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白花蛇舌草載藥血清對類風濕關節炎滑膜細胞增殖的影響

來源:中華醫學研究雜志 作者:楊 科1,白人驍2,邢國勝2,趙文君2作者單位:1 30007 2013-2-26

摘要: 【摘要】 目的 研究白花蛇舌草(hedyotic diffusa,HD)載藥血清對類風濕關節炎(RA)滑膜細胞增生的影響。方法 采用噻唑藍(MTT)比色法檢測HDD載藥血清對RA滑膜細胞的增生水平。結果 加入不同濃度HDD載藥血清(1。25~5mol/L)培養RA滑膜細胞后,RA滑膜細胞的增生較未處理組受到抑制,且有一定的劑量和時間依賴性。...


【摘要】  目的 研究白花蛇舌草(hedyotic diffusa,HD)載藥血清對類風濕關節炎(RA)滑膜細胞增生的影響。方法 采用噻唑藍(MTT)比色法檢測HDD載藥血清對RA滑膜細胞的增生水平。結果 加入不同濃度HDD載藥血清(1.25~5mol/L)培養RA滑膜細胞后,RA滑膜細胞的增生較未處理組受到抑制,且有一定的劑量和時間依賴性。結論 HDD載藥血清可抑制類風濕關節炎滑膜細胞增生。

【關鍵詞】  白花蛇舌草載藥血清;類風濕關節炎;細胞增生;滑膜

  【Abstract】 Objective To investigate the effect of serum hedyotic diffusa decoction(HDD) on proliferation of synoviocytes in patiens with rheumatoid arthritis.Methods The level of cell proliferation of synoviocytes with serum hedyotic diffusa decoction(HDD) in patiens with rheumatoid arthritis were measured by monotetrazolium(MTT)colourmetric assay.Results Level of cell proliferation of serum hedyotic diffusa decoction-treated(1.25~5mol/L,HDD)was significantly decreased compared with corresponding non-treated group(P<0.01).Level of cell proliferation of serum hedyotic diffusa decoction-treated was dependent on certain dose and time.Conclusion Serum hedyotic diffusa decoction(HDD) can inhibite proliferation of synoviocytes in rheumatoid arthritis.

  【Key words】 serum hedyotic diffusa decoction(HDD);rheumatoid arthritis;cell proliferation; synovial membrane

  類風濕性關節炎(RA)是一種主要累及小關節的慢性自身免疫性疾病。主要表現為對稱性的多關節的腫脹、疼痛、晨僵,體重減輕以及全身多系統的受累。RA的特征性改變為滑膜廣泛增生,滑膜細胞數量明顯增加并分泌大量細胞因子。主要病理特點是滑膜細胞增生,襯里層增厚,多種炎性細胞浸潤,血管翳形成以及軟骨和骨組織的破壞,最終導致關節畸形和功能喪失[1]。白花蛇舌草(hedyotic diffusa,HD)為茜草科耳草屬植物,味苦、甘,性寒,歸胃、肺、大腸、膀胱經,具有清熱解毒、消癰散結、利尿除濕、活血止痛的功效。

  白花蛇舌草臨床作用廣泛,包括調節免疫作用,抗腫瘤作用,抗菌作用,抗化學誘變作用,保肝利膽調節胃腸作用,增強腎上腺皮質功能,并有鎮痛、鎮靜、催眠作用[2],多用于闌尾炎、肝炎、附件炎等的治療[3,4];外用治瘡癤癰腫、毒蛇咬傷,現代研究將HD多用于惡性腫瘤的治療和研究[5~11]。祖國醫學以白花蛇舌草為主方治療類風濕關節炎(RA)取得良好療效[12~15]。RA滑膜組織表現的生長及病理學行為在許多方面類似于腫瘤組織的特性,但HD是否對RA有治療作用,尚無報道。本實驗用不同濃度的HDD載藥血清處理原代培養的RA滑膜細胞,通過觀察HDD載藥血清對RA滑膜細胞增殖的影響,進一步研究其作用機制,探討其治療RA的可能性。為探索類風濕關節炎新的藥物治療提供理論基礎。

