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調控基因表達的 miRNA

來源:科學通報 作者: 2006-12-21
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摘要: microRNAs(miRNAs)是一類長約22核苷酸的非編碼的單鏈RNA分子,它們廣泛存在于從植物、線蟲到人類的細胞中。1993年,Lee等人用經典的定位克隆的方法在線蟲(C。elegans)中克隆了lin-4基因,并通過定點突變發現lin-4并不編碼蛋白,而是產生一種小RNA分子。這種小RNA分子能以不完全互補的方式與其靶mRNA的3‘非翻譯端的特定區......


  micro  RNAs  (miRNAs)  是一類長約22核苷酸的非編碼的單鏈  RNA  分子,它們廣泛存在于從植物、線蟲到人類的細胞中。最早發現的是  lin-4  和它的靶  mRNA,即  lin-14。1993年,Lee  等人用經典的定位克隆的方法在線蟲  (C.  elegans)  中克隆了  lin-4  基因,并通過定點突變發現  lin-4  并不編碼蛋白,而是產生一種小  RNA  分子。這種小  RNA  分子能以不完全互補的方式與其靶  mRNA  的3'非翻譯端的特定區域相互作用來抑制  lin-14  的表達,最終導致  lin-14  蛋白質合成的減少,這種現象叫做轉譯抑制。通過轉譯抑制,  lin-4  控制著  C.elegans  幼蟲由  L1  期向  L2  期的轉化。為什么一個只有22  nt  的  RNA  分子起著如此重要的調節作用?當時人們無法解釋,只能認為是一種稀少的個別現象。但是,2000年第2個  miRNA  let-7  及其人類和果蠅中同源物的發現改變了人們的看法,  miRNA  可能是一類進化上保守的、在生命中起著重要調控作用的分子。它們能有效地抑制相關蛋白質的合成,導致靶  mRNA  的降解,或者其他形式的調節機制來抑制靶基因的表達,產生基因沉默。近年來發現  miRNA  可能在基因表達調控領域中起著超乎想象的重要作用,miRNA  序列、結構、豐度和表達方式的多樣性,使其可能作為蛋白質編碼  mRNA  的強有力的調節子。miRNA  的發現豐富了人們對蛋白質合成控制的認識,補充了在  RNA  水平對靶  mRNA  分子進行更迅速和有效的調節,展現了細胞內基因表達調控全方位多層次的網絡系統。miRNA  的發現也是對中心法則中  RNA  次要的中介角色的重要補充,它將促使生物學家重新思考細胞遺傳調控及其發育等方面的重要問題。  



1  miRNA  的產生  



  迄今為止,在植物、線蟲、果蠅和哺乳動物中已發現了一千多個  miRNA  基因(見表1)。這些  miRNA  基因首先在細胞核內轉錄成前體轉錄本  (pri-miRNA),并被加工成前體  pre-miRNA,然后被轉運到細胞質被加工成成熟的  miRNA  (見圖1)。Lee  等人第一次證明一大類  miRNA  由多聚酶Ⅱ  (Pol  Ⅱ  )轉錄,而且一些  miRNA  的轉錄本(如  let-7  )具有5'帽和3'  poly(A)  的結構,Pol  Ⅱ  的抑制劑能夠抑制  pri-miRNA  的積累,而  Pol  Ⅱ  能與  miRNA  的啟動子免疫共沉淀。Rodriguez  等人在基因組水平對  miRNA  的轉錄也進行了分析,哺乳動物中由內含子編碼的  miRNA,其轉錄酶應該是  PolⅡ,Rodriguez  等人檢測的  miRNA  與90個蛋白編碼基因有關。但是并不能排除  miRNA  還有其他多聚酶,尋找與  miRNA  相關的其他聚合酶還有待進一步的研究。Pri-miRNA  在核內被  RNase  Ⅲ  核酸酶  Drosha  加工成長約70  nt  的發夾狀的  pre-miRNA。最近的報道指出,Drosha  和另外的一些成分(如人類中的  DGCR8  蛋白、果蠅中的  Pasha  蛋白)構成一個微小  RNA  處理器  (microprocessor)  的復合體,pri-miRNA  在這個  microprocessor  中被加工成  pre-miRNA。關于在  pri-miRNA  之前  miRNA  基因的轉錄本是如何加工的,人們所知甚少。線蟲  miRNA  基因  let-7  前體是一個相對較長,且具有  poly(A)  結構,Bracht  等人發現  let-7  轉錄本經歷一個反式剪輯  (trans-splicing)  的過程,生成一個叫做  SL1RNA(spliced  leader1)  的中間體。pre-miRNA  在  Exportin5  的幫助下從核進入胞質內,這個過程還需要一個  G  蛋白因子  Ran  參與。能與  exportin5  結合的  pre-miRNA  必須具有大于16  nt  配對的莖和3'末端有2個懸垂堿基的結構特點,末端如果是5'懸垂堿基將會抑制  exportin5  對它的轉運。胞質中  pre-miRNA  在  Dicer  酶的作用下,被切割成雙鏈的  miRNA:miRNA*  配對分子,然后成熟的  miRNA  分子被解鏈,單鏈的  miRNA  進入一個核糖蛋白復合體  miRNP  (也叫  RISC),miRNA  通過與靶基因的3'  UTR  區互補配對,指導  miRNP  復合體對靶基因  mRNA  進行切割或者翻譯抑制。  



