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牛胰蛋白酶抑制劑的研究進展*

來源:中華醫學研究雜志 作者:王虹蛟1,王心童2,王強1△(綜述),孟威宏3,顏煒群4( 2013-2-26

摘要: 【關鍵詞】 蛋白酶抑制劑 蛋白酶抑制劑(protease inhibitor)在蛋白質水解的調控中起重要作用。目前已發現100多種天然蛋白酶抑制劑。目前對絲氨酸蛋白酶抑制劑在其作用機制等方面都進行了系統的研究。根據絲氨酸蛋白酶抑制劑結構和活性中心又將其分為Kunitz家族、Kazal家族、STI-Kunitz家族、hirudin及Serpins[1]。...


【關鍵詞】  蛋白酶抑制劑

  蛋白酶抑制劑(protease inhibitor)在蛋白質水解的調控中起重要作用。目前已發現100多種天然蛋白酶抑制劑。目前對絲氨酸蛋白酶抑制劑在其作用機制等方面都進行了系統的研究。根據絲氨酸蛋白酶抑制劑結構和活性中心又將其分為Kunitz家族、Kazal家族、STI-Kunitz家族、hirudin及Serpins[1]。在絲氨酸蛋白酶抑制劑Kunitz家族中,均有一段保守的Kunitz結構域(Kunitz domain),其中牛胰蛋白酶抑制劑(bovine pancreatic trypsin inhibitor,BPTI)是研究得比較清楚蛋白酶抑制劑。本文復習近年來有關BPTI研究進展的國內外文獻做如下綜述。

  1 BPTI的結構

  Kunitz 家族來源廣泛,自然界的動、植物及微生物機體內都發現此類抑制劑的存在。Kunitz 家族的代表是BPTI,它是研究最早的Kunitz型蛋白酶抑制劑。Kunitz在1936從牛胰臟中純化并結晶[2],發現具有抑制激肽釋放酶和胰蛋白酶的功能。它由58個氨基酸殘基組成,分子內六個半胱氨酸形成3對二硫鍵,其活性中心為Lys15-Ala16-Arg17(賴氨酸15-丙氨酸16-精氨酸17,KAR)。其中一對二硫鍵(Cys14-Cys38)位于分子表面,它使兩段肽鏈(Cys32-Cys42,Cys9-Cys21)連接在一起,這一對二鍵被還原和重新氧化后不影響抑制劑活力。另外兩對二硫鍵(Cys5-Cys55,Cys30- Cys51)位于分子內部,一旦還原后即失活[3]。整個分子呈梨形,由兩條反平行的β-折疊,兩段α-螺旋,β-轉角和一些環組成[4]。它最主要的結構特征是含有兩片180度扭曲的反平行β-折疊,這個折疊分別和β-轉角與一對二硫鍵(Cys14-Cys38)相連,這個分子的主要片段1~14和38~58殘基沿著β2折疊來回彎曲折疊,以使末端殘基1和殘基58能夠在β轉角處相互靠近,二硫鍵的共價連接也使這兩端靠攏并和β-轉角(30~51殘基組成)靠近。N端的殘基形成了一個短的螺旋段,C端形成了一個更長的、有規律的α-螺旋(殘基48~56)[4]。分子的自然折疊和半胱氨酸以獨特的方式共價連接使整個分子變的緊湊、穩定[5]。分子內部含有一個能容納4個水分子的疏水核心,這個分子的活性位點在一個溶劑暴露的環區(loop)。它由15 個氨基酸殘基組成,這個環和酶活性位點高度互補,其中關鍵活性殘基P1位點與絲氨酸蛋白酶的S1特異性束縛“口袋”中的酶活性位點結合。X-晶體衍射的方法測定了β-胰蛋白酶和BPTI在P1位點的10種突變體形成的復合物的結構[6],抑制劑的專一性是由P1位置氨基酸殘基的性質決定的,P1位置是Lys或Arg的抑制劑對胰蛋白酶有抑制作用。

