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游泳耐力訓練對大鼠杏仁核cAMP值影響的實驗研究*

來源:中華醫學研究雜志 作者:張安民,李英,燕虹,胡淑萍作者單位:030006 山西太 2013-2-26

摘要: 【摘要】 目的觀察游泳耐力訓練后大鼠杏仁核cAMP濃度變化。方法將30只雄性SD大鼠隨機分為對照組、耐力訓練組。建立大鼠游泳耐力訓練模型,用大鼠環磷酸腺苷cAMP ELISA法,檢測訓練后即刻、0。5h、1h、2h、4h大鼠杏仁核cAMP濃度變化,并用統計學軟件進行數據分析。...


【摘要】  目的觀察游泳耐力訓練后大鼠杏仁核cAMP濃度變化。方法將30只雄性SD大鼠隨機分為對照組、耐力訓練組。建立大鼠游泳耐力訓練模型,用大鼠環磷酸腺苷cAMP ELISA法,檢測訓練后即刻、0.5h、1h、2h、4h大鼠杏仁核cAMP濃度變化,并用統計學軟件進行數據分析。結果(1)耐力訓練后,除1h時cAMP濃度顯著低于對照組外(P<0.01),即刻、0.5h、2h大鼠杏仁核cAMP濃度均顯著高于對照組,且差異有顯著性(P<0.05);(2)訓練后即刻,大鼠杏仁核cAMP濃度快速升高,至0.5h時達到最高值,之后1h時cAMP濃度急劇下降,2h時其濃度回升,高于對照組水平,隨后下降至4h時略低于對照組水平,但不存在差異。整個濃度變化曲線呈鋸齒形。結論游泳耐力訓練后杏仁核cAMP濃度變化具有時相性;耐力游泳訓練可激活大鼠杏仁核環磷酸腺苷(cAMP)通路,進而影響機體的后續反應。

【關鍵詞】  杏仁核;cAMP;游泳耐力訓練

  【Abstract】ObjectiveThe purpose of this study is to analyze the effect of endurance exercise on the density of cAMP in the amygdale.MethodsThirty male SD rats were randomly divided into two groups,control group (five rats) and endurance exercise group (25 rats).To establish the endurance swimming exercise models in rat,and detect the change of the cAMP contents in amygdale at the moments of 0h,0.5h,1h,2h,4h after exercise by using the method of ELISA,then analyze the data by statistical software.ResultsThe result showed that :(1)After exercise,the cAMP contents in amygdale of rats at 0h,0.5h,2h after endurance swimming has higher level than control group(P<0.05),besides the cAMP contents of the intermittent group at 1h is lower than the control group (P<0.01);(2)In amygdale,the cAMP contents rising rapidly and reach the peak at 0.5h after swimming finished,then the cAMP contents dropped at 1h,the cAMP contents increased at 2h,the level was higher than that of control group,and then dropped,the level was still lower than that of control group at 4h after swimming finished.The change figure of cAMP contents appears the shape of sawteeth.ConclusionThere must be a phasic change in the contents of cAMP.Endurance swimming could influence the cAMP signaling pathway in amygdale of ratswith effecting the body's response.

  【Key words】amygdale; cAMP; endurance exercise

  杏仁核位于大腦顳葉背內側部,居海馬旁回鉤的深面,側腦室下角尖端,是大腦基底神經核的一個重要核團,與感覺、情緒和記憶關系密切。在整合和控制情緒,調節自主行為方面具有重要作用。杏仁核參與獲取和儲存有關記憶的活動,通過此記憶,動物可以識別和分析一個刺激的生物意義,然后將產生的信息傳到腦干執行系統。環腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate ,cAMP) 是中樞神經系統中重要的第二信使,可介導多種細胞內激素,神經遞質及其他信號分子,在細胞代謝及多種生理效應的實現中具有關鍵的作用[1,2]。依據課題前期研究及有關專家研究表明:多種應激均可引起腦神經cAMP表達增強并誘導機體后續反應[3~11]。因此,觀察游泳耐力訓練對大鼠杏仁核cAMP濃度的影響,對于了解運動應激引起的機體反應過程及其機制具有重要的意義。同時,也為運動在維持腦健康功能與合理調配運動處方提供更多的實驗數據和參考。

