摘要: 【摘要】 目的探討核轉錄因子κB-p65(nuclear factor-κB-p65，NF-κB-p65)、CD15S蛋白在非小細胞肺癌(NSCLC)組織中的表達及其與浸潤、轉移的關系，探索非小細胞肺癌發生、發展的機制。方法收集手術切除的70例NSCLC及15例癌旁正常組織標本，RT-PCR方法檢測NSCLC及癌旁組織中NF-κB-p65mRNA的表達，免疫組織化學法檢......
【摘要】 目的探討核轉錄因子κB-p65(nuclear factor-κB-p65，NF-κB-p65)、CD15S蛋白在非小細胞肺癌(NSCLC)組織中的表達及其與浸潤、轉移的關系，探索非小細胞肺癌發生、發展的機制。方法收集手術切除的70例NSCLC及15例癌旁正常組織標本，RT-PCR方法檢測NSCLC及癌旁組織中NF-κB-p65mRNA的表達，免疫組織化學法檢測組織中CD15S蛋白表達情況。結果NF-κB-p65 mRNA在NSCLC的表達顯著高于癌旁正常肺組織(P<0.05)。其中腺癌組織表達高于鱗癌組織表達，比較差異有顯著性(P<0.05)。在70例肺癌組織中CD15S蛋白的表達陽性率為64.3%，15例癌旁正常肺組織CD15S蛋白的表達為陰性，CD15S蛋白表達在NSCLC和癌旁組織比較差異均有顯著性(P<0.05)。NF-κB-p65mRNA、CD15S蛋白的表達與組織學類型、分化程度、TNM分期和淋巴結轉移有關，單因素方差分析發現NF-κB-p65mRNA表達和CD15S蛋白表達相關。結論NSCLC中NF-κB-p65和CD15S蛋白的表達有相關關系，NF-κB-p65和CD15S可能在NSCLC浸潤、轉移過程起促進作用。
【關鍵詞】 肺癌;NF-κB-p65;CD15S;轉移
【Abstract】ObjectiveTo investigate expression of nuclear factor(NF)-κB-p65 and CD15S in lung cancer tissues, and to explore its relationship between the expression and tumor cell metastasis and infiltration and tumor apoptosis,and to explore the possible molecular mechanism of lung cancer cell metastasis and infiltration.Methods70 samples of lung cancer tissues and 15 normal lung tissues after surgical ablation were collected.RT-PCR method was used to detect the expression of NF-κB-p65mRNA in lung cancer tissues and lung tissues around tumor. Cell apoptosis index in tissues was detected by the TUNEL method.The expression of CD15S was detected in these tissues with Immunohistochemistry.ResultsThe expression of NF-κB-p65mRNA in lung cancer tissues was significantly higher than that in lung tissues around tumor.The expression of NF-κB-p65 mRNA in adencarcinoma tissues was higher than that in small cell lung cancer and squamous carcinoma tissues,the expression of three groups had significantly difference(P<0.05). Cell apoptotic index in lung cancer tissues was significantly lower than that in lung tissues around tumor(P<0.05), by correlation analysis the expression of NF-κB-p65mRNA was negative correlated with apoptotic index in lung cancer tissues. The positive rate of CD15S was 64.3%, but the expression of CD15S in 15 cases of lung tissues around tumor was negative. The difference of expression in the two groups was statisitically significant(P<0.05). The expression of the NF-κB-p65 mRNA and CD15S protein was associated with the tumor cell differentiation,the lymph node metastasis, TNM staging and pathological typing.ConclusionThe expression of NF-κB-p65 and CD15S in lung cancer tissues showed correlativity, NF-κB-p65 and CD15S may facilitate lung cancer cell metastasis and infiltration; NF-κB-p65 mRNA was negative correlated with apoptotic index in lung cancer tissues.NF-κB-p65 may enhance lung cancer cell differentiation and proliferation,and play a antiapoptotic role in lung cancer.