  2BPTI的生物學功能

  BPTI對絲氨酸蛋白水解酶具有廣譜的抑制作用,能通過形成可逆性的酶-抑制物復合體抑制如胰蛋白酶、糜蛋白酶、纖溶酶、凝血酶及各種組織或血漿激肽釋放酶等,每一復合物有特定的解離常數,解離常數越低,抑制其酶活性所需的BPTI濃度就低。(1)抑制中性粒細胞激活和脫顆粒具有抗炎作用:BPTI通過抑制人體多種以絲氨酸為活性中心的酶尤其是激肽釋放酶、纖溶酶以及Ⅻ因子來抑制多路炎癥反應途徑[7]。可防止過氧化產物形成、內皮細胞損傷、保護臟器功能。(2) BPTI抑制循環中的纖溶酶,阻止血小板激活,保護糖蛋白受體及止血功能:能夠抑制尿激酶型-纖溶酶原激活劑(u-PA)和組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)對纖溶酶原的激活[8],保護血小板功能。并且可以直接與纖溶酶結合,從而使纖溶酶失活,減少術后大出血。(3)抑制激肽釋放酶的激肽形成和血管活性效應,防止缺血再灌注損傷。(4)減少補體激活,抑制C3a和C5a產生。(5)BPTI在pH 1.1和10.5時,以單體占優勢,在中性pH時以二聚體占優勢。對高溫、酸、堿和酶都很穩定,在稀酸中加熱至100℃,在2.5%三氯乙酸中加熱至80℃都未見活性損失。(6)等電點偏堿性,pH在10~10.5之間。

  3BPTI的臨床應用

  絲氨酸蛋白酶的正常作用受到破壞或與機體自身存在的抑制劑之間的平衡發生異常,均會引起機體組織的損傷,用BPTI可對這些損傷進行防治。在臨床上BPTI廣泛用于急性胰腺炎、手術后器官功能衰竭以及再灌注損傷、早產、肺氣腫、腦水腫、腫瘤的浸潤和轉移等疾病治療和預防。

  3.1應用于急性胰腺炎的治療急性胰腺炎發病時,胰腺中的血清淀粉酶、溶酶體酶、組織蛋白酶B以及蘋果酸脫氫酶的水平均會顯著增高,溶酶體酶、組織蛋白酶B能激活胰蛋白酶原,從而激活許多其他的消化酶,導致多種蛋白酶在胰腺內的過度累積,引起胰腺本身的炎癥及缺血性壞死等癥狀。炎性介質及毒素的進一步釋放將導致全身的炎性反應綜合征,嚴重時會出現多器官障礙。胰蛋白酶抑制劑可以抑制許多對導致急性胰腺炎起關鍵作用的酶,如胰蛋白酶、磷脂酶A、胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶等,并能抑制溶酶體酶,穩定溶酶體膜,從而起到對胰腺的保護作用。目前臨床上應用的幾種胰蛋白酶抑制劑類藥物對急性胰腺炎均有顯著療效。

  3.2應用于心臟外科手術體外循環在心臟外科手術體外循環過程中機體處于一種非生理狀態,同時伴有缺血、缺氧和各種酶、炎性介質、自由基的大量釋放,體內很多絲氨酸蛋白酶釋放也較多,而其抑制劑消耗較大,引起二者平衡的失調,導致凝血異常以及心臟、肺、腎等重要器官和血管的內皮損傷,并可引起術后出血、器官功能衰竭及再灌注損傷等。BPTI在心臟外科手術體外循環中既有抗凝血作用,又有止血作用:其抗凝血作用是因為它可以抑制舒血管素的活化,并可抑制激肽釋放酶,間接抑制凝血因子Ⅻ的活化,阻斷內源性凝血途徑;其止血作用是由于它能抑制纖維蛋白溶酶和纖維蛋白溶酶原的激活因子,阻止纖維蛋白溶酶原的活化,同時可預防血小板損傷。另外BPTI還可通過降低纖維蛋白原的降解產物水平來減輕其對再灌注心肌的損害[9]。

  3.3應用于腦血管疾病的防治在臨床上,腦水腫、腦缺血、蛛網膜下腔出血后的腦血管痙攣都是治療的難題。有關BPTI的臨床研究表明,BPTI有可能成為治療上述疾病的新手段。防治腦水腫BPTI與類固醇激素具有相同程度的抑制腦血管通透性增高的作用,可明顯地抑制腦含水量的增高[10],BPTI也可顯著降低腦含水量及乳酸水平。其作用機制尚不明確,但基本認為是:(1)保護血腦屏障;(2)抑制溶酶體酶活化;(3)穩定細胞膜。另外,BPTI還可能通過阻止血液及腦組織中緩肽酶的生成,進而抑制花生四烯酸的釋放,達到改善腦水腫的作用。防治腦缺血BPTI可防止因急性腦缺血所造成的ATP下降和腦水腫,減輕缺血時的代謝障礙,抑制血管活性物質的產生,從而改善缺血后再灌注時的充血情況。說明BPTI對腦缺血有保護作用。

