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微絲功能對內皮細胞損傷修復的影響

來源:中華現代皮膚科學雜志 作者:顧海峰 倪 俊 張杏梅 2005-11-8
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摘要: 【摘要】 目的 觀察內皮細胞在損傷修復過程中微絲骨架系統的形態結構變化,研究阻斷微絲功能對內皮細胞損傷修復的影響。 方法 以培養單層內皮細胞損傷模型,采用免疫熒光染色和 3 H-TdR摻入法,研究微絲功能對創面愈合及細胞增殖的影響。 結果 內皮細胞在損傷修復過程中伴隨微絲特殊而有序的變化。用細胞松弛素B破壞微絲......


    【摘要】 目的  觀察內皮細胞在損傷修復過程中微絲骨架系統的形態結構變化,研究阻斷微絲功能對內皮細胞損傷修復的影響。 方法  以培養單層內皮細胞損傷模型,采用免疫熒光染色和 3 H-TdR摻入法,研究微絲功能對創面愈合及細胞增殖的影響。 結果  內皮細胞在損傷修復過程中伴隨微絲特殊而有序的變化。用細胞松弛素B破壞微絲,可不同程度抑制創面的愈合及細胞增殖,并呈一定的時間—劑量依賴關系。 結論  微絲功能在內皮細胞修復過程中起重要作用,可通過直接或間接效應影響DNA合成,從而影響修復過程。

    關鍵詞  內皮細胞 創傷愈合 細胞骨架

    Effects of microfilaments on the repair of endothelial monolayers wound

    Gu Haifeng,Ni Jun,Zhang Xingmei

    Department of Plastic Surgery,PLA No.85Hospital,Shanghai200052

    【Abstract】 Objective To observe the morphological changes of microfilaments,and to investigate the wound clo-sure and cell proliferation after the disruption of microfilaments.Methods An in vitro wound model,immunofluorescence microscopy and 3 H-TdR incorporation methods were used in this study.Results A specific and sequential changes in microfilaments occourred during wound healing.When the microfilaments were disrupted with cytochalasin B,the wound closure and cell migration were greatly delayed.The endothelial cell 3 H-TdR incorporation was also inhibited,which showed time and dose dependent relationship.Conclusion These results suggest that the microfilement system might be critical to wound healing,and the cytoskeletal system might directly or indirectly participate in the regulation of cell pro-liferation and wound healing.

    Key words endothelial cell wound healing cytoskeleton

    創傷修復是一個復雜的生物學過程,許多因素參與了這一過程的調節。研究表明,細胞骨架系統(cytoskeleton system)不僅決定細胞的形態和運動,還參與控制細胞的生長、分化及細胞內外的信息傳遞 [1] 。因此在創傷修復過程中細胞骨架系統可能起著重要作用。微絲系統是細胞骨架的主要成分,本實驗擬采用體外培養單層內皮細胞損傷模型,觀察微絲在損傷修復過程中的相應變化,以及阻斷微絲功能對損傷修復過程及細胞增殖的影響。

    1 材料與方法

    1.1 細胞培養及模型建立 參考文獻的方法分離和培養人臍靜脈內皮細胞 [2] ,以含20%FCS的DMEM(Gibco)液每2d換液1次。創傷模型的建立參考文獻報道 [3] ,內皮細胞接種在含蓋玻片的24孔培養板內,生長匯合成單層內皮細胞后,去除蓋玻片中央1.5mm內皮細胞,制成創面。用裝有網格測微計的倒置相差顯微鏡觀測創面閉合速度,并計算某時刻創面閉合指數100×[1-(某時刻創緣間寬度/原始創緣間寬度)]。創緣間距離取3處不同點測量,重復3次,取平均數。

    1.2 細胞處理 內皮細胞生長匯合成單層內皮細胞后,分為實驗組和對照組,每組每種濃度復設12孔。實驗組分別在損傷前1h各加入終濃度為0.2μg/ml、0.4μg/ml、0.8μg/ml和1.2μg/ml的細胞松弛素B(Sigma公司),對照組加等量的培養基。該藥物于使用前用含20%FCS的DMEM配制,每2d換液1次并加相應濃度的細胞松弛素B。分別記錄不同濃度藥物作用下創面閉合速度和時間,以及不同時刻創面閉合指數。

