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神經凝膠復合嗅鞘細胞移植修復大鼠脊髓橫斷傷的實驗研究

來源:中華醫學實踐雜志 作者:劉吉祥,吳 鋒,任洪波,張素蘭,劉 斌 2011-6-29
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摘要: 【關鍵詞】 神經凝膠復合嗅鞘細胞移植 大鼠 脊髓橫斷傷 實驗研究 脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)后神經再生和肢體功能恢復一直困擾醫學臨床的一大難題。近年來,隨著神經細胞生物學、分子生物學、神經電生理學、神經移植等技術和組織工程材料的飛速發展,人們對損傷后神經軸突再生及其調控有了深入的了......


【關鍵詞】  神經凝膠復合嗅鞘細胞移植 大鼠 脊髓橫斷傷 實驗研究

 脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)后神經再生和肢體功能恢復一直困擾醫學臨床的一大難題。近年來,隨著神經細胞生物學、分子生物學、神經電生理學、神經移植等技術和組織工程材料的飛速發展,人們對損傷后神經軸突再生及其調控有了深入的了解,但對脊髓完全性橫斷傷后神經再生和肢功能恢復并沒有取得突破性進展。近年來逐漸興起的神經凝膠(neurogel,NG)[1~4]為利用神經生物工程技術實現脊髓完全性橫斷傷后神經再生和肢體功能恢復帶來了新的希望,其有效性、安全性和可行性等方面已經取得了明確結論,并已作為商品投放科研市場;同樣對嗅鞘細胞(OECs)促進損傷后神經細胞存活和軸突再生也已得到充分證實[5~8]。本研究擬以NG為支架,使高度純化的OECs在其表面粘附、生長,構建NG-OECs復合體移植修復大鼠脊髓橫斷損傷,以觀察和分析其對神經元存活和神經軸突再生的作用和意義。

  1 材料與方法

  1.1 材料

  DMEM-F12(DF12)培養基購自Hyclone公司,小牛血清(NCS)、胰蛋白酶購自Gibico公司,hoechst33342、多聚賴氨1093酸(PLL)購自Sigma公司,P75抗體、EnVision試劑盒購自Dako公司(單克隆抗人抗體)、NF-200、Synaptophysin(多克隆抗體)抗體及DAB顯色試劑盒均購自博士德公司。成年雌性Wistar大鼠60只,重250~300g,由河北醫科大學實驗動物中心提供。

  1.2 OECs的取材、分離

  OECs的分離、培養、純化和標記:取2.5個月齡雌性Wistar大鼠的嗅球神經層及顆粒層;以0.25%胰蛋白酶消化,終止消化后用含20%胎牛血清的DF12培養基吹打成單細胞懸液,接種于未涂膠的玻璃培養瓶,置5%CO2孵箱37℃培養12h后將培養上清連同未貼壁細胞轉種于另一個未涂膠的玻璃培養瓶,再培養12h;調整細胞密度為1×106/ml,種植于經poly-L-Lysine處理的6孔板,培養7天,加入Ara-C(終濃度為10-5mol/L)作用48h,清洗后培養液中添加forskolin和BPE(終濃度分別為20μmol/L和20μg/ml),繼續培養10天左右,行S-100常規免疫組化染色以確定純度。細胞移植前培養液中加入BrdU孵育48h(作用濃度5μmol/L)。

  1.3 OECs免疫細胞化學染色及純度鑒定

  將獲得的OECs分別在原代分離后第2、7、14天做P75免疫細胞化學染色。取出6孔板內蓋玻片,放入40g/L多聚甲醛室溫下固定40min,PBS沖洗3次,加入封閉血清,室溫下作用20min,PBS沖洗后,按DAKO公司提供EnVision工作程序加入P75抗體(抗人單抗)及其他試劑。顯微鏡觀察,每個標本隨機選取3個視野計數陽性細胞并計算平均陽性百分率。

  1.4 構建NG-OECs復合體

  篩選合適的細胞密度,利用微注射技術將OECs順柱形NG主孔方向注入,與NG支架共培養,并利用光鏡及電鏡觀察細胞在支架中的形態特點及生物學特性。

  1.5 脊髓神經元與NG-OECs復合體共培養

  取胎齡E16的大鼠脊髓神經元微注射法沿主孔方向接種于無血清培養NG-OECs復合體中,另將其接種于無OECs的NG中作為對照組。分別于接種后1、3、5、7、14天觀察神經元生長情況。以NF-160抗體為一抗,進行細胞免疫組化染色,觀察脊髓神經元的存活情況。用免疫熒光、免疫電鏡等方法檢測OECs與脊髓神經元體外共培養時生長整合情況。

