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microRNA 及其在植物生長發育中的作用

來源:植物生理學通訊 作者: 2007-1-7
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摘要: 自從牽牛花中發現小分子干擾RNA(smallinterferenceRNA,siRNA)以后,人們又相繼在粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、布氏錐蟲(Trypanosomabrucei)、秀麗新小桿線蟲(Caenorhabditiselegans)、果蠅(Drosophilamelanogaster)、Hela細胞、斑馬魚(Brachydaniorerio)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)和水稻(Oryzasativa)等......


自從牽牛花中發現小分子干擾  RNA  (small  interference  RNA,siRNA)以后,人們又相繼在粟酒裂殖酵母(  Schizosaccharomyces  pombe  )、布氏錐蟲(  Trypanosoma  brucei  )、秀麗新小桿線蟲(  Caenorhabditis  elegans  )、果蠅(  Drosophila  melanogaster  )、Hela  細胞、斑馬魚(  Brachydanio  rerio  )、擬南芥(  Arabidopsis  thaliana  )和水稻(  Oryza  sativa  )等許多真核模式生物中找到了數百個有功能的非編碼小分子  RNA,并將這些小分子  RNA  分為  microRNA  (miRNA)、siRNA、tiny  non-coding  RNA(tncRNA)  和  small  modulatory  RNA(smRNA)  四大類,其中  miRNA  是當前研究比較深入的一類小分子  RNA(Kim  2005)。  



lin-4、let-7  是最早在秀麗新小桿線蟲中發現的長約22  nt  的  miRNA(Lee  等1993;Reinhart  等2000)。當時,人們將這種具有時間表達特異性的小分子  RNA  稱為小分子時序  RNA  (  small  temporal  RNA,stRNA  ),隨后又將這類長度為  19~25  nt  的非編碼小分子  RNA  命名為  microRNA,即  miRNA。Reinhart  等(2002)從擬南芥小分子文庫中獲得16個  miRNA。盡管植物  miRNA  的發現比動物  miRNA  晚10年,但由于鑒定方法的不斷發展,因而植物  miRNA  的報道數量呈幾何級數增長。miRNA  廣泛分布于植物基因組中,它是真核生物基因表達的一類負調控因子,主要在轉錄后水平上通過介導  mRNA  靶分子的切割或降低靶分子的翻譯來調節植物基因的表達,從而調控植物器官的形態建成、生長發育、激素分泌與信號轉導以及植物對外界環境脅迫因素的應答能力。  



1  植物  miRNA  的特征  



目前,對  miRNA  的鑒定主要有計算機  RNA  組學和實驗  RNA  組學2種方法。人們采用基于計算機軟件分析的計算機  RNA  組學方法和基于小分子  RNA  的  cDNA  文庫構建和測序的實驗  RNA  組學方法已經在植物中發現了數百個  miRNA,在這些植物  miRNA  中有863個已經登入  miRNA  數據庫(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/),它們分別屬于67個  miRNA  基因家族(  Griffiths-Jones  等2006;Zhang  等2006)。  