    1.3 微絲的熒光染色 分別于損傷前、損傷后不同時間取出培養板內的蓋玻片進行染色。以4%多聚甲醛+TritonX-100固定10min,0.1M甘氨酸處理10min,加rhodamine-phalloidin(1∶20,Molecular Probes)染色40min,PBS沖洗3次×3min,加甘油/PBS(1∶1)封片,熒光顯微鏡觀察、拍照。

    1.4  3 H-TdR摻入量測定 用含20%FCS的DMEM懸液以0.2×10 5 /ml細胞密度接種于24孔板,培養至匯合,換成無血清DMEM培養24h后分為實驗組和對照組,每組每種濃度復設12孔。實驗組于損傷前1h每孔加濃度為1.2μg/ml的細胞松弛素B,而對照組于損傷前后不加藥物,分別于損傷后8h、24h及48h收集樣本。在收集樣本前4h加1μci/孔的 3 H-TdR。自動液閃爍記錄儀測定樣本 3 H-TdR的每分鐘脈沖數(CPM)。

    1.5 統計學方法 數據以(ˉx±s)表示,并對數據進行方差分析和t檢驗

    2 結果

    2.1 單層內皮細胞損傷修復過程中細胞形態及微絲骨架的改變 內皮細胞接種至培養板后,4~5d生長匯合成單層內皮細胞,細胞呈典型的鵝卵石樣外觀,呈緊密連接,無重疊。此時微絲骨架主要分布在細胞膜下的致密周圍帶和核旁中央束,見圖1。單層內皮損傷后3h左右,內皮細胞開始呈極性鋪展,伸長并向創區遷移。此時致密周圍帶開始減少,微絲發生重排,大多朝向創緣呈極性排列,見圖2。24h后致密周圍帶大部分消失,中央出現張力纖維。

    圖1  正常內皮細胞微絲分布熒光照片

    圖2  創緣內皮細胞微絲分布熒光照片

    2.2 細胞松弛素B引起的微絲骨架改變及對創面閉合的影響 當以0.2μg/ml細胞松弛素B處理細胞時,可使致密周圍帶消失,中央束減少。此時內皮細胞向創區遷移明顯被遲滯,平均速度為(13.1±4.1)μm/h,而對照組平均速度為(23.3±3.5)μm/h,明顯慢于正常對照組(P<0.05,n=12)。隨著細胞松弛素B濃度的增加,創面閉合速度也變慢,對創面閉合指數的影響呈時間—劑量依賴性,見圖3。當以1.2μg/ml細胞松弛素B處理細胞時,微絲結構被破壞,并聚集成致密片狀物。此時單層內皮細胞失去緊密鵝卵石樣外觀,出現細胞間隙,呈不規則扁平狀。

    2.3 阻斷微絲功能對內皮細胞 3 H-TdR摻入量的影響 損傷后8h,實驗組內皮細胞的 3 H-TdR摻入量與對照組比較差異無顯著性(P>0.05,n=12)。傷后24h及48h,內皮細胞的 3 H-TdR摻入量比傷后8h顯著升高(P<0.05,n=12),而以細胞松弛素B處理的細胞則表現出明顯的抑制作用,見圖4,與對照組相比,差異有非常顯著性(P<0.01,n=12)。

    3 討論

    創傷愈合過程是對損傷的一種含有多種細胞活動的有序反應。內皮細胞是愈合的主要修復細胞,內皮細胞的遷移、增殖及新血管形成是創傷愈合的基礎,許多因子均參與了這個過程的調節 [1] 。內皮細胞的許多功能都與細胞骨架有關或通過細胞骨架介導的 [4] 。細胞骨架與細胞質膜上的蛋白質分子相互連接而成為細胞形態支持、細胞間黏附、細胞運動和跨膜信息傳遞的基礎。修復過程中,調節因子如細胞因子、炎性介質等可以通過誘導細胞骨架變化對內皮細胞功能進行調節,從而影響修復過程的調控。本實驗以單層內皮細胞損傷模型,研究了內皮細胞在修復過程中其微絲骨架的形態與結構變化,并觀察阻斷微絲功能對創面愈合及細胞增殖的影響。結果表明,內皮細胞的遷移、伸展和增殖伴隨著微絲骨架特殊而有序的改變。伸展和遷移的內皮細胞中致密周圍帶明顯減少,微絲發生重排,并朝向創緣方向排列。當以細胞松弛素B破壞微絲結構時,