  1.6 實驗動物分組

  實驗擬用雌性Wistar大鼠60只,分為單純損傷和NG-OECs復合體移植兩組,每組30只。

  1.7 大鼠脊髓橫斷性損傷模型

  按40mg/kg劑量麻醉大鼠,麻醉后固定于立體定向儀上,以T10為中心,設計切口。在顯微鏡下,無菌操作切除T10全椎板及T9、T11部分椎板,顯露脊髓,剪開硬膜,以特制探針橫預置3-0絲線于待損傷脊髓腹側硬膜內。以剃須刀片于預置線頭側0.5mm(T9水平)將脊髓橫斷,順利由腹側向背側提出預置線,明膠海綿輕柔壓迫止血。移植后縫合硬膜及切口。

  1.8 NG-OECs移植

  各組分別于損傷后即時采用顯微外科技術將構建好的NG-OECs復合體移植于脊髓斷端,標準化操作。OECs對照組使用顯微注射法將OECs懸液10μl(107/ml)注入距傷部3mm脊髓兩斷端處,留針10min后緩慢拔針。

  1.9 脊髓神經功能恢復情況的評價

  行為學評分:2組均于移植后1、2、3、4、6周及8周進行行為學檢查,采用雙盲法進行大鼠后肢運動功能評分(BBB記分法),21分為功能正常,0分為功能完全喪失。BBB評分觀察時間為5min。

  1.10 脊髓前角運動神經元結構重建情況評價

  應用組織學染色、免疫組化等方法評價脊髓損傷的結構重建情況,利用神經電生理和BBB評分觀察其功能恢復情況。(1)組織切片病理染色觀察各組脊髓損傷區神經纖維與膠質瘢痕生成情況,應用HE、FB和Holzer等染色方法。(2)超薄切片電鏡觀察再生神經纖維生長與延伸情況、再生纖維與OECs整合及突觸形成等超微結構。

  1.11 NG-OECs復合體移植技術的安全性檢測

  (1)免疫組織化學(NGFR、GFAP、BrdU)和免疫熒光技術檢測細胞增殖分化狀態及遷移情況。(2)移植細胞成瘤性檢測:利用移植后長時間(大于半年)存活的動物,觀察移植細胞是否具有異型性。

  1.12 統計學分析

  根據每一實驗步驟取得的結果數據形式,應用SPSS12.0統計軟件。組間比較采用t檢驗,P≤0.05為差異有顯著性。

  2 結果

  2.1 BBB運動功能評分

  所有大鼠脊髓全橫斷后第1、2周的BBB評分均為0分;傷后3周實驗組和對照組后肢運動功能有輕微恢復;細胞移植4周后,NG-OECs復合體移植組BBB評分明顯高于對照組,差異有顯著性(P<0.05)。6周后,NG-OECs復合體移植組BBB評分提高更為顯著,且兩組BBB評分差值有增大趨勢,提示NG-OECs復合體移植可能對SCI大鼠后肢運動功能恢復有促進作用(表1)。

  2.2 組織學觀察

  術后3周脊髓損傷區蘇木精-伊紅染色顯示NG-OECs復合體移植組脊髓損傷區結構紊亂,纖維走行方向扭曲、不一致,細胞數目較多,嗜銀染色結果顯示無論在損傷區還是損傷頭、尾端,NG-OECs復合體移植組神經纖維數量多于對照組。NG-OECs復合體移植組損傷頭端神經纖維數量多于損傷尾端,對照組損傷頭、尾端神經纖維數量基本一致。利用圖像分析系統對嗅鞘細胞移植組、對照組脊髓損傷區和對照組相同節段CST區域嗜銀染色進行神經纖維計數,其結果見表1。表1 NG-OECs組和對照組各階段BBB運動功能評分結果

  2.3 NG-OECs復合體移植修復脊髓損傷超微結構觀察

  術后3周臨近脊髓損傷區近端的脊髓前、后角取出組織透射電鏡觀察可見,NG-OECs復合體移植組脊髓有較多增生組織填充,脊髓組織中無明顯空腔,空泡小而少,神經纖維及細胞壞死較少,色澤較亮;而對照組有較多空腔狀,白質中有許多微囊,神經纖維及細胞壞死,顏色較暗,在橫斷處附近形成較多空泡;8周時上述差別更明顯。

