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Leptin對小鼠窗口期子宮內膜上皮細胞MMP-9及ICAM-1的影響*

來源:中華現代婦產科學雜志 作者:郝翠芳1,劉 萍2△,沈肖方1,張 寧1,王昕榮1 2011-6-30
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摘要: 【摘要】 目的 研究瘦素(Leptin)對小鼠著床窗口期子宮內膜上皮細胞分泌金屬蛋白酶-9(MMP-9)及細胞粘附分子-1(ICAM-1)的影響。 方法 離體培養著床窗口期小鼠子宮內膜上皮細胞,用不同濃度Leptin干預,通過免疫組織化學SP法對子宮內膜上皮細胞MMP-9、ICAM-1蛋白的表達進行檢測。 結果 (1)隨著Leptin濃度的增加,原代培......


【摘要】  目的 研究瘦素(Leptin)對小鼠著床窗口期子宮內膜上皮細胞分泌金屬蛋白酶-9(MMP-9)及細胞粘附分子-1(ICAM-1)的影響。 方法 離體培養著床窗口期小鼠子宮內膜上皮細胞,用不同濃度Leptin干預,通過免疫組織化學SP法對子宮內膜上皮細胞MMP-9、ICAM-1蛋白的表達進行檢測。 結果 (1)隨著Leptin濃度的增加,原代培養的子宮內膜上皮細胞分泌MMP-9表達量呈濃度依賴性升高(P<0.01)。(2) 隨著Leptin濃度的增加, 原代培養的子宮內膜上皮細胞分泌ICAM-1表達量呈濃度依賴性升高(P<0.01)。當濃度增加到一定水平ICAM-1的表達不再升高(P>0.01)。 結論 一定水平的Leptin可以促進子宮內膜上皮細胞MMP-9及ICAM-1的分泌,有利于胚胎著床。

【關鍵詞】  瘦素;子宮內膜上皮細胞;免疫組化;金屬蛋白酶-9;細胞粘附分子-1;小鼠

Objective To investigate the effect of Leptin on matrix metalloproteinases-9(MMP-9) and intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)secreted from endometrial epithelial cells during embryo implantation widow stage in mice.Methods Endometrial epithelial cells from mice in the embryo implantation stage were fertilized in vitro. The endometrial epithelial cells were treated with Leptin. The immunohistochemical method was applied to test the expression of MMP-9, ICAM-1 in the endometrial epithelial cells.Results With the increase in the concentration of Leptin, both the amount of MMP-9 secreted from the endometrial epithelial cells fertilized in vitro and the amount of ICAM-1 secreted from the endometrial epithelial cells fertilized in vitro increased in a dose-dependent manner(P<0.01).Conclusion It can be concluded that Leptin up to a certain level can increase the expression of MMP-9 and ICAM-1 secreted from endometrial epithelial cell in mice, thus improving embryo implantation.

  [Key words] Leptin; endometrial epithelial cells; immunohistochemical method;MMP-9; ICAM-1; mice

  近年的研究表明,多種細胞因子和激素在胚胎生長發育及妊娠母體中起著不可低估的調控作用。其中,瘦素(Leptin)是近年發現的Ⅰ型細胞因子,是肥胖基因的產物,由白色脂肪細胞分泌的一種含146個氨基酸的蛋白質。Margetic等[1]報道Leptin通過調節下丘腦-垂體-性腺的功能影響性激素的合成和分泌,也可通過直接或間接的外周作用對生殖系統功能產生影響,抑或通過直接結合卵泡細胞膜表面瘦素受體影響細胞的功能,但其具體機制尚不明了。本研究擬通過免疫組化方法檢測圍著床期小鼠子宮內膜上皮細胞在不同濃度Leptin作用下MMP-9、ICAM-1的表達量,以探討Leptin在胚胎著床過程中的可能調控作用。

  1 材料與方法

  1.1 材料

  1.1.1 實驗動物

  成年昆明種雌性小白鼠,6~8周齡,體重25~30g。雄性3~4月齡,體重40~50g。由煙臺綠葉生物制藥公司實驗動物中心提供[許可證號:SCXK(魯)20030008]。實驗動物房光、暗周期均為12h,飼養溫度為 24℃~26℃,喂普通小鼠飼料,自由攝食飲水。