2  尋找  miRNA  基因  



2.1  克隆方法尋找  miRNA  基因  



  2001年  miRNA  研究開始飛速發展。Lagos-Quintana  等人設計出一種專門克隆小片段  RNA  的方法(見圖1(a)),在2  h  的果蠅胚胎的裂解液里和  Hela  細胞的總  RNA  中克隆了37個新的  miRNA  基因。Lau  等人用稍微改進的克隆方法在線蟲中找到了55個  miRNA  基因。Lee  等人運用生物信息學和  cDNA  文庫相結合的方法找到了13個  miRNA。隨后掀起了尋找  miRNA  基因的熱潮。Lagos-Quintana  等人繼續他們尋找  miRNA  基因的工作,2002年和2003年用同樣的方法分別在小鼠和人特異組織中克隆了34和31個新的  miRNA,并提出由于在克隆中已知的  miRNA  重復出現和  rRNA  的干擾,用同樣的克隆方法找到新的  miRNA  會越來越難,這與后來  Lim  等人用  MiRscan  計算機程序估計人類中只剩下40個未知  miRNA  基因的結論一致。近來,尋找  miRNA  的方法越來越成熟,Ambros  等人對克隆尋找  miRNA  的方法進行了總結。  



  繼而,人們將尋找  miRNA  基因的目光轉向特異的組織和發育的特異階段。Mourelatos  等人用小片段克隆的方法在  HeLa  細胞中克隆了31個  miRNA,Houbavity  等人在小鼠  ES  細胞中克隆了15個  miRNA,Dostie  等人和  Kim  等人在哺乳動物神經細胞中分別找到了53和40個  miRNA,Ambros  等人在線蟲中又找到21個  miRNA,Aravin  等人在果蠅的不同發育階段找到了63個  miRNA,Wang  等人在秈稻中找到了20個  miRNA  基因。Pfeffer  等人在  EB  病毒的基因組中,找到5個編碼  miRNA  的基因,這為  miRNA  基因家族添加了病毒中的成員。最近研究人員又在另3種病毒中找到了29個病毒  miRNA。Suh  等人在人胚胎干細胞中找到了36個  miRNA  基因,這些  miRNA  隨著胚胎的發育表達量逐漸減少。Seitz  等人在人的  14q32  區域找到46個  miRNA  基因,發現它們多數在人的胚胎中表達,只由母性染色體表達,并且受到上游200  kb  處的一個甲基化區域  (IG-DMR)  調節。Kasashima  等人運用克隆的方法檢測了  TPA  誘導人白血病細胞  HL-60  分化前后  miRNA  表達譜的變化,找到了3個新的  miRNA,并發現不同  miRNA  在分化前后表達量不同。現在科學家們已在不同的種屬中克隆了大量的新  miRNA  基因。  



