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6周持續游泳運動對大鼠海馬cAMP影響的實驗研究*

來源:中華醫學研究雜志 作者:張安民1,賈慧娟2,胡淑萍1,于 芳3作者單位:1 03000 2013-2-26

摘要: 【摘要】 目的 觀察6周持續游泳運動對大鼠海馬cAMP表達的影響。方法 雄性SD大鼠30只,隨機分為對照組(n=5)和持續運動組(n=25)。建立大鼠持續游泳運動模型,采用酶聯接免疫吸附劑法,觀察大鼠海馬cAMP表達的變化,并用統計學軟件進行數據分析。結果 運動后cAMP的濃度先下降后升高,在30min達到峰值隨后又下降。...


【摘要】  目的 觀察6周持續游泳運動對大鼠海馬cAMP表達的影響。方法 雄性SD大鼠30只,隨機分為對照組(n=5)和持續運動組(n=25)。建立大鼠持續游泳運動模型,采用酶聯接免疫吸附劑法,觀察大鼠海馬cAMP表達的變化,并用統計學軟件進行數據分析。結果 運動后cAMP的濃度先下降后升高,在30min達到峰值隨后又下降。大鼠海馬cAMP濃度在即刻、120min、240min有所下降,與對照組相比差異有顯著性(P<0.05);運動后60min大鼠海馬cAMP濃度達到最低值(P<0.01);運動后30min大鼠海馬cAMP濃度達到峰值,與對照組相比差異無顯著性(P>0.05)。 結論 6周持續游泳運動對大鼠海馬cAMP的表達有影響,具有時效性。

【關鍵詞】  持續運動;大鼠;海馬;第二信使cAMP

 【Abstract】 Objective To observe the six weeks of sustained swimming on hippocampal expression of cAMP. Methods 30 male SD rats were randomly divided into control group (n=5) and the continued exercise group (n=25 rats). To establish a rat model of continuous swimming, the use of enzyme linked immunosorbent method to observe the expression of hippocampal changes in cAMP, and statistical data analysis software. Results After exercise the concentration of cAMP increased in the first 30min after the decline in peak and then decline. cAMP concentration in rat hippocampal instantly, 120min, 240min decrease compared with the control group were significantly different (P<0.05); after movement of 60min the cAMP concentration in rat hippocampus reached the minimum value (P<0.01); after movement of 30 min the concentration of cAMP in hippocampus reached peak, compared with the control group, there was no significant difference (P> 0.05). Conclusion Continuing six-week swimming exercise has influence on rat hippocampus the expression of cAMP, with timeliness.

  【Key words】 exercise; rat; hippocampus; second messenger cAMP

  在社會逐步走向老齡化的今天,與老齡化相伴的腦疾病日益增多,有關人類腦健康問題已成為一項世界性的研究課題。近年來,我國神經系統和精神疾病發病率呈逐年上升之勢,這已引起了社會各界的廣泛關注。體育運動作為一種強身健體的有效途徑,它對中樞神經系統的影響及其與腦健康之間的關系已逐漸引起了人們的注意。合理的運動能夠促進新陳代謝,增進活力,改善心血管功能,提高機體免疫力[1~4]。由于海馬與學習記憶關系密切以及海馬對衰老的易感,許多學者將海馬作為腦衰老研究的理想模型。cAMP是最早確定的第二信使,作為細胞功能的信號傳導物質參與學習記憶過程[5,6]。因此,研究海馬與cAMP的表達變化將會對海馬的學習記憶過程有重要意義。本研究旨在探討6周持續游泳訓練對大鼠海馬cAMP表達的影響,初步探索運動促進腦康復的機制。

  1 材料與方法

  1.1 實驗動物和分組

  實驗動物:SD成年雄性大鼠30只,鼠齡3個月,體重250~300g,由山西醫科大學動物實驗中心提供。飼養條件:分籠飼養,每籠4只,自由飲食,自然晝夜節律光照,室溫(20±5)℃。相對濕度在40%~60%。隨機分為對照組(n=5)和持續組(n=25)。

  1.2 運動模型建立

  采用游泳運動方式建立運動動物模型。游泳條件:塑鋼玻璃游泳池,150cm×60cm×70cm,水深為大鼠身體長度的2倍,約60cm,水溫保持在33℃~36℃ 之間,每個游泳池隨機分配5只大鼠。正式訓練前運動組大鼠進行3天適應性游泳訓練,3天的運動時間每天分別為15min、20min、30min。隨后開始正式的游泳運動訓練,每天游2次,每次150 min,中間休息120 min,共6周。訓練結束后吹干毛發,返回鼠籠。