【Key words】lung cancer;NF-κB-p65;CD15S;metastasis
21世紀以來，我國肺癌的發病率和死亡率在惡性腫瘤中已經上升為第一位[1]。目前肺癌治療的療效欠佳，故進一步研究肺癌發生發展的機制，從而制訂有效的治療方案是相當重要的。核因子κB (NF-κB)是目前肺癌研究的熱點，NF-κB可能通過抗凋亡和增強黏附分子的表達，促進腫瘤細胞的生長和在血管壁上黏附[2]。CD15S蛋白(Slex稱為唾液酸化的路易斯-X，Sialyl Lewis-X)是表達在細胞表面糖脂及糖蛋白上的含有寡聚糖的一組碳水化合物抗原，與惡性腫瘤的惡化和轉移有關。Dissanayake S等研究發現在幼稚的脾細胞中，NF-κB-p65增強CD15S的表達，而后者在腹腔炎性滲出細胞中促進干擾素-γ的表達[3]。而目前對NF-κB和CD15S蛋白在肺癌組織、癌旁組織中表達研究較少。本研究檢測NF-κB-p65mRNA及CD15S蛋白在肺癌組織、癌旁組織的表達，探討其與肺癌浸潤、轉移和肺癌組織細胞凋亡的關系。
1材料與方法
1.1研究對象取自瀘州醫學院附屬醫院從2008年12月至2010年6月的心胸外科手術切除的肺癌組織標本，入選研究的肺癌病例滿足以下標準：(1)術前均未接受過化療、免疫治療或放療;(2)未使用任何抗炎藥物;(3)無慢性心肝腎及內分泌疾病，共70例，其中鱗癌33例，腺癌24例，小細胞癌13例，男性45例， 女性25例;年齡最大80歲，最小35歲，平均60歲。手術中取肺癌組織及相應的癌旁正常組織15例(自所切除肺葉距離病灶最遠處5cm的正常組織，分別來源于鱗癌7例，腺癌5例，小細胞癌3例 )，組織離體后在1 h內放入液氮速凍，置-80℃冰箱保存。病理組織切片HE染色由2位有經驗的臨床病理學專家閱片作出病理診斷。
1.2試劑Rever Tre Ace-a-逆轉錄試劑盒購自日本TOYOBO公司，Trizol試劑購自美國 Invitrogen公司，Taq酶購自上海生工生物工程技術服務有限公司，PCR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，CD15S鼠抗人單克隆抗體、原位細胞凋亡檢測試劑盒、PV-8000免疫組化試劑盒及D A B顯色試劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。PCR System 9700(Applied Biosystems, Int.,USA)。
1.3方法
1.3.1RT-PCRTrizol裂解100mg新鮮非小細胞肺癌組織，氯仿和異丙醇抽提細胞總RNA。MMLV轉錄酶將1μg RNA逆轉錄成cDNA。隨后PCR檢測NF-κB-p65 m R N A的表達。NF-KB-p65上游引物:5′CAAGCGAGGAGGGGACGTG 3′ ,下游引物：5′CCCCCAGAGCCTCCACCC 3′，以GAPDH為內參照，其上游引物：5′TGGGGTGATGCTGGTGCTGAGT3′，下游引物：5′AGGTTTCTCCAGGCGGCATGTC 3′。PCR反應條件94℃—5min→(94℃—30s→60℃—30s→72℃—30s)×30循環→72℃—10min，電泳：100ml TAE緩沖液中加入1g瓊脂糖，微波爐中加熱溶解，溶解后冷至60℃，加入5μl EB染料，倒入已插入梳子的制膠槽中，待其冷卻凝固后待用。紫外光下觀察并照相， 測定各條帶A值。以同一管中NF-KB-p65和GAPDH產物條帶A值之比作為數據分析， 反映NF-KB-p65 mRNA表達水平。