2.2  檢測  miRNA  表達的方法  



  檢測  miRNA  最常用和直接的方法是  Northern  雜交,除此之外,還有  RT-PCR,液相雜交和基因芯片技術等。Lee  等人通過  Drosha-siRNA  下調  Drosha,抑制  pri-miRNA  的加工,再用  RT-PCR  的方法檢測  miRNA  的表達。Sempere  等人通過  Northern  雜交的方法對已知的119個  miRNA  基因的表達做了檢測,發現有一些是在特異的組織表達,有一些只是在不同組織的表達量不一樣,而在腦組織表達的  miRNA  的作用方式表明這些  miRNA  與腦神經元的分化相關。  Allawi  等人將熒光方法引入  miRNA  的研究中,設計出一種新的方法叫“Modified  Invader”分析,可快速而靈敏地分析  miRNA,能從50~100  ng  總  RNA  或者是1000個細胞的裂解液中檢測到目的  miRNA。  



  miRNA  基因芯片技術是一種更理想的快速有效的檢測  miRNA  表達圖譜的方法。這一方法被  Liu  等人首次報道用來檢測  miRNA  在不同腫瘤細胞中的表達圖譜,245個哺乳動物的  miRNA  被檢測了,結果的重復性很好,而且被  Northern  雜交、RT-PCR  所證實。之后,Esau  等人運用  miRNA  芯片技術,檢測細胞內的  miRNA  表達圖譜,并且找到了  miR-143  和它的靶基因。Calin  等人通過  miRNA  芯片技術,比較了哺乳動物中  B  細胞淋巴瘤和正常細胞中  miRNA  的表達圖譜,為  miRNA  在腫瘤臨床應用中,提出了新的思路。Miska  等人運用  miRNA  芯片檢測了小鼠腦發育中138個  miRNA  基因的表達圖譜。在芯片的基礎上,Nelson  等人發展出一種叫做  RAKE  (RNA-primed,array-based  Klenow  enzyme  assay)  的方法能夠在特定的細胞和腫瘤中同時檢測所有的  miRNA  的表達圖譜。  



  原位雜交技術用來檢測  miRNA,更直觀的展示出  miRNA  的表達方式,是了解  miRNA  的時空表達譜更方便的方法。Johnson  等人通過在  let-7  啟動子后加  GFP  基因來跟蹤檢測線蟲中  let-7  的時空表達。  Mansfield  等人根據  miRNA  的作用機制設計出一種帶  Laz  報告基因的檢測方法,被叫做“miRNA  sensor”,能特異的從原位檢測到  miRNA  的表達。  



2.3  計算機軟件預測  miRNA  基因  



    miRNA  是由一個約70  nt  的莖環結構前體而來,并且在進化上是保守的,因此可用計算機的方法來識別。  



  MiRscan  是一個能特異的識別2個物種間的同源序列的程序。Lim  等人用它在  C.elegans  和  C.  briggsae  中尋找到同源的發卡結構,通過已知  miRNA  的訓練后,它去給那些發卡結構片段打分,以預測線蟲中的  miRNA。Lim  等人用同樣的方法,在脊椎動物里尋找  miRNA  基因,并預測出人的  miRNA  基因數在200~255之間,這個數字大約是人類基因組的1%。2004年,MiRscan  程序又被用來檢測了線蟲中  miRNA  基因上下游序列的同源性,和內含子中產生  miRNA  的寄主基因的同源性  (host  gene),并且找到了一個非常一致的序列模塊,運用這個不斷改進的  MiRscan,又在線蟲中發現了9個  miRNA,并被  PCR  實驗所證實。  



  MiRseeker  是根據  miRNA  的3個特點開發出來的:(i)  miRNA  的保守性,需要形成一個70~100  nt  的前體;(ii)  在相似的物種中,miRNA  是很保守的;(iii)  在相距較遠的物種間,miRNA  是有一定的分歧的。它包括以下3個步驟:(i)  通過  AVID  尋找果蠅中基因間的保守的序列;(ii)  通過  mfold  辨認此序列是否能形成保守的莖環結構,并給這個結構打分評價;(iii)  評價  miRNA  在不同物種中的分歧模式。最后,miRseeker  也需要通過生物化學的方法,加以驗證。  



