗機體的抗病毒免疫應答過程中具有重要作用[15,16],可以用此來鑒定區分自然感染與疫苗免疫的機體。

  2 H5N1型禽流感病毒基因HA在植物細胞中的表達

  植物具有成熟的遺傳轉化再生系統和完整的真核細胞表達系統,植物醫藥基因工程近幾年來得到迅速發展,利用轉基因植物生產藥用蛋白的報道屢見不鮮。陳亮[17]等人則利用植物遺傳轉化技術,用農桿菌介導法將來自H5N1型高致病性禽流感病毒的HA基因轉化煙草,成功地將目的基因整合到煙草基因組中,并得到表達,為植物源口服疫苗的生產奠定了基礎。

  他們通過對HA基因片段的擴增,并將擴增的基因片段插入到雙元載體pCAMBIA1301的Pst I位點,構建了質粒p1301H5N1,繼而把質粒轉入農桿菌,用改良葉圓盤法[18]將農桿菌轉化煙草后,將無菌煙草苗葉片培養2天后,用含有羧芐青霉素和潮霉素的選擇培養基篩選培養,采用PCR擴增、Southern分析、GUS組織化學染色和Western分析[19],檢測外源基因在煙草中的表達。

  結果表明HA基因整合入煙草基因組中并且獲得很高的轉化率(>90%),而GUS組織化學染色、Western分析結果表明整合入煙草中的外源基因得到大量表達,表達的HA蛋白具有免疫原性。

  3 H5N1型禽流感病毒基因NS1在動物細胞中的表達

  桿狀病毒表達系統具有宿主范圍廣、表達量高、后加工修飾系統完備、使用安全等優點被人們廣泛應用。與原核表達的NS1蛋白相比,桿狀病毒表達系統表達的NS1蛋白在翻譯后能夠更好地被加工和修飾,更接近天然的NS1蛋白,因此具有很好的免疫活性。劉明等[20]利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統在昆蟲細胞中成功表達了H5N1亞型AIV的NS1蛋白。他們將H5N1亞型禽流感病毒(AIV)NS1基因片段插入到桿狀病毒轉移載體pFastBac1中,獲得重組轉移載體pFastBac1-NS1,再將pFastBac1-NS1轉化到DH10Bac感受態細胞中,獲得重組轉座子rBacmid-NS1,繼而轉染昆蟲細胞,實現了NS1基因在昆蟲細胞中的高效表達。由此獲得的疫苗具有很好的安全性,并能夠刺激機體產生足夠的免疫力。經SDS-PAGE與Western blot分析,結果顯示有特異性蛋白表達,并且表達的特異性蛋白與天然蛋白具有相似的免疫活性,ELISA檢測顯示表達的NS1蛋白具有很強的免疫原性和特異性。

  4 H5N1亞型禽流感病毒蛋白在微生物細胞中的表達

  4.1 H5N1禽流感病毒糖蛋白HA1在重組畢赤酵母中的表達

  畢赤酵母作為一種真核細胞生物,不僅生長迅速、操作簡單,而且其醇氧化酶啟動子可嚴格控制外源基因表達,通過對表達產物的后加工,使外源蛋白得到正確折疊和修飾,被廣泛用于基因工程產品的生產。重組畢赤酵母基因工程的重要應用之一是利用高密度發酵分泌表達獲得重組外源蛋白。

  楊坤宇等[21]利用重組畢赤酵母表達系統,通過分批補料培養方式,實現了HA1蛋白在畢赤酵母中的表達,并對高密度分泌發酵工藝進行了優化,在保證rHA1蛋白活性的基礎上,使HA1蛋白的表達量達到了120mg/L。

  他們采用分批補料培養方法,對培養溫度、誘導溫度、補料方式、微量元素等影響菌體生長和產物表達的因素進行工藝優化。結果表明較低的培養溫度有利于rHA1發酵菌種的生長,溫度過高菌體易于衰老;高的誘導溫度有利于提高生物量,而低的溫度則有利于外源蛋白的分泌,適當的溫度則可獲得較高的單位分泌表達量,25℃為rHA1分泌發酵表達的最適誘導溫度。