1.3.2免疫組織化學染色用石蠟切片脫蠟和水化后，0.01MKPBS清洗5min×3;加入配好的0.3%的過氧化氫甲醇溶液30min，0.01MPBS清洗5min×3;加入配好的0.3% TritonX100 30min，0.01MPBS清洗5min×3;加入用血清稀釋液稀釋的一抗CD15S，4℃存放24~48h;吸去抗體，0.01MPBS洗5min×3;PBS代替一抗作為陰性對照。加入0.01MKBS稀釋的PV-8000中的二抗-HRP多聚體，室溫孵育2h。蒸餾水迅速沖3次;加入顯色液，進行免疫組織化學顯色，20min，可不時在顯微鏡下進行觀察，待細胞著色而背底顏色較淡時馬上吸去顯色液，用蒸餾水迅速沖3次后加入0.01MPBS終止反應;梯度酒精脫水之后，封片，拍照。CD15S陽性信號為細胞胞膜和/或細胞胞質內出現棕黃色或棕褐色染色顆粒。凡無陽性染色細胞或陽性染色細胞數<5%者為陰性，陽性染色細胞≥5%者為陽性。
1.4統計學方法數據使用SPSS-17.0統計軟件分析，NF-κB-p65mRNA表達水平及肺癌組織的細胞凋亡指數的數值以〖x〗±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗，15例癌旁組織和相應的癌癥組織的結果采用配對統計檢驗。對CD15S蛋白數據進行χ2檢驗，參數之間關系采用Pearson相關分析，P<0.05為差異有統計學意義。
2結果
2.1NF-κB-p65mRNA在肺癌組織和癌旁組織中的表達NF-κB-p65 mRNA在肺癌組織中的表達(見表1，圖1)：NF-κB-p65 mRNA的表達在腺癌組織較強，小細胞癌組織表達次之，鱗癌組織表達較弱，三組表達的比較差異有顯著性(P<0.05)。NF-κB-p65基因mRNA的表達與組織學類型、淋巴結轉移、分化程度、TNM分期有關，與年齡、性別無關。15例癌組織和相應癌旁組織的NF-κB-p65 mRNA的表達比較差異有顯著性(F值4.86，P<0.05)。
2.2CD15S蛋白在肺癌組織和癌旁組織中的表達70例肺癌組織中有45例CD15S表達陽性，表達陽性率為64.3%，15例癌旁正常肺組織CD15S的表達均為陰性(見表2，圖2)，肺癌組織中CD15S表達陽性率顯著高于癌旁正常肺組織(P<0.05)。CD15S在腺癌的表達陽性率為90.5%(19/21)，顯著高于小細胞癌25.0%(3/12)，CD15S在鱗癌的表達陽性率為51.9%(14/27)，和小細胞肺癌無顯著差異。CD15S表達陽性率與肺癌組織分化程度、淋巴結轉移、組織學類型、TNM分期有關，與肺癌組織年齡、性別無關。表1NF-κB-p65 mRNA的表達與肺癌臨床和病理學特征的關系圖1肺癌組織和癌旁組織中NF-κB-p65 mRNA的表達表2CD15S的表達與肺癌臨床和病理學特征的關系
2.3肺癌組織中CD15S蛋白陽性和陰性兩組NF-κB-p65mRNA表達比較見表3。肺癌組織CD15S蛋白陽性和陰性兩組中NF-κB-p65mRNA表達比較差異有顯著性，CD15S蛋白陽性高于陰性組，提示CD15S和NF-κB-p65相關。表3肺癌組織中CD15S蛋白表達陽性組和陰性組 NF-κB-p65mRNA表達的比較
2.4肺癌組織及癌旁組織中的細胞凋亡指數比較見表4。在肺癌組織中小細胞癌的細胞凋亡指數較小，和鱗癌、腺癌的細胞凋亡指數差異有顯著性，鱗癌和腺癌的細胞凋亡指數差異無顯著性。15例癌組織和相應癌旁組織的細胞凋亡指數的表達比較差異有顯著性(F值4.86，P<0.05)。表4肺癌組織和癌旁組織中細胞凋亡指數情況
2.5肺癌組織中NF-κB-p65 mRNA的表達和其細胞凋亡指數Pearson相關性分析在肺癌組織中NF-κB-p65 mRNA表達量為0.43±0.10，肺癌組織的細胞凋亡指數為(5.40±0.72)%，NF-κB-p65 mRNA表達水平和肺癌組織的細胞凋亡指數呈負相關，相關系數為-0.532，P<0.001。