  Legendre  等人用“ERPIN”代替“blast”從基因組中搜尋與已知  miRNA  類似的  miRNA  基因,輸入已知  miRNA  軟件可以根據已知  miRNA  的結構從基因組中搜尋到結構類似的候選  miRNA  基因。  



  除了專門用于尋找  miRNA  基因的程序和軟件外,象  mfold  和  Srnaloop  是  RNA  折疊中常用的軟件。Hofacher  等人報道在維也納  RNA  網站  (http://rna.tbi.univie.ac.at/)  提供了一個界面能夠調用多個常用的  RNA  二級結構預測軟件。  



2.4  miRNA  的命名及  Rfam  數據庫  



  miRNA  種類越來越多,而且在研究中發現,很多  miRNA  是同源的,為了防止  miRNA  的混淆,最初的研究者就給發現的  miRNA  作了命名規則:  



  (i)  miRNA  簡寫成  miR-No.,它的基因簡寫成  mir-No.;  



  (ii)  高度同源的  miRNA  在  No.  其后加英文字母(小寫,一般從  a  開始);  



  (iii)  多基因拷貝的再在后面加  -No.  (如  miR-2a-1)。  



  之后人們又對命名規則作了補充。不同物種中同源的  miRNA  最好用同一個名字;如果一個前體的2個臂分別產生1個  miRNA,則根據克隆實驗,看看哪個是主要的成熟產物,次要的在后面加“*”號,如  miR-56  和  miR-56*  (*表示量少的);如果不能區分表達量的多少,可以如下表達,如:miR-142-5p  (表示在5'端的臂,以前有人用  miR-142-s)  和  miR-142-3p  (表示3'端的臂,以前有人用  miR-142-as)。在  Rfam  數據庫中,在每個  miRNA  名稱前加上了物種的名稱,如:hsa-miR-138。植物中  miRNA  的基因用斜體表示,如  MIR156。  



  為了更好地管理  miRNA,方便人們查詢,研究者們建立了  miRNA  的數據庫  http://www.sanger.ac.uk/  Software/Rfam/mirna/。現在這個數據庫已經更新到了6.0版本(2005年4月),共有1650個  miRNA  (見表1)。  Rfam  只有在文章發表后才給新發現的  miRNA  一個確定的名字,在發表前作者可以用一個臨時的名字命名送審。  



3  miRNA  的靶基因  



  雖然現在已經找到了過千個  miRNA,并提出它們在細胞增殖、分化、代謝與死亡中發揮著重要的調節作用,但是至今為止,真正確認功能的  miRNA  還是微乎其微。從1993年發現第1個  miRNA  到現在,在動物中發現的確認功能的  miRNA  不超過10個(見表2)。  



3.1  基因篩選和定位克隆尋找  miRNA  靶基因  



  通觀科學家們尋找  miRNA  及其靶基因的方法發現,現在已知靶基因的  miRNA  多是通過傳統的基因篩選  (gene  screen)  和定位克隆的方法發現的(見圖2)。Brennecke  等人發現  bantam  基因及其靶基因  hid,包括典型的如下幾個過程:(i)  Bantam  基因表達  miRNA  的證據:(1)  通過插入突變,找到  bantam  這個位點,能夠促進組織過度生長;(2)  bantam缺陷的個體,具有生長缺陷或者是蛹化期致死;(3)  在  2  個物種間比對  (在  Drosophila  與  Anopheles  用  Clustal  W  程序比對),發現一個約90  nt  的區域非常相似,有  30/31  nt  是相同的,再用  mfold  進行預測發現2個物種內的這段區域能形成相似的穩定的發卡結構;(4)  用這31  nt  作探針,通過  Northern  雜交在野生和  Gal4  誘導表達的  L3  期中找到這個21  nt  RNA  和它的更大的前體。(ii)  證明  hid  是  bantam  的靶基因的過程:(1)  用計算機預測的方法找到前凋亡基因  hid  的3'  UTR  區,有3個能與  bantam  作用的靶點,而且直接觀察發現還有2個靶點;(2)  對比這些3'  UTR  區在2個物種的同源性  (D.pseudoobscura  與  D.melanogaster),發現它們高度同源;(3)  表達報告基因  tubulin-EGFP,在它的末尾連上  hid  的3'  UTR  區的靶點,同時轉入  EP  表達的  bantam,發現  GFP  熒光明顯下降,而且5個靶點同時存在的效果要比單個的好;(4)  同時表達  bantam  和  hid,通過原位雜交,能檢測內源表達的  hid  也能被  bantam  抑制。根據一個  miRNA  可能調節多個靶基因的觀點,發現  bantam  能夠促進細胞的增殖,很可能  bantam  還具有一個細胞增殖負調控的靶基因。  