  2.4 脊髓組織切片的熒光觀察和免疫組織化學染色結果

  冰凍切片熒光顯微鏡下表現,NG-OECs復合體實驗組:3周標本,hoechst標記的OECs多集中于注射部位,熒光比較強;6周后熒光強度漸弱和密度降低(對比3周),細胞可遷移至原注射部位15~3.5mm遠處,提示細胞移植后向周圍遷移。對照組為陰性。移植細胞成瘤性檢測:利用移植后長時間(大于半年)存活的動物,采集20只,在電鏡下觀察移植OECs均未發現明顯異型性。

  3 討論

  傳統觀點認為,哺乳動物的腦和脊髓損傷后不能再生,因而半癱或全癱癥狀如果不能在傷后24h內得到改善,則不會有明顯的功能恢復。最近,經研究發現CNS有再生功能,神經損傷后的修復能力取決于多種因素的影響。目前認為脊髓損傷后難以恢復的主要原因包括:(1)對脊髓的直接打擊及繼發炎癥使脊髓內功能神經元大量壞死,右旋糖苷生物素順行標記顯示:再生的皮質脊髓束損傷凋亡且神經元再生困難;(2)脊髓損傷后暴露的髓鞘相關抑制分子及繼發形成的膠質瘢痕阻礙了軸突的生長和正確連入灰質形成終末分支。(3)損傷造成局部細胞凋亡,致使細胞分泌的神經營養因子減少,破壞了支持軸突再生的有利微環境[9]。本實驗中觀察到:傷后3周實驗組和對照組后肢運動功能有輕微恢復;細胞移植4周后,NG-OECs復合體移植組BBB評分明顯高于對照組,有統計學差異(P<0.05)。6周后,NG-OECs復合體移植組BBB評分提高更為顯著,且兩組BBB評分差值有增大趨勢,提示NG-OECs復合體移植可能對SCI大鼠后肢運動功能恢復有促進作用(表1)。組織學方面對嗅鞘細胞移植組、對照組脊髓損傷區和對照組相同節段CST區域嗜銀染色進行神經纖維計數,其結果為NG-OECs復合體移植組(544.7±102.2),對照組(2212.8±175.4)。兩組之間差異有顯著性(P<0.05)。這也與實驗中BBB運動功能評分所得到結果相符。細胞移植后3周左右,注射部位可檢測到強而且密集的藍色熒光;6周后檢測到熒光強度漸弱和密度降低但分布更為廣泛。提示細胞由注射部位向周圍緩慢遷移,部分細胞甚至越過損傷頭尾兩端(P75染色),遷移至原注射部位1.5~3.5mm遠處,在遷移過程中和周圍組織逐漸融合并發揮支持作用。筆者認為移植的NG-OECs復合體在脊髓損傷修復過程中可能發揮如下作用:(1)支持脊髓神經元軸突再生和突觸重建。嗅神經終身可以再生,并且再生軸突可穿越周圍神經系統與中樞神經系統的交接區,重新長入中樞神經系統的嗅球并建立起突觸聯系,嗅神經元(olfactory sensory neumns,OSNs)的強再生能力與嗅覺系統內嗅鞘細胞的獨特作用密不可分,OECs包被著嗅神經軸突,并且誘導嗅神經長入神經中樞,決定了OsNs軸突終身再生的生理特性;(2)OECs能表達多種細胞表面粘附分子,如層粘連蛋白(1aminin)、細胞粘連分子LI(cell adhesion molecule)等促進神經軸突生長;(3)OECs還能分泌多種神經營養因子,如神經營養素(NT-3)、神經生長因子(NGF)、腦源性神經營養因子(BDNF)等,這些神經營養因子對于神經元的成熟具有促進作用。臨床上,脊髓損傷患者中橫斷傷療效最差,筆者的動物實驗模型與其相吻合:因此本實驗結果為臨床脊髓損傷患者嗅鞘細胞移植后的神經功能恢復,從理論上奠定了基礎、提供了依據。結合實驗研究筆者認為,嗅鞘細胞移植后,脊髓損傷晚期患者神經功能恢復的機制在早期可能以脫髓鞘后髓鞘化等損傷修復作用為主,隨后可能兼有損傷修復和神經再生兩方面的作用,最后則可能以神經再生的作用為主。

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