3討論
NF-κB是一種具有多向調節功能的轉錄因子，通常以同源或異源二聚體形式出現，其中以 p50/p65分布和作用最廣泛。NF-κB在多種惡性腫瘤包括乳腺癌、結腸癌、肺癌呈現高表達，提示NF-κB和肺癌的發生、發展及預后均有一定的關系[4~6]。CD15S蛋白是表達在胚胎細胞和腫瘤細胞表面糖蛋白、糖脂上含寡聚糖的一組碳水化合物抗原，是細胞黏附分子E-選擇素識別的配體[7]。有研究發現在膽囊癌、口腔鱗狀細胞癌、肺癌、肝癌組織中CD15S蛋白的表達是增強的，并且和癌細胞的遠處轉移有關[8~11]。而在腫瘤細胞內呈高表達的CD15S可誘導血管內皮細胞產生E-選擇素，在鈣離子的參與下兩者特異性結合后形成穩固連接并黏附內皮細胞上，促進腫瘤細胞穿出血管或淋巴管內皮細胞，進入血液循環或淋巴循環，從而在靶器官浸潤、轉移[12]。 目前發現E-選擇素基因轉錄的啟動子可能存在NF-κB結合的位點，NF-κB和位點結合后，促進E-選擇素基因轉錄，調控E-選擇素表達水平[13]。Grünewald JK等在研究內皮細胞時，發現NF-κB可調控E-選擇素和胞間黏附分子、血管細胞黏附分子-1的表達[14]。CD15S是E-選擇素特異性識別的配體，故NF-κB和CD15S可能在腫瘤的發生、發展過程存在某些聯系。在本研究中同時檢測了NF-κB-p65mRNA、CD15S蛋白在肺癌組織和癌旁組織中的表達(見表1、表2，圖1、圖2)，NF-κB-p65mRNA、CD15S蛋白在肺癌組織中表達均顯著高于相應癌旁組織，NF-κB-p65mRNA、CD15S蛋白的表達在低分化組、淋巴結轉移組和TNM高分期組分別顯著高于高分化組、無淋巴結轉移組和TNM低分期組中，提示NF-κB-p65mRNA、CD15S參與了肺癌的浸潤、轉移過程，臨床上可以把NF-κB-p65mRNA、CD15S作為肺癌的診斷指標，對病例指標的定期隨訪可以作為肺癌的早期診斷及早期發現肺內轉移病灶。在肺癌的病理類型中，腺癌組織的NF-κB-p65mRNA、CD15S蛋白表達較強，可能和腺癌組織富含血管，局部浸潤和血行轉移較早有關。進一步分析發現NF-κB-p65的表達和CD15S在肺癌組織中的表達有相關關系，推測NF-κB可以通過一定途徑調控CD15S的表達，NF-κB和CD15S可能共同參與了肺癌的發生、發展，其作用機制還有待進一步研究。肺癌浸潤轉移的過程是一個復雜的過程，其中凋亡機制失控占重要地位，一旦凋亡機制被抑制，就會出現細胞壽命的延長及細胞的過度累積。Wang S等發現NF-κB活化后可以誘導惡性腫瘤細胞產生抗凋亡蛋白的表達，并且減少凋亡相關蛋白的表達量，提示NF-κB在惡性腫瘤進程中起抗凋亡作用[15]。在本次研究中檢測發現肺癌組織的細胞凋亡指數顯著低于癌旁正常肺組織，并且發現NF-κB p65 mRNA表達水平和肺癌組織的細胞凋亡指數呈負相關，提示NF-κB促進肺癌細胞的分化、增殖，發揮抗凋亡作用。這也許可作為肺癌靶向治療的一個位點，為我們臨床治療提供新的方法。在肺癌組織中小細胞癌組織的細胞凋亡指數較小，分析小細胞癌組織的細胞凋亡指數最小的原因可能和小細胞癌惡性程度高、細胞分化差有關。總之，本次試驗通過研究肺癌組織標本中NF-κB-p65mRNA和CD15S蛋白表達及與肺癌浸潤、轉移、凋亡的關系，分析NF-κB-p65和CD15S蛋白在肺癌發生、浸潤、轉移中的作用和關系及NF-κB-p65和肺癌細胞凋亡指數關系，為探索肺癌發生、發展機制，尋找治療新途徑提供一定的理論依據。
(本文彩圖見封三)
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