  Chen  等人的方法略有不同。他們先用  miRNA  的  cDNA  克隆的方法在小鼠骨髓中克隆了100多個  miRNA,并且特別的研究了其中3個的功能。結果發現在造血干細胞中異位表達  miR-181  能夠促進造血干細胞的定向分化,但是沒有找到它的靶基因。Xu  等人通過  P  插入元件找到突變子,發現具有死亡抑制的功能,并證明編碼  miR-14。通過功能缺失和異位表達的方法,證明  miR-14  有著抑制  reaper  導致的細胞死亡和參與脂肪代謝的功能。實驗提出  miR-14  可能的靶點是  Drice,但沒有直接的證據證明。  



3.2  計算機程序對靶基因的預測  



  從已有的資料看來,傳統的方法尋找  miRNA  的靶基因比較艱難,由于目標不明確,效率較低。研究人員想到用生物信息學的方法來取代大量的分子克隆的工作,并且獲得很好的目的性。  



  Stark  等人的方法是首先構建一個在  D.melanogaster  和  D.pseadoobscura  中保守的3'  UTR  數據庫,能覆蓋  D.melanogaster  三分之二的基因。用  HMMer  比對程序,找到能與  miRNA  前8個堿基配對的3'  UTR  靶序列;然后再用  mfold  對整個  miRNA:  mRNA  靶序列進行動力學檢測,并給出  AG  值;最后計算  Z  值,取  Z≥3  作為篩選靶序列的閾值。通過這一程序成功的在數據庫里找到5個已知的  miRNA  和它們的靶基因,同時預測出3個新的  miRNA  和它們的靶基因:miR-7  和  Notch,miR-2  和前凋亡基因、  miR-277  和代謝酶類(但隨后的生物學實驗證據并不強)。結果可在  http://www.russell.embl.de/miRNAs  查詢。  



  Enright  等人開發出一種計算機預測的方法:先從  D.melanogaster  和  D.pseadoobscura  中通過  blastn  和  AVID  比對構建出3'  UTR  序列庫;然后用  MiRanda  算法評價,MiRanda  是一個類似于  Smith-Whatman  的算法,但它是用來檢測互補配對的(其中允許  G  :  U  配對),此外這一算法還加入了  RNA  二級結構預測的程序(來源于  RNAlib  ),能夠從動力學角度預測  miRNA  :  靶  mRNA  的穩定性;再將前面的結果在3種生物中檢驗保守性  (D.melanogaster,D.pseudoobscura  和  A.gambiae),最后給出  S  值和  ΔG  值。這個方法考慮了以下幾個特點:(i)  局部位置的互補比對;(ii)  RNA-RNA  雙鏈自由能的預測;(iii)  靶位點的保守性。結果顯示,靶基因多是發育階段特異表達的、與細胞分化、形態、發育協調相關的基因,而且有很多是轉錄因子。其中,作者提出3'  UTR  調節很類似于轉錄中的5'  promoter  的調節,這說明在這2個機制之間可能有一定的聯系。結果可在  http://WWW.microrna.org  查詢。  