  1材料與方法

  1.1實驗動物與分組實驗動物:SD成年雄性大鼠30只,鼠齡3個月,體重250~300g,由山西醫科大學動物實驗中心提供。飼養條件:分籠飼養,每籠4只,自由飲食,自然晝夜節律光照,室溫(20±5)℃。相對濕度在40%~60%。隨機分為對照組(n=5只)和持續組(n=25只)。

  1.2實驗所需儀器標準化學實驗臺和常規儀器設備,低溫冰柜,高速離心機,液氮冷藏桶,恒溫干燥箱,JY92-2D超聲波細胞粉碎機,Benchmark酶標儀,10~200μl和可調多通道(8)移液器(50~200μl)lL洗瓶,1L圓形量筒,移液器槍頭,紙巾,計時器,處理器和消毒劑,試劑存放槽。所需試劑:大鼠環磷腺苷cAMP ELISA試劑,去離子水(雙蒸水),0.01%PBS液,2%戊巴比妥鈉。

  1.3訓練造模采用游泳訓練方式。游泳條件:塑鋼游泳池,150cm×60cm×70cm,水深為大鼠身體長度的2倍,水溫保持在33℃~36℃之間。正式訓練前,大鼠進行3天適應性游泳訓練,每天1次,時間依次分別15min、20min、30min。隨后開始正式游泳訓練6周。每天游2次,每次150min,中間休息120min。對照組:不進行任何訓練,常規飼養。

  1.4取材最后一次游泳后,游泳組大鼠按訓練后即刻、0.5h、1h、2h、4h五個時段分別依次取材,操作如下:大鼠腹腔2%戊巴比妥鈉麻醉(40mg/kg),斷頭,冰上取腦,置于-80℃液氮冷藏。對照組操作同上。從液氮取出大鼠腦組織,復溫至常溫。根據大鼠立體定向圖譜,分離腦組織切取大鼠杏仁核組織約50~100mg,置于離心管,按10mg:200μl比例加入0.01M PBS液,用超聲波細胞粉碎機將其制成乳白色懸液,12000r/min離心10min,取上清液放入-4℃冰箱保存備用。

  1.5測定方法cAMP濃度的測定均采用雙抗體酶聯免疫吸附法(Enzymes linked immuno sorbant assays,ELISA法),大鼠環磷腺苷cAMP ELISA試劑盒購自美國R·B公司,均嚴格按說明書進行操作。檢測儀器采用Benchmark酶標儀(BIO-RAD公司)。具體操作步驟:(1)加樣:將100μl標準品、100μl標本加入相應反應板孔中;(2)輕輕混勻30s,封住板孔,37℃溫育90min;(3)洗板:甩盡板內液體,用洗滌液洗滌反應板(每孔內加入350μl洗滌液),并去除水滴(在厚疊吸水紙上拍干);反復洗滌5次;(4)每孔加入100μl 1×Biotin。輕輕混勻30s,封住板孔,37℃溫育60min;(5)洗板:甩盡板內液體,用洗滌液洗滌反應板(每孔內加入350μl洗滌液),并去除水滴(在厚疊吸水紙上拍干);反復洗滌5次;(6)每孔加入100μl 1×HRP。輕輕混勻30s,封住板孔,37℃溫育30min;(7)洗板:甩盡板內液體,用洗滌液洗滌反應板(每孔內加入350μl洗滌液),并去除水滴(在厚疊吸水紙上拍干);反復洗滌5次;(8)每孔加入50μl顯色劑A和50μl顯色液B,輕輕混勻10s,37℃暗處溫育(15±10)min;(9)每孔加入100μl終止液(Stop Solution)。輕輕混勻30s;30min內在450nm處讀OD值。(10)以OD值為縱坐標,以標準品濃度為橫坐標,繪制標準曲線。并根據樣本的OD值查出其濃度。或用回歸方程計算其濃度。