  1.3 取材

  最后一次游泳后,持續組大鼠按運動后即刻、30min、60min、120min、240min五個時段分別依次取材,操作如下:大鼠腹腔2%戊巴比妥鈉麻醉(40mg/kg),斷頭,冰上取腦,置于-80℃液氮冷藏。對照組操作同上。

  從液氮取出大鼠腦組織,復溫至常溫。根據大鼠立體定向圖譜, 分離腦組織切取大鼠海馬組織約50~100mg,置于離心管,按10mg:200μl比例加入0.01M PBS液,用超聲波細胞粉碎機將其制成乳白色懸液,12000r/min離心10min,取上清液放入-4℃冰箱保存備用。

  1.4 cAMP含量的測定

  cAMP濃度的測定均采用雙抗體酶聯免疫吸附法(Enzymes linked immunosorbant assays,ELISA法),大鼠環磷腺苷cAMP ELISA試劑盒購自美國R·B公司,均嚴格按說明書進行操作。檢測儀器采用Benchmark酶標儀(BIO-RAD公司)。

  具體操作步驟:(1)加樣:將100μl標準品、100μl標本加入相應反應板孔中;(2)輕輕混勻30s,封住板孔,37℃溫育90min;(3)洗板:甩盡板內液體,用洗滌液洗滌反應板(每孔內加入350μl洗滌液),并去除水滴(在厚疊吸水紙上拍干);反復洗滌5次;(4)每孔加入100μl 1×Biotin。輕輕混勻30s,封住板孔,37℃溫育60min;(5)洗板:甩盡板內液體,用洗滌液洗滌反應板(每孔內加入350μl洗滌液),并去除水滴(在厚疊吸水紙上拍干);反復洗滌5次;(6)每孔加入100μl 1×HRP。輕輕混勻30s,封住板孔,37℃溫育30min;(7)洗板:甩盡板內液體,用洗滌液洗滌反應板(每孔內加入350μl洗滌液),并去除水滴(在厚疊吸水紙上拍干);反復洗滌5次;(8)每孔加入50μl顯色劑A和50μl顯色液B, 輕輕混勻10s,37℃暗處溫育(15±10)min;(9)每孔加入100μl 終止液(Stop Solution)。輕輕混勻30s;30min內在450nm處讀OD值。(10)以OD值為縱坐標,以標準品濃度為橫坐標,繪制標準曲線。并根據樣本的OD值查出其濃度。或用回歸方程計算其濃度。

  1.5 統計學方法

  采用SPSS12.0軟件對實驗數據進行統計處理。所有數據均用平均數±標準差(x±s)表示,組間比較采用t檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

  2 實驗結果

  2.1 大鼠海馬在5個不同時刻cAMP濃度變化

  見表1。根據統計學處理結果顯示(表1):運動后cAMP的濃度先下降后升高在30min達到峰值隨后又下降。大鼠海馬cAMP濃度在即刻、120min、240min有所下降,與對照組相比差異有顯著性(P<0.05);運動后60min大鼠海馬cAMP濃度達到最低值(P<0.01);運動后30 min大鼠海馬cAMP濃度達到峰值,與對照組相比差異無顯著性(P>0.05)。表1 大鼠海馬在5個不同時刻cAMP濃度變化

  2.2 大鼠海馬cAMP在不同時刻表達的時效性

  見圖1。從圖1來看,運動后,海馬cAMP濃度隨時間呈波浪式的變化,30 min組上升幅度較大,隨后快速下降,120min、240min變化幅度逐漸趨于平緩。圖1 大鼠海馬cAMP在不同時刻表達的時效性

  3 討論

  cAMP 是細胞內第二信使,參與學習和記憶過程。在生理狀態下,神經細胞中cAMP 由三磷酸腺苷(ATP)經腺苷環化酶(AC)催化生成,由磷酸二酯酶(PDE)降解,二者的功能狀態維持神經細胞cAMP 水平穩定。疾病、運動、藥物等多種刺激因素均可引起神經細胞內cAMP濃度發生改變繼而引發后續各種反應。cAMP對學習記憶在內的絕大多數生理功能的作用是通過激活PKA實現的。Byers 等的研究表明,細胞內cAMP 濃度的適當增加可激活PKA,而cAMP 的過量增加和減少都造成學習記憶能力下降。因此,cAMP可能在記憶鞏固的后期階段有著重要作用:一方面能夠直接激活PKA(少數情況下能激活PKG);另一方面能夠通過小分子量G結合蛋白或經環核苷酸門控的離子通道介導鈣離子的流動,而發揮重要的信號傳遞功能。