  1.1.2 試劑

  DMEM/F12培養基 (Hyclone,美國);胎牛血清(FBS)( Gibco,美國 );雙抗(Hyclone,美國);孕馬血清促性腺激素(PMSG)(寧波第二激素廠);人絨毛膜促性腺激素(HCG) (煙臺北方制藥廠) ;鼠重組瘦素(Leptin)(Sigma,美國);MMP-9、ICAM-1兔抗鼠單克隆抗體(武漢博士德);SP免疫組化試劑盒(北京中杉金橋);DAB 試劑盒(Invitrogen,美國)。

  1.2 方法

  1.2.1 小鼠子宮內膜細胞的原代培養與鑒定

  取成年雌性昆明種小白鼠,體重25~30g,4~5pm腹腔注射PMSG 10IU,48h后腹腔再注射HCG 10IU。雌雄按 2:1合籠 ,自然交配 ,次晨查見陰栓者定為妊娠第一天。取妊娠第四天雌鼠脫頸處死,按照石運芝[2]報道的方法培養上皮細胞并做鑒定。細胞計數以1×105/ml加入含10%滅活FBS的DMEM/F12培養液,接種于六孔培養板中(板內放有多聚賴氨酸包被的蓋玻片)。置入37℃、95%空氣、5%CO2培養箱中培養。

  1.2.2 加入Leptin進行調控

  24h細胞生長完全貼壁后,每孔更換含不同濃度Leptin的DMEM/F12的培養液1ml。設置正常對照組,每個組設五孔。培養液中Leptin濃度分別為10ng/ml、50ng/ml、500ng/ml。培養48h后,進行檢測。

  1.2.3 細胞免疫組織化學染色

  取出蓋玻片,PBS漂洗5min×3次,4%多聚甲醛室溫下固定20min,PBS漂洗5min×3次,3%H2O2 室溫下封閉15min,PBS漂洗5min×3次,10%的正常山羊血清37℃封閉30min;分別滴加一抗MMP-9(1:200)、ICAM-1(1:150),4℃冰箱內孵育過夜。滴加生物素化羊抗兔IgG(1:200),37℃孵育30min;PBS漂洗5min×3次,DAB 顯色液顯色10min;蘇木素復染,中性樹膠封片后顯微鏡下觀察。陰性對照以PBS代替一抗,其余步驟相同。

  1.3 圖像處理和統計學分析

  采用IMAGE-PRO PLUS圖像分析系統對陽性細胞進行分析,每個組隨機取5張片子,每張片子選擇5個不重復視野定量分析,結果以陽性細胞數及平均光密度(OD值)表示。采用SAS統計軟件(9.1.3版)分析實驗結果,所獲數據用x±s表示,進行方差分析及t檢驗

  2 結果

  2.1 Leptin對小鼠子宮內膜上皮細胞分泌MMP-9蛋白的影響

  見表1、圖1。原代培養的著床窗口期小鼠子宮內膜上皮細胞經10ng/ml、50ng/ml、500ng/ml Leptin處理后,分泌的MMP-9蛋白主要分布在上皮細胞胞質內。因為細胞表達的蛋白量不同,經DAB染色顯示出深淺不同的棕黃色顆粒。與空白對照組相比,所有實驗組MMP-9蛋白表達量都增加,差異有統計學意義(P<0.01);隨著Leptin濃度的增加,上皮細胞MMP-9蛋白分泌量的增加,呈現一定的劑量效應關系,差異有統計學意義(P<0.01)。

  2.2 Leptin對小鼠子宮內膜上皮細胞分泌ICAM-1蛋白的影響

  見表1、圖2。原代培養的圍著床期小鼠子宮內膜上皮細胞經10ng/ml、50ng/ml、500ng/ml Leptin處理后,上皮細胞分泌的ICAM-1蛋白與二抗結合出現陽性反應,陽性產物呈棕黃色顆粒狀,主要分布在上皮細胞胞質內。因為細胞表達的蛋白量不同,經DAB染色后顯示出深淺不同的棕黃色顆粒。與空白對照組相比,隨著Leptin濃度的增加,上皮細胞ICAM-1蛋白分泌量增加,呈現一定的劑量效應關系,與對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)。當濃度達到500ng/ml時 ICAM-1的表達量不再增加,與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。表1 不同濃度Leptin干預后小鼠子宮內膜上皮細胞MMP-9、ICAM-1表達