  Lewis  等人開發了一個計算機預測的方法——TargetScan  法,用來預測哺乳動物內  miRNA  的靶基因。這一方法基于2點考慮:(i)  考慮  miRNA  :  mRNA  (靶向基因  mRNA  片段)雙鏈結構的穩定性;(ii)  檢測這些靶向基因  mRNA  的3'  UTR  區在不同物種間的保守性。此搜索方法重點強調了  miRNA  的第2~8個堿基,將這段序列作為搜索的“種子序列”,必須嚴格配對;然后用  RNAfold  程序向兩邊延展尋找配對的序列;通過  RNAeval  給出自由能  G  值;最后給出  Z  值和  R  值,Z  值越大,R  值越小,靶向的可能性就越大。通過對在人、小鼠、大鼠中保守的  miRNA  的搜索,找到了451個可能的  miRNA  靶向序列;通過對人、小鼠、大鼠、河豚4種動物中保守的  miRNA  搜索,找到了115個可能的靶向序列。結果可在網上查詢  http://genes.mit.edu/targetscan。  



  Kiriakidou  等人開發一個“DIANA-microT”  的程序,通過計算機的方法來預測哺乳動物中  miRNA  的靶基因。Rehmsmeier  等人開發了一個“RNA-hybrid”的程序,來預測果蠅的  miRNA  的靶基因,他們的信息公布在互聯網上  (http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)。PicTar  是由  Krek  等人開發的預測  miRNA  靶基因的軟件,他們搜索了8個脊椎動物物種的基因組和現有的  miRNA,它對靶基因預測具有較高的準確性。  



  John  等人運用  miRanda  軟件預測了218個哺乳動物的  miRNA  基因的靶基因,發現有2000個的哺乳動物的基因有著保守的3'  UTR  靶點,這些蛋白多數涉及轉錄因子、miRNA  機制本身相關的蛋白、泛素機制相關的蛋白,這些可能的靶蛋白說明  miRNA  的作用構建了一個反饋調控網絡,并且根據他們的預測,占基因組數量1%的  miRNA  基因可能調控著10%的基因組蛋白。預測軟件在互聯網上  (http://www.microrna.org)。  



  綜合人們用計算機的方法預測  miRNA  的工作,發現各種計算方法都具有如下的特點:(i)  miRNA  及其靶向序列的保守性;(ii)  miRNA:靶  mRNA  配對中5'端非常重要,其他位置允許  G  :  U  配對;(iii)  miRNA  與靶向基因可能是一對多的關系。通過計算機預測出的  miRNA  靶基因,如表3所示。  



4  miRNA  的作用機制及功能  



4.1  miRNA  的作用機制  



  miRNA  轉錄前體  (Pri-miRNA)  首先在核內被  Rnase  Ⅲ  核酸酶  Drosha  加工成約70個核苷酸長的發夾狀的  RNA,在  Exportin5  的幫助下從核內進入胞質內,然后在  Dicer  酶的作用下,單鏈的  miRNA  進入一個核糖蛋白復合體  miRNP,David  將其與  RISC  等同。  miRNA  通過與靶基因的3'  UTR  區互補配對,指導  miRNP  復合體對靶基因  mRNA  進行切割或者翻譯抑制。MiRNA  到底是抑制還是切割取決于  miRNA  與靶序列互補配對的程度,互補配對高的可能進行切割,而配對低的就只是抑制。植物的  miRNA  與靶基因配對程度高多數是進行切割,而動物中  miRNA  與靶序列的配對性不好,多數進行翻譯抑制。  