  運動作為典型的應激源,對cAMP濃度具有顯著性影響,主要涉及血漿、肝臟、海馬、心臟等方面。羅艷蕊等[7]研究表明8周游泳訓練導致心臟代償性肥大,cAMP/cGMP比值減小。黃元汛、張鈞[8]研究發現,力竭運動使大鼠心肌中cAMP和cGMP均明顯高于對照組,說明力竭運動可造成心肌中cAMP 和cGMP含量明顯升高。Zimmer[9]在實驗性壓力超負荷動物模型的研究發現,壓力超負荷與心肌cAMP和心肌肥厚顯著正相關;壓力超負荷誘導了心肌cAMP濃度上升,同時cGMP濃度下降,cAMP/cGMP比值增大,推測環核苷酸系統(cAMP/cGMP)可能介導了壓力超負荷導致心肌肥大的反應。同時心肌組織cAMP含量于術后0.5h 明顯增加,術后5天時達峰值,術后30天降至正常。李衛平等[10]實驗表明:服用抗氧化劑對耐力運動組和間歇運動組恢復期的心肌cAMP濃度具有一定的影響,而對這兩組恢復期的心肌cGMP濃度則并無顯著性作用;運動方式和抗氧化劑是影響心肌cAMP、cGMP濃度變化的主要因素。徐松德等[11]將34只家兔隨機分為對照、運動和不運動三組, 后兩組每只家兔喂膽固醇200mg/d, 試驗4周后。結果表明運動組動脈壁cAMP水平增加19.2%, 不運動組則降低49.4%;肝臟cAMP含量運動組與不運動組分別降低21.2%和15.7%, 血漿cAMP濃度運動組與不運動組分別升高0.95%和6.8%。王澤軍等[12]研究表明游泳訓練可以使大鼠海馬cAMP濃度分別發生了顯著的升高。Bernabeu[13]在實驗中發現大鼠海馬cGMP水平在訓練后即刻達峰值,相反cAMP水平在3h后才達峰值,說明運動對cAMP濃度的影響具有時效性。

  本文把持續有氧運動作為應激源對大鼠進行實驗研究,有氧訓練具有強度低、有節奏、持續時間較長的特點。研究顯示:與對照組相比,運動組大鼠海馬cAMP的濃度發生了顯著的變化。運動后cAMP的濃度先下降后升高,在30min達到峰值隨后又下降。大鼠海馬cAMP濃度在即刻、120min、240min有所下降,與對照組相比差異有顯著性(P<0.05);運動后60min大鼠海馬cAMP濃度達到最低值(P<0.01);運動后30 min大鼠海馬cAMP濃度達到峰值,與對照組相比差異無顯著性(P>0.05)。 原因可能是:cAMP主要是神經遞質和激素的后續產物,可能與運動時交感神經興奮釋放去甲腎上腺素有關,其含量隨神經遞質和激素變化而變化,cAMP 水平維持可能更多地依賴于神經遞質和激素的釋放,所以cAMP 水平在運動時一過性升高。而持續有氧運動進行的則屬系統訓練;這可能是因為適宜的有氧運動由于其運動強度低,持續時間較短。因此對機體的影響作用是一個長期的效應,而學習記憶是大腦的高級功能,涉及腦部多個功能核團及腦區及其遞質調質系統的功能活動,適宜而有益的刺激很難在短時間顯示其影響效應的緣故。海馬cAMP濃度的變化,可能與運動方式以及腦區位置等因素有關。本實驗可對腦疾病提供一定的參考價值,對腦健康有重要意義。但其具體的機制還不清楚,有待進一步研究。

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  8 黃元汛,張鈞.牛磺酸對大鼠力竭運動時第二信使及心肌線粒體中鈣離子含量變化的影響.中國運動醫學雜志,1999,18(2):130-133.

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  10 李衛平,陳峰,吳正平. 不同運動方式和抗氧化劑對大鼠心肌cAMP 、cGMP 代謝的影響.武漢體育學院學報,2008,42(5):85-87.

  11 徐松德,吳湘云.運動對喂膽固醇家兔血漿動脈壁及肝臟水平的影響.山東醫學院學報,1985,23(2):40-43.

  12 王澤軍.游泳訓練對大鼠空間學習記憶力和腦內NO/·OH-cGMP、cAMP的影響.上海:華東師范大學,2006.

  13 Bernabeu R,Bevilaqua L,Ardenghi P,et al.Involvement of hippocampal cAMP/Camp-dependent protein kinase signaling pathways in a late memory consolidation phase of aversively motivated Learning in rat.Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 94:7041-7046.

  


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