  1.6統計學方法采用SPSS12.0軟件對實驗數據進行統計處理。所有數據均用平均數±s標準差表示,組間比較采用方差分析,檢驗水準α=0.05。

  2實驗結果

  2.1游泳耐力訓練后對大鼠體重的影響結果顯示,游泳耐力訓練后對大鼠體重影響較大。在訓練前對照組大鼠體重與持續組相比差異無顯著性(P>0.05),大鼠游泳運動1周后,體重開始發生變化,對照組大鼠體重隨時間而逐漸增加,游泳組大鼠體重在第3周下降較為明顯,隨后保持穩定;游泳組大鼠體重在各時間點均低于對照組,且差異有非常顯著性(P<0.001)。

  2.2游泳耐力訓練后對大鼠杏仁核cAMP表達的影響實驗結果顯示(見表1):對照組大鼠杏仁核cAMP濃度值為(4.64±0.47)pmol/g,游泳耐力訓練后,大鼠杏仁核cAMP濃度均明顯增加,即刻組大鼠杏仁核cAMP濃度值達到(5.16±0.49)pmol/g,與對照組相比差異有顯著性(P<0.05);隨后,大鼠杏仁核cAMP濃度值快速升高,至0.5h達到峰值,與對照組相比差異有非常顯著性(P<0.01);之后1h大鼠杏仁核cAMP濃度值急劇下降,與對照組相比差異有非常顯著性(P<0.01);2h時cAMP濃度上升到(5.15±0.15)pmol/g,顯著高于對照組的水平(P<0.05);4h后,大鼠杏仁核cAMP濃度值降為(4.4±0.2)pmol/g,略低于對照組水平,但差異無顯著性(P>0.05)。從時效性來看(見圖1),游泳耐力訓練后即刻,大鼠杏仁核cAMP濃度即開始增高,至0.5h時達到最高值,隨后cAMP濃度值逐漸下降,至4h時仍高于對照組水平。整個大鼠杏仁核cAMP濃度變化曲線呈鋸齒形特征。表1游泳耐力訓練后大鼠杏仁核cAMP濃度值  圖1游泳耐力訓練后大鼠杏仁核cAMP濃度變化圖

  3討論

  cAMP是細胞內重要的“第二信使”生物活性物質,參與細胞的分化、增殖、代謝及免疫反應并起重要的調節作用。目前認為:作為細胞內信使,cAMP濃度的變化相當快,在細胞對激素的反應中,幾秒鐘內cAMP的濃度變化達5倍以上,這種快速反應的機制是通過兩種酶實現的,腺苷酸環化酶和磷酸二酯酶(cAMP)。當細胞受到外界刺激時,胞外信號分子首先與受體結合形成復合體,然后激活細胞膜上的Gs-蛋白,被激活的Gs-蛋白再激活細胞膜上的腺著酸環化酶(AC),催化ATh脫去一個焦磷酸而生成cAMP。生成的 cAMP作為第H信使通過激活APK(cAM依賴性蛋白激酶),使靶細胞蛋白磷酸化,從而調節細胞反應,cAMP最終又被磷酸二酯酶(PDE)水解成5′-AMP而失活。cAMP生成和分解過程依賴 Mg2+的存在。AC和PDE可以從兩個不同方面調節細胞內cAMP濃度,從而影響細胞、組織、器官的功能。研究表明:疾病、藥物等多種刺激因素均可引起神經細胞內cAMP濃度發生改變繼而引發后續各種反應[4~11]。