  線蟲中,lin-4  RNA  并不降低  lin-14  和  lin-28  的  mRNA  水平,但能降低它們的蛋白水平。Let-7  也通過與  lin-41  的3'  UTR  區配對,來抑制  mRNA  的表達,并不進行切割。現在普遍認為,細胞中的  miRNA  能與靶基因  mRNA  的3'  UTR  部分配對,指導  miRNP  對其翻譯的抑制。這與現在所知的真核基因的翻譯調控主要是在3'  UTR  區域的思想一致,最近  Xie  等人在人、小鼠、大鼠和狗的基因組比對分析指出,在3'  UTR  區域存在大量的調節結構域,而近一半的這些調節結構域與  miRNA  的調節有關。其中  miRNA  的5'端的2~8個核苷酸對于  miRNA  與3'  UTR  的配對非常重要。首先,miRNA  的2~8個核苷酸能很好的與靶序列配對;其次,靶序列在不同物種中通常保守;再次,miRNA  的2~8堿基在同源的  miRNA  中保守。因此,人們用此來預測  miRNA  的靶基因。miRNA  抑制  mRNA  的翻譯機制至今為止是個迷。David  提出2種可能性:(i)  在  mRNA  起始翻譯后,miRNA  通過與3'  UTR  作用抑制翻譯的進行,這樣可能可以通過檢測  mRNA  上的核糖體的密度而加以證實;(ii)  mRNA  的翻譯并不被阻止,但是翻譯的多肽不斷的被  miRNP  復合體,或者再結合別的蛋白復合體切割,當然這需要肽酶參與。這些機制的研究可以和  siRNA  的作用相結合起來,近來關于  Argonaute  蛋白  PAZ  結構域晶體結構的測定揭示了  RISC  與  RNA  結合的作用機制。當然  miRNA  抑制機制的揭示有待于  miRNA  領域的深入研究。  



4.2  miRNA  的功能  



  miRNA  是一種廣泛存在的對基因表達進行微調的分子.在人類基因組中  miRNA  基因占據大約1%的數量,雖然在不同的時空發育階段,它們的表達量不同,但是多種  miRNA  在同一個細胞中的表達使得細胞處在一種內在的  miRNA  環境中,這個環境控制著成千上萬的編碼基因的  mRNA  水平,使得各種蛋白的表達處在一個適合的水平。Bartel  等人將這些  miRNA  比作微型電阻,根據  miRNA  與靶基因互補的程度,執行從切割(100%抑制)到微弱抑制的不同的抑制作用。象  lin-4  作用于  lin14  和  lin28;let-7  作用于  lin41  和  hbl-1,起著明顯的表型改變,是在  miRNA  家族中為數較少的,更多的則是起著微調的作用。像  miR-7  和  miR-14  有著多個靶基因,它們從一個整體上起著介導某一功能的作用。由于有多個靶點,有些  miRNA  會有大量的表達,比如  miR-2  在一個細胞內有約50000個拷貝,這遠多于普通  mRNA  的表達量。通過芯片技術  Lee  等人研究了通過導入某些  miRNA  能夠導致上百個基因  mRNA  水平的下調,雖然并不能完全肯定所有的這些下調基因是由  miRNA  直接導致,但這給出了直接證據證明一個  miRNA  可以調控多個靶基因。另一些則是多個  miRNA  作用于一個靶基因上,而最近開發的同時檢測所有  miRNA  的表達圖譜的技術,使研究者能更方便地從整體上掌握特定的時空階段  miRNA  產生的生物學效應。miRNA  這種轉錄后微調的優點有如下幾點:  



  (i)  比從蛋白水平的調節更節省能量;  



  (ii)  相對于轉錄調節,miRNA  的效果更快而且是可逆的;  



  (iii)  對于一些只需微量蛋白改變的現象,只有通過  miRNA  來達到。比如對某種蛋白來說,1~2個  mRNA  拷貝就足以過量表達,這時就需要  miRNA  來調節控制蛋白的水平;  



  (iv)  內含子中編碼的  miRNA  是一種細胞內資源的高效利用。  



  就像前面提到的一樣,miRNA  主要通過抑制它的靶基因來起調控作用,至今為止沒有發現有上調能力的  miRNA。從表2和表3可以看出,miRNA  的作用遍及生命體的發生、生長、發育、分化和死亡的過程。  Lewis  等人的預測結果發現,預測的  miRNA  的靶基因多數是參與轉錄、信號轉導、腫瘤發生的基因。雖然  miRNA  的作用也是特異的,特別是5'端的2~8個堿基,特異性的靶向與它的靶基因,但是與  siRNA  不同的是  miRNA  的特異性并不是那么強,在生物體內往往一個  miRNA  作用于多個靶基因,如  lin-4  作用于  lin14  和  lin28,let-7  作用于  lin41  和  Hbl-1(見表2),這就是人們提出的“多個靶點”的假說。人們也提出可能多個  miRNA  調控一個靶基因。因此,miRNA  的調控作用很可能是一種調控網絡,它需要接受某些信號的刺激,從整體上調控有機體的生命活動。  