  1 材料與載藥血清

  1.1 實驗材料

  滑膜標本來自天津市天津醫院風濕科和關節科2010年9月—2011年5月確診RA膝關節、髖關節置換病人。RA病人診斷符合美國風濕病學會(American College of Rheumatology,ACR)1987年修訂的分類標準。

  1.2 主要設備和試劑

  CO2培養箱(GALAXY,英國)、離心機(BECKMAN、美國)、倒置相差顯微鏡(OLYMPUS,日本)、酶標儀(Dynex MRX II型,美國)、96孔培養板(CORNNING,美國);D-MEM(Gibco,批號:6721953)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(中國醫學科學院血研所科技公司,批號:200612)、Hank’s液(天津醫院中心實驗室自制)、胰蛋白酶(天津市灝洋生物制品有限責任公司)、MTT(Sigma 070612)、甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司,批號:09096-09100)、白花蛇舌草(天津市中藥飲片廠,產地:江西)。

  1.3 白花蛇舌草載藥血清

  參考文獻對膠原誘導性關節炎造模大鼠以HD分別5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml的濃度每天1次1ml灌胃,3周后處理獲得血清,過濾除菌備用。

  2 實驗方法

  2.1 細胞培養

  將關節置換病人滑膜標本用Hank’s液清洗3次,培養皿中用眼科剪剪至大小約1mm3后轉移至50ml離心管,加入Ⅱ型膠原酶震蕩儀消化1h,200目金屬濾網過濾,1000r/min離心10min,棄上清。用含5%FBS、青霉素、鏈霉素雙抗的D-MEM培養液置于37℃、5%CO2培養箱中培養,2~3天換液1次,選對數生長的細胞進行實驗。

  2.2 配液

  各濃度組分別配制10%HDD載藥血清的培養液;甲氨蝶呤(MTX)濃度為2.0mmol/L。

  2.3 MTT檢測實驗步驟

  (1)0.25%胰蛋白酶消化滑膜細胞,計數板計數調整細胞濃度為5×104/ml。(2)將滑膜細胞懸液接種于2塊96孔培養板中,每孔100μl。37℃、5%CO2培養箱中培養24h使細胞貼壁。(3)24h后倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁狀態,吸棄舊培養液,加入10%HDD培養液,100μl/孔,每組設5個復孔,同時設置對照孔(加入等體積的培養基)、MTX組100μl/孔;(4)分別于48、96h后,倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態。并分別于各時間段后每孔加入MTT(5mg/ml)20μl,37℃、5%CO2培養箱中孵育4h;(5)孵育結束棄上清液,各孔加入150μl的DMSO置微量振蕩儀震蕩10min使結晶充分溶解;(6)各時間段酶標儀測OD值(λ=490 nm),記錄結果。

  2.4 統計學處理

  全部數據采用x±s表示,SPSS13.0統計軟件進行統計學分析,單因素方差分析(one-way ANOVA)組間比較,LSD(least significant difference)兩兩比較,P<0.05為差異有統計學意義。抑制率=(對照組-藥物組)÷對照組。

  3 實驗結果

  見表1,表2。表1 HDD載藥血清作用48h后對RA滑膜細胞增殖的影響表2 HDD載藥血清作用96h后對RA滑膜細胞增殖的影響

  4 討論

  類風濕性關節炎是一種復雜、多系統以關節的炎癥損害為主要特點的自身免疫性疾病。而滑膜組織的大量增生是RA發病的一個顯著特點。現代研究將HD多用于惡性腫瘤的治療和研究,RA滑膜組織表現的生長及病理學行為在許多方面類似于腫瘤組織的特性,但HD是否對RA有治療作用,尚無報道。本實驗用不同濃度的HDD載藥血清處理原代培養的RA滑膜細胞,通過觀察HDD載藥血清對RA滑膜細胞增殖的影響,觀察到HD具有抑制RA滑膜細胞增殖的作用(P<0.05),且有一定的劑量和時間依賴性,為進一步研究其作用機制,探討其治療RA的可能性提供理論基礎。

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