  3.4應用于肺再灌注損傷的防治再灌注損傷在肺移植后期是個很嚴重的問題,再灌注過程中引起血管內皮細胞發生某些變化,激活沉積在夾緊的一側肺上的中性粒細胞[11],活化的中性粒細胞釋放中性粒細胞彈性蛋白酶,該酶能夠使膠原蛋白分解,結果導致滲透性加速性肺水腫。BPTI對中性粒細胞彈性蛋白酶和中性粒細胞組織蛋白酶G有抑制作用,并可以穩定溶酶體膜,避免損傷的進一步發展。

  3.5其他方面的應用(1)骨科的應用:柯廣珍報道,用靜脈滴注BPTI代替控制性降壓在髖關節置換術中止血。選擇40例患者分為兩組,結果止血效果相同,但靜滴BPTI組避免了控制性降壓平均動脈壓下降、心率增快的副作用,表明BPTI法優于降壓法。王震宇等用BPTI與透明質酸鈉聯合應用治療骨性關節炎,也取得了良好的效果。(2)預防腸粘連 :曹天生等取成年雌鼠,開腹,按Galili法制成小腸與子宮左前壁粘連模型,關腹前分別于腹腔內置入2.0ml生理鹽水,50000kIU BPTI 2.0ml,兩周后,開腹觀察粘連程度。生理鹽水組粘連率為95%,抑肽酶組為45% ,表明抑肽酶抑制腸粘連有效。丁敏等的實驗報道也證明了,BPTI抑制腸粘連有良好效果。(3)用于預防感染引起的早產:因感染引起的絨毛膜羊膜炎是迫切早產的主要發病機制之一,炎性介質濃度過高以及隨之而產生的多形核中性粒細胞彈性酶(PMNE)在其中有重要的作用[12]。臨床實驗證明BPTI可以通過抑制相關的炎性介質,如白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)以及白介素8(IL-8),并抑制PMNE以防止早產。(4)抑制腫瘤的浸潤與轉移:腫瘤的轉移是腫瘤的惡性特征之一,是大多數實體瘤患者死亡的主要原因。基底膜是細胞外基質的一種,其破壞是腫瘤浸潤轉移的標志。腫瘤細胞對基底膜的浸潤可分為3步:黏附、溶解和轉移。其中溶解過程是由蛋白酶降解瘤細胞下方的基底膜。由此可見,蛋白溶解酶在瘤細胞浸潤、轉移中的作用必不可少,其中多種絲氨酸蛋白酶濃度與腫瘤的侵襲呈正相關。研究證明,人體內許多腫瘤細胞上都有蛋白酶抑制劑的受體[13],BPTI與受體的結合能夠調節纖維蛋白酶的活性,抑制其對蛋白質的分解作用,阻斷腫瘤細胞的浸潤和轉移過程,并重新修復細胞屏障。此外,BPTI還可用于治療肺氣腫、關節炎等,在胰島的移植過程中還可抑制各種絲氨酸蛋白酶的活性,從而提高移植的成功率[14]。

【參考文獻】
    1Bode W,Huber R.Natueal protein proteinase inhibitors and their interaction with protein- ases.Eur J Biochem,1992,204:433-451.

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  5Anruch W,Berndt KD ,Chavea M . The NMR solution structure of Kunitz-type proteinase inhibitors from the sea anemone Anemonia stichodactyle helianthus.Eur J biochem ,1993,212(19):675-684.

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  9Kanayama N,Maehara K,She L.Urinary trypsin inhibitor sup-presses vascular smooth muscle contraction by inhibition of Ca2+ influx.Biochem Biophys Acta ,1998,1381(2):139-146.

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  12Kanayama N,Maradny E,Halim A.Urinary trypsin inhibitor supresses premature cervical ripening.Obster Gynecol Reprod Biol,1995,60(2):181-186.

  13Kobayashi K,Gotoh J,Hirashima Y.Inter-α-trypsin inhibitor bound to tumor cells is cleaved into the heavy chains and the l ight chain on the cell surface.J Biol Chem,1996,271(19):11362-11367.

  14Lu WT, Lakey JR, Juang JH, et al.Effect of trypsin inhibitor on islet isolation from fresh and cold preserved rat pancreas.Transplantation Proceedings,2003,35(1):488-489.


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