隨著  miRNA  研究的不斷深入,人們發現  miRNA  基因以單拷貝、多拷貝或基因簇(  cluster  )的形式廣泛存在于真核生物基因組中,且大部分位于基因間隔區(  intergenic  region,IGR  ),也有相當一部分位于編碼蛋白基因的內含子中(  Baskerville  和  Bartel  2005)。和動物  miRNA  一樣,植物  miRNA  無開放閱讀框且表現出進化上的保守性,由含有發夾結構的前體剪切加工而來,通常其前體的自由能比較低(-239~-134  kJ•mol-1)(  Bonnet  等2004)。成熟的  miRNA  長度為  19~25  nt,5'  端帶有磷酸基團且多為尿嘧啶核苷酸,3'  端帶有羥基,因而  miRNA  能與大多數寡核苷酸和功能  RNA  的降解片段區分開來(  Lau  等2001:Lee  和  Ambros  2001)。大多數植物  miRNA  還呈現出組織特異性表達和發育階段特異性表達的特點,且具有調控自身轉錄的機制。盡管植物  miRNA  與動物  miRNA  之間存在著諸多共同特征,但兩者也有一些明顯不同的特征:(1)植物  miRNA  雖然比較保守,但僅是成熟的植物  miRNA  才表現出進化上的保守性。這一點與動物  miRNA  不同,動物  miRNA  則無論是其前體還是成熟的  miRNA  都表現出保守的特性(  Reinhart  等2002)。(2)植物  miRNA  前體的長度變化較大,一般為60~342  nt,有的超過1  kb;而動物  miRNA  前體為60~80  nt。成熟的植物  miRNA  長度為20~24  nt,動物  miRNA  為20~22  nt(  Millar  和  Waterhouse  2005)。(3)植物  miRNA  和動物  miRNA  成熟所需要的一些關鍵蛋白質不同。植物  miRNA  成熟加工需要  Dicer-like  1  (DCL  1)、Hasty(HST)、Hyponastic  leaves  1(HYL1)  和  Hua  enhancer  1(HEN1)  蛋白等,而動物  miRNA  則需要  Drosha、Dicer  和  Exportin-5  蛋白等。植物中  DCL1  酶在細胞核內將  miRNA  前體(pre-miRNA)切割成  miRNA:miRNA*  雙體,然后由  HST  蛋白將其轉運到細胞質中進行進一步的加工。在動物中,這一步驟卻由  Exportin-5  蛋白直接將  miRNA  前體從細胞核轉運到細胞質中,緊接著由  Dicer  酶進一步加工(Papp  等2003;Bartel  2004;Lund  等2004)。(4)與動物  miRNA  不同的是,植物  miRNA  與靶基因的結合位點不僅限于靶基因的3'非翻譯區(untranslated  region,UTR),還可以位于轉錄區域。此外,植物  miRNA  與其靶基因序列具有更高的互補性。目前發現多數植物  miRNA  與其靶基因幾乎完全可以互補,因此就可以較容易預測出它們所作用的一系列可能的靶標,而動物  miRNA  與其靶基因不完全配對(Llave  等2002a)。大多數情況下,植物  miRNA  作用的靶標主要是一些在植物生長發育過程中起作用的轉錄調控因子,而動物  miRNA  不但能調控一些轉錄因子,還可以對物質代謝、細胞周期、細胞分化和凋亡以及個體發育等一系列生命活動進行調節(Jover-Gil  等2005)。  



2  植物  miRNA  的功能  



2.1  miRNA  與植物的生長發育  miRNA  的正常表達是植物正常生長發育所必需的。人們最初通過提高或降低植物體中  miRNA  的表達量,或者通過改變  miRNA  中核苷酸以降低與其靶  mRNA  中堿基配對程度來研究植物  miRNA  的功能。最近,有人通過轉基因手段改變植物中靶  mRNA  的序列,使其具有抗  miRNA  降解能力來研究  miRNA  對靶標基因的調控作用。目前,植物以擬南芥  miRNA  的研究最為詳盡,Palatnik  等(2003)發現  miR319  (或稱為  miR-JAW  )基因在野生型植株的芽頂端組織、花器官和果實中均有表達,通過對  jaw-D  基因進行突變研究,發現  miR319  能通過靶向作用于  TCP  轉錄因子(TB1/CYC/PCFs,TCP)基因家族成員來調控植物葉片的形態建成。miR319  基因過量表達導致植物的葉片偏上生長、果實畸形、葉片邊緣鋸狀化和開花期延遲等一系列異常的多效表型(  pleiotropic  phenotype)。miR164  家族能通過調節具有  NAC  功能域的轉錄因子(NAM/ATAF/CUC,NAC)基因家族中的CUP  SHAPED  COTYLEDON1(CUC1)、CUC2  和  CUC3  來實現對植物的花瓣數量以及花器官邊緣細胞與頂端分生組織細胞分化的調控(Aida  等  1997;Rhoades  等2002)。miR165/166  能作用于第Ⅲ類帶有同型亮氨酸拉鏈結構域(class  Ⅲ  homeodomain-1eucine  zipper,class  Ⅲ  HD-Zip)基因家族和  KANADI  基因家族成員,其中基因  PHABULOSA  (PHB)、PHAVOLUTA  (PHV)、REVOLUTA(REV)、KAN1、KAN2  和  KAN3  能調節葉片、花器官和維管組織細胞的極性分化,從而影響植物形態的建成(Chen  2005)。在被子植物、裸子植物、蕨類植物、石松屬植物、苔蘚植物、地錢以及金魚藻的研究中發現,miR165/166  與  class  Ⅲ  HD-Zip  基因家族成員結合的靶位點表現出極高的保守性(  Floyd  和  Bowman  2004)。  