  3 討論

  哺乳動物胚胎對子宮內膜的粘附和植入是非常復雜的生理過程。小鼠胚胎“著床窗”出現在妊娠第4~5天,持續24h左右,受到各種細胞因子、生長因子和激素凋節。MMP-9是MMPs家族成員之一,在早孕母胎表面的基質細胞、上皮細胞和蛻膜細胞中均有表達。具有酶解作用消化蛻膜基質、基底膜,在胚胎植入時溶解ECM以利著床[3]。哺乳動物模型研究表明,MMP-9對胚胎種植起重要作用。MMP-9敲除的小鼠生育力下降[4]。MMP-9抗體能阻止ECM降解,使囊胚生長停止,阻礙胚泡與子宮內膜上皮之間的粘附。可見,MMP-9在胚胎對子宮內膜著床中起著重要作用。實驗中筆者用Leptin作為調控因素,探討不同濃度的Leptin對著床窗口子宮內膜容受性的影響,發現隨著Leptin濃度的增加,小鼠子宮內膜上皮細胞分泌MMP-9蛋白的表達量亦隨之增加,具有量效關系。這與Gonzalez[5] 報道瘦素可以明顯增強MMP-9的活性和國內徐可樹[6]的研究是相符的。根據實驗還得出,Leptin濃度在10~500ng/ml可使小鼠子宮內膜上皮細胞MMP-9的表達量穩步增長具有濃度依賴性關系。說明一定水平的Leptin可以與著床窗口期子宮內膜上皮細胞瘦素受體結合,通過影響MMP-9的表達,作用于滋養細胞識別粘附子宮內膜,并降解基質,侵入內膜從而參與胚泡著床。

  細胞粘附分子-1( ICAM-1)屬于免疫蛋白超家族的主要成員,是一種重要的細胞粘附分子。在子宮內膜上皮細胞、蛻膜、滋養層細胞上均有表達。主要作用是介導細胞與細胞間的粘附,且對胚胎著床過程中介導子宮內膜容受性的建立和胚泡在子宮內膜的粘附發揮著重要作用。本文研究發現圍著床期小鼠子宮內膜上皮細胞ICAM-1的表達隨著Leptin濃度的增加,表達量逐步升高。Leptin的濃度在10~50ng/ml 之間時,可誘導ICAM-1表達上升,且具有濃度依賴性關系。據此可以看出一定濃度的Leptin可以上調ICAM-1的表達,促進其與配體如淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)和巨噬細胞抗原復合體-1(Mac-1)等結合來介導胚泡與內膜間的粘附,且ICAM-1/LFA-1對話導致前炎性細胞因子遷移至著床位點,促使蛻膜的樹突狀細胞成熟,誘發局部輔助T細胞(Thl)增加并參與母胎面的免疫耐受形成,避免了子宮內膜對胚泡的免疫排斥作用,從而調節子宮內膜的容受性,進而有利于胚泡的著床。筆者研究還發現Leptin的濃度在500ng/ml時,ICAM-1的表達與對照組比較無差異。推斷是否因為著床窗口期的子宮內膜因瘦素受體飽和從而不再刺激ICAM-1的表達,還值得進一步研究。

  (本文圖片見封三)

【參考文獻】
   1 Margetic S, Gazzola C, Pegg GG, et al. Leptin:a review of its peripheralactions and interactions. Int J Obes Relat Metab Disord, 2002, 26(11):1407-1433.

  2 石運芝,劉凱. 著床窗口小鼠子宮內膜上皮細胞的原代培養及形態學觀察. 泰山醫學院學報, 2004,6(25):570-572.

  3 Elsebeth Staun-Ram, Shlomit Goldman, Diana Gabarin,et al. Expression and importance of matrix metalloproteinase 2 and 9(MMP-2and -9) in human trophoblast invasion. Reprod Biol Endocrinol, 2004,2(1):59-61.

  4 Opdenakker G,Vanden Steen PE,Dubois B,et al.Gelatinase B functions as regulator and effector in leukocyte biology.J Leukoc Biol,2001,69(6):851-859.

  5 Gonzaiez RR,Devoto L,Campana A,et al.Effects of Leptin,interleukin-1α,interleukin-6,and transforming growth factor-on markers of trophoblast invasive phenotype:integrins and metalloproteinases.Endocrine,2001,15(2):157.

  6 徐可樹,鐘少平.Leptin對人早孕期滋養細胞CXCR-4、MMP-9及VEGF表達的影響.中國婦幼保健,2006,21(3):1108-1110.

  


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