  miRNA  的研究現在還處在理論水平上,討論關于  miRNA  的應用還為時過早,但  miRNA  作為體內正常表達的基因,是否與人類疾病和植物培育相關,還有待進一步的研究。以  miRNA  為靶點或者以  miRNA  為治療手段的設想,以后可能會成為焦點。而  Calin  等人報道的  miRNA  基因芯片技術也很可能成為腫瘤診斷的工具。Suh  等人報道,在人胚胎干細胞中表達的  miRNA  與其他細胞類型的  miRNA  有很大的不同,miRNA  作為人器官定向分化的調節子,為以后人器官體外培植帶來促進作用。miRNA  作用和功能的揭示必定給  miRNA  的應用帶來廣闊前景。  



5  展望  



  自從在四膜蟲中發現核酶以來,引起了整個生物學界對  RNA  及其作用的關注,也讓人們就生命起源的問題爭論了十幾年。在人們對生命由  RNA  起源的爭論降溫的時候,1998年,Fire  等人報道在線蟲中發現了  RNAi  的現象,重新又將人們的視線轉到  RNA  上來。RNAi  是一個強大而特異的基因沉默機制,可成為研究基因功能和疾病治療的有用工具,這是生物研究領域里的一個突破性研究成果。miRNA  研究的飛速發展也得益與  RNAi  的發現。但與此不同的是,miRNA  是生物體內源的小  RNA  分子,研究表明它們在生物體內不僅僅是代謝的產物,而是機體有目的編碼的重要的調控分子。它們參與生物體的生長、發育、衰老、死亡的調控。隨著研究的深入,  miRNA  將在生命起源和物種進化、基因表達調控的復雜性、疾病發生和發展的機制等方面起到更為深遠的作用。同時,miRNA  的研究亦將為  RNAi  技術的應用提供新的依據、思路和空間。現在,歐美等發達國家已將有關  miRNA  的研究廣泛而深入地運用到組織器官的定向發育,細胞生長分化的時空調節,信號通路的開啟和關閉,細胞周期的監測與調控、學習與記憶,腫瘤的逆分化、肥胖、衰老和死亡,疾病的防治以及有目的的基因表達調控上。  



  尋找調控的  miRNA  基因以及  miRNA  的靶基因,揭示  miRNA  具體的作用機制是非常重要的。就目前的研究來看,雖然在各個物種中發現的  miRNA  數量不少,但是能給出直接證據證明  miRNA  的靶基因及其功能的  miRNA  很少,而且多數是通過篩選突變子獲得的,這說明現在尋找  miRNA  基因的研究與它功能的研究是脫節的,也證明人們通過現有方法得出的  miRNA  的一些觀點可能存在問題(如人類  miRNA  上限為255個的報道)。現在擺在科學家們面前的兩大問題就是:在各種生物中找齊這些  miRNA  和找到它們的靶基因并揭示它們的功能,這也可以說是后基因組時代需要解決的問題之一。當然結合  RNAi  和生物信息學的方法會使  miRNA  功能的研究更簡便,而且有可能開辟一條共同的研究路線,逐一找到  miRNA  的靶基因并揭示它們的功能。由于  miRNA  基因對于生物的生長,發育,分化非常重要,而且具有特異的時空表達的特點,人們可以設計出  miRNA  的檢測芯片,在不同的生物、不同的發育時期、不同的組織細胞內,檢測  miRNA  的表達圖譜,更精確地掌握生命發展調控的過程。全部  miRNA  基因功能的揭示可能將會給人們對生命現象的理解帶來一場新的革命。  



        注:

        (1)參考文獻:略;需者可與本站Email聯系,或到中國水稻研究所圖書館查閱;

        (2)文章來源:科學通報,2005年  第50卷  第13期;

        (3)作者單位:中國科學院生物物理研究所  等。

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