  甲醇誘導階段是外源蛋白HA1表達階段,甲醇作為碳源兼能源,誘導期的菌體生長與外源蛋白誘導表達過程受甲醇流加策略的影響。過低的甲醇濃度可能導致誘導表達的能量不足而降低表達量,過高的甲醇濃度又將抑制菌體的生長,甚至導致死亡,因此誘導過程中保持一定的甲醇濃度對菌體的生長和rHA1的表達有重要的意義[22~24]。他們對此階段采用了三種不同的甲醇流加方式,并比較了三種誘導方式對外源基因表達的影響。結果表明,補入發酵液總體積0.5%的甲醇,初始碳源消耗完后開始以3ml/(L·h)速度流加甲醇,3h后將流速提高到6ml/(L·h),之后根據DO調節甲醇流加速度,并添加純氧以維持DO在30%左右,這種誘導方式不僅縮短了發酵周期,還提高了目的蛋白的表達量。

  4.2 H5N1禽流感病毒蛋白NS1在大腸桿菌中的表達

  劉暢等[25]根據已經測得的NS基因序列,將NS1基因片段克隆到含T7強啟動子的pET-32a(+)原核表達載體中,通過轉化大腸桿菌BL21,繼而37℃振蕩培養2h至OD600為0.6,加IPTG至終濃度1mmol/L,繼續培養6h收菌,實現了NS1融合蛋白的表達。

  5 反向遺傳技術制備H5N1疫苗

  反向遺傳技術是一個直接針對病毒基因的合理性步驟,它能夠凈化從非正式系統中獲得的或是含有其他病原體的野生型病毒株,并且可以在質粒階段除去HA基因中的致病性因素[26],因此成為目前獲得流感病毒基因工程疫苗的有力手段并且被學術界和工業界等一致確認為制備大流行流感疫苗株的標準技術。利用反向遺傳技術能迅速有效地從一個高致病性病毒株得到無致病性重組病毒株。

  Tian等[27]利用反向遺傳技術處理病毒,隨后用福爾馬林滅活得到全病毒油乳劑滅活疫苗。該疫苗能為小雞提供大約10個月的免疫保護,并且能使鵝和鴨產生的免疫性達6個月以上。他們從我國第一例H5N1高致病性禽流感病例中分離出GSGD/96病毒,從2004年的病例中分離出CKTJ/04和DKSH/04病毒,將病毒接種于10天齡的雞胚中進行增殖。根據文獻[28]構建質粒,通過在pCI質粒的CMV-Rib-Pol I-SV40多聚A信號處的Xba I位點中,插入Pol I啟動子和質粒pPol I-Sap I-Rib的核酶序列片段構建雙向轉錄質粒pBD。通過RT-PCR反應對GSGD/96中的HA和NA全長基因進行擴增,擴增產物插入到pBD的Sap I位點;用PCR反應,將HA裂解位點的氨基酸序列RERRRKKR↓GLF替換成RETRF↓GLF[29]。再將質粒轉染Vero細胞,轉染后的細胞接種10天齡的雞胚,30℃48h后收獲。通過雞紅細胞的血凝和血凝抑制實驗對產物進行鑒定,最后獲得了重組疫苗。

  研究表明,反向遺傳技術可以在幾周內制備出無致病性與高產的重配株,解決了大流行流感疫苗生產中的安全難題。

  6 展望

  開發疫苗最關鍵之處是要找到能夠誘導保護性免疫反應的疫苗配方,2004年以來,世界各國研究機構紛紛研究不同配方疫苗,旨在通過探討使用低抗原含量、添加佐劑等途徑提高免疫原性,從而增加提供疫苗數量的可能性。在疫苗研制上,我國處于領先水平。我國人用禽流感疫苗的研究和開發已與全球同步,將為我國預防流感大流行提供重要的技術與物質儲備。

  反向遺傳學技術的誕生,為流感病毒新型疫苗的開發研究和生產提供了廣闊的空間。利用現有的季節性流感疫苗生產技術,將為大流行爆發前提供更多疫苗儲備,為應對全球流感大流行疫情爆發、控制疾病、保障人民群眾的健康和社會的穩定發展提供比較充分的技術與物質保障。

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