  運動作為一種特殊典型的應激源,對cAMP濃度變化有著顯著的影響[12,13]。王澤軍[12]比較與分析了長期的游泳訓練對大鼠空間學習記憶能力的影響及其與NO/·OH-cGMP與cAMP信號傳導之間的關系,結果表明訓練組大鼠海馬、前額葉皮質中cAMP濃度顯著高于對照組,存在極顯著性升高(P<0.01),證實運動可通過cAMP的作用對記憶的后期鞏固階段產生重要的作用。徐波的研究顯示,游泳訓練可引起腦內突觸前膜多巴胺、5-HT等神經遞質濃度增加,這些遞質作為細胞間傳遞信息的第一信使,作用于突觸后膜的相關受體上,引起cAMP的產生[13]。杏仁核是邊緣系統中重要的皮質下核團,其結構復雜,纖維聯系和功能十分廣泛,主要包括三個主要核群,杏仁中央核(CeA)、基底外側核群(BLA)、皮質內側核群(MeA),是參與情緒性學習認知的重要結構,是學習和記憶相關的重要腦區。杏仁中央核、基底核是各種感覺體會集的中心,它們在獲取和儲存有關記憶中發揮了重要作用。新近的研究表明,杏仁核對于理解他人內心狀態和意愿的社會性認知過程極其重要[14,15]。本文把持續有氧運動作為應激源對大鼠杏仁核進行實驗研究,研究顯示,訓練后即刻,大鼠杏仁核內cAMP濃度明顯增加,至0.5h達到峰值,與對照組相比差異有非常顯著性(P<0.01);之后1h大鼠杏仁核cAMP濃度值急劇下降,達到最低值(P<0.01);隨后回升2h時cAMP濃度上升到(5.15±0.15)pmol/g,顯著高于對照組的水平(P<0.05);4h后,大鼠杏仁核cAMP濃度值下降,與對照組相比差異無顯著性(P>0.05)。實驗結果提示:游泳耐力運動對大鼠腦杏仁核cAMP濃度的影響具有顯著性和時效性。訓練即刻、0.5h杏仁核內cAMP濃度明顯增加,表明訓練刺激引起杏仁核神經細胞興奮,突觸前神經末梢釋放遞質作用于突觸后膜上相應的受體并激活AC,在突觸后膜合成cAMP,進而激活PKA,通過膜蛋白的磷酸化改變膜對離子的通透性,從而影響杏仁核神經細胞后續生理生化反應;持續游泳訓練后大鼠杏仁核cAMP濃度變化存在一定時效性,整個cAMP濃度變化曲線呈鋸齒形,提示訓練后杏仁核內神經元細胞發生復雜的生理生化反應,其轉導通路中可能存在具有促進作用的正反饋環和抑制作用的負反饋環,對信號轉導過程進行調節。因此,游泳耐力訓練后大鼠杏仁核cAMP濃度時程變化必然是多種神經細胞信號整合的結果[16],絕非僅受單因素影響,其機理有待進一步研究探明。腦內神經細胞cAMP濃度變化可引起多種反應,不僅可改變細胞膜通透性,調制神經遞質釋放,還是一個重要的基因表達調控物質[17,18]。近年來的研究表明,cAMP可以調節和活化許多轉錄因子,包括cAMP反應元件結合蛋白 (CREB) 、 cAMP 反應元件調節子(CREM)、 NF-KB、 核受體等,其中大多涉及細胞的新陳代謝、增殖、分化、凋亡[16]。Montndny等[17]發現許多cAMP誘導轉錄的真核基因的啟動子(與RNA聚合酶結合的DNA序列,決定了精確的轉錄起始和轉錄頻率)周圍多含有一致或近乎一致的8個堿基對的回文序列5'-TGACGTCA-3′,并命名為cAMP反應序列(CRE),是這些基因識別cAMP信號的重要部位。本課題前期研究結果顯示[19]:持續游泳運動可引起大鼠杏仁核c-fos基因表達,而c-fos基因就含有cAMP反應序列CRE,表明持續游泳運動引起的cAMP濃度變化可能與c-fos基因表達緊密相關。也有研究顯示:胞內Ca2+濃度變化可通過Ca2+/CaM-PK I和II導致CREB磷酸化而激活CREB,其激活位點與PKA激活CREB位點相同。提示運動后c-fos基因表達并非受單個信號系統調控,cAMP 和Ca2+在信號傳遞上存在某種耦合現象。鈣調蛋白可能在其中起到重要調控作用[20]。游泳耐力訓練能夠引起杏仁核內cAMP濃度升高并產生后續時程變化,顯示運動刺激能夠對腦內神經中樞信號傳導產生明顯作用,反映游泳耐力訓練對腦康復和健腦益智具有一定意義。其運動后cAMP濃度時程變化特征可為制訂相應運動處方提供參考。今后應對運動因素(運動強度,運動時間,運動間歇,運動頻率等)與不同腦區cAMP濃度時程變化特征(表達峰值,表達持續時間,表達速度快慢等)之間關系以及內在機制進行深入研究,以為優化運動處方提供依據。

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