    圖3  細胞松弛素B對創面閉合的時間—劑量依賴關系曲線
   
    圖4  阻斷微絲功能對損傷單層內皮細胞 3 H-TdR摻入量的影響與對照組相比, * P<0.05;與損傷后8h相比(n=12), ** P<0.05

     可不同程度地抑制創面閉合及細胞的增殖,并呈一定的時間—劑量依賴關系。提示:微絲功能在內皮細胞損傷修復過程中起重要作用,可能通過直接或間接效應影響DNA合成,參與修復過程的調節。  微絲系統的重要功能之一是為細胞間黏附,細胞與基質黏附以及各種細胞運動提供所需動力 [5] ,其動力來源于動力蛋白及ATP酶,并需Ca 2+ 、Mg 2+ 的參與。向創區移行、伸展的細胞致密周圍帶明顯減少,可能為降低細胞間緊密連接和細胞間黏附,減少內皮細胞維持緊密單層細胞的能力 [6] ,從而有利于細胞的運動。而且微絲也發生重排,從不規則方向到沿細胞運動軸向排列,其作用可能是細胞移行時指引胞體向前牽拉并錨于粘著斑上 [7] 。細胞骨架系統對愈合過程中細胞的分化、增殖可能起重要的調節作用。創傷時,內源性生長因子、炎性介質或其它調節因子作用于細胞膜,通過膜中相應受體或蛋白質引起細胞內cAMP、IP3以及Ca 2+ 、CaM等第二和第三信使系統鏈鎖反應,激活蛋白激酶類 [8] ,最后調節到細胞骨架系統及其結合蛋白質上,使細胞骨架系統按細胞生理和周期的需要,發揮其獨特的功能,參加細胞的活動。調節因子還可能通過膜表面的整合素(integrin)跨膜與細胞內的微絲系統發生聯系 [9] ,將胞外刺激信號傳給膜下微絲系統,繼續傳導至核膜及核內骨架,調控基因表達,從而影響細胞的分化、增殖及細胞行為的改變。因此,對細胞骨架系統在創傷修復過程中作用的不斷認識,將有助于進一步理解創傷愈合過程的調控機制。

    參考文獻

    1 Gotlieb AI,Langille BL,Wong MKK,et al.Structure and function of the endothelial cytoskeleton.Lab Invest,1991,65:123.

    2 Jaffe EA,Nachman RL,Becker CG,et al.Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins.J Clin Invest,1973,52:2745.

    3 Burk RR.A factor from a transformed cell line that affects igration.Proc Natl Acad Sci USA,1973,70:369.

    4 Luna EJ,Hitt AL.Cytoskeleton-plasma membrane interactions.Sci-ence,1992,258-955.

    5 Singer I.Association of fibronectin and vinculin with focal contacts and stress fibers in vascular endothelial cells in vivo.Science,1983,219: 867.

    6 Shasby MD,Shasby SS,Sullivan JM,et al.Role of endothelial cy-toskeleton in control of endothelial permeability.Circ Res,1982,51:657.

7 Burkley IK.Fine structural and related aspects of nonmuscle-cell motil- ity.Cell Muscle Motil,1981,1:137.

    8 Volberg T,Geiger B,Citi S,et al.Effect of protein kinas inhibitor H-7on the contractility,and membrane anchorage of the microfilament sys-tem.Cell Motil Cytoskeleton,1994,29:321.

    9 Miyamoto S,Teramoto H,Coso O,et al.Integrin function:molicular hi-erarchiea of cytoskeletal and signal molecules.J Cell Biol,1995,131:791.

    (編輯海 鷹)

    作者單位:200052上海解放軍85醫院整形外科


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