在植物中已經分離鑒定出一些對  miRNA  合成與功能起作用的基因,如DCL1、AGO1、HEN1、HYL1  和  HST  基因,通過對這些基因進行突變,發現導致植物  miRNA  靶基因表達上調,并導致植物生長發育異常。基因  dcl1  突變可減少成熟  miRNA  的合成量,并改變葉片形態,導致花期延遲和雌性不育等現象(  Schauer  等2002)。基因  hst  突變也可影響花器官與葉片的形態,以致可育性降低,加速營養生長轉向生殖生長并改變葉在莖枝上的排列方式(  Telfer  和  Poethig  1998),這些現象表明  miRNA  是在植物發育過程中起作用的。大多數的  miRNA  通過調控轉錄因子的表達來調節植物的發育過程,目前發現植物  miRNA  靶標中的50%左右是一些轉錄調控因子。在擬南芥中,miR164  通過調節具有  NAC  功能域的轉錄因子家族成員,如  CUC1、CUC2、NAM、NAC1、At5g07680  和  At5g61430  來調控植物分生組織的發育、頂端器官的分離以及側根的發育(  Rhoades  等2002;Mallory  等2004)。miR166  通過調節擬南芥  Homeobox  15  蛋白(ATHB  15)來調控植物的維管細胞和韌皮部細胞的發育(Kim  等2005),一些  miRNA  還與植物細胞壁的合成及纖維的發育有關。  



對于開花植物來說,花器官的發育是植物發育過程中的一個重要階段。miR172  通過調控靶標  AP2(APETALA2)  和  AP2-like  基因來調節植物開花的時間和花的形態。過量表達  miR172  能抑制  AP2  基因和  AP2-like  基因如  TOE1  (TARGET  OF  EAT1)的表達,導致植物開花期提前并影響花器官的形態建成(Chen  2004)。擬南芥中  miR171  通過對具有  GRAS  結構域的  SCL  (SCARECROE-LIKE)  轉錄因子家族成員如  SCL6-Ⅱ、SCL6-Ⅲ  和  SCL6-Ⅳ  的調控,來控制花的發育和根系發育(  Llave  等)。miR156  也能影響植物的開花時間,在  35S::MIR156  轉基因植物大量表達  miR156  后,發現植株表現出短日照條件下開花延遲和能育性降低,因此  miR156  可能是通過靶向作用于轉錄因子  SPL(squamosa  promoter  binding  protein  like)來行使其功能的(  Schwab  等2005)。另外,miR319  的過量表達會導致  TCP  mRNA  水平下降,因而植物葉片彎曲并呈鋸齒狀,同時植物花期也延遲。  



此外,miRNA  還參與植物生長發育過程中的轉型,如幼葉轉向成熟葉,營養生長轉變為生殖生長,花序分化轉向為花器官生長等。miR172  調節一些  AP2-like  基因,如  TOE1、TOE2、TOE3、SM2  和  SNZ,從而對植物發育過程中的轉型進行調控。擬南芥中,miR172  通過指導切割  TOE1  和  TOE2  mRNA  調控植物從營養生長向生殖生長的轉變(Aukerman  和  Sakai  2003)。玉米中,miR172  通過調控  AP2-like  基因  glossy15  調節幼葉向成熟葉的轉變。  



2.2  miRNA  與植物激素的調節及信號轉導  植物激素是植物生長與發育的重要調控因子,不僅在植物細胞的分裂、延長和分化中起調控作用,而且在植物器官的形成與應答外界壓力中也發揮作用(王金祥等2005:周德保2005)。植物激素分子通過與生長素反應因子(auxin  response  factor,ARF)相結合,影響植物生長和發育的諸多方面。GH3  和生長素/吲哚乙酸(Aux/IAA)通過植物生長素反應啟動子(auxin-response  promoter  element,AuxRE)結合起來調控激素的表達(  Hagen  和  Guilfoyle  2002)。植物激素能導致一些轉錄抑制蛋白的降解,例如通過泛素-蛋白酶通路的  Aux/IAA  蛋白的降解。目前發現,許多植物激素的信號分子是  miRNA  的作用靶標,在擬南芥中已經鑒定出23個  ARF  轉錄因子家族成員,其中至少有5個  ARF  基因具有  miRNA  的互補位點,它們分別是  ARF1O、ARF16、ARF17、ARF6  和  ARF8,其中  ARF1O,ARF16、ARF17  是  miR160  的靶標基因,而  ARF6  和  ARF8  是  miR167  的靶標基因(  Barte1  和  Barte1  2003)。Wang  等(2005)發現  miR160  通過調控  ARF1O  和  ARF16  的表達影響擬南芥根冠細胞的形成。Mallory  等(2005)證實,中斷  miR160  的轉錄,ARF1O、ARF16、ARF17  mRNA  水平即增加,從而改變生長素誘導因子  GH3-like  基因的表達和影響另一生長素效應因子  DR5  的正常功能,并導致植株的嚴重發育缺陷,這種現象同樣在含有5個沉默突變位點的  ARF/7  mRNA  轉基因植株中也觀察到。在此種轉基因的植株中,由于  miR160  作用的靶標——4RF17  mRNA  含有5個沉默突變位點,以致  miR160  不能正常介導  ARF17  mRNA  切割,導致植株表現出多效異常表型,如產生鋸齒狀葉片或卷縮狀葉片,開花期提前,花形態改變和可育性降低等,這表明  miR160  在植物發育和激素信號的調節中起作用(Mallory  等2005)。此外,ARF3、ARF4  還含有從  TAS3  基因座上產生的ta-siRNA(trans-acting  siRNA)的結合位點。ta-siRNA是一類作用于  mRNA  的  siRNA,主要在轉錄后基因沉默(post  transcriptional  gene  silencing,PTGS)中起作用,目前已鑒定出5個  ta-siRNA  轉錄本是  miR173  與  miR390  作用的靶標,在體內可檢測到由  TAS3  ta-siRNA  介導的  ARF3  和  ARF4  mRNA  的切割產物(  Allen  等2005)。而  miR164  和其作用的靶標基因—一NAC1  mRNA  同樣也受生長素的誘導,NAC1  編碼的側根發育時的正調控轉錄因子能下調  TIR1  (transport  inhibitor  response  1)水平。用  T-DNA  插入  miR164a  和  miR164b,會發生功能損失突變,從而導致  NAC1  mRNA  水平增加,雖然在植物根部檢測到的  miR164  水平只有野生型的1/3~1/4,但在相同的發育時期,其比野生型長出更多的側根(Guo  等2005)。  



一些  miRNA  還能影響信號轉導通路,尤其是植物激素通路。Zhang  等(2005)用表達序列標簽(expressed  sequence  tag,EST)分析時發現,一些  miRNA  可在受脫落酸(abscisic  acid,ABA)、赤霉素(  gibberellic  acid,GA  )、茉莉酸(  jasmonic  acid,JA  )、水楊酸(  salicylic  acid,SA  )和其他植物激素誘導的組織中檢測到,如  miR159、miR160、miR164  和  miR167。LEAFY  (LFY)基因在高等植物的營養和生殖組織中廣泛表達,該基因處于成花調控網絡的關鍵位置,植物激素如  GA  及  ABA  的信號轉導與  LFY  基因表達有關。GAMYB  相關蛋白是一類通過調控  LEAFY  蛋白水平影響花器官正常發育的轉錄因子,miR159  通過指導切割  GAMYB  mRNA,對  LEAFY  蛋白進行調控。miR159  受  GA  的正調控,miR159  過量表達可導致  LEAFY  mRNA  降解,開花期延遲,影響花的發育過程。NAC1  是一種轉錄激活因子,它通過調節轉運抑制效應因子  TIR1  作為調控側根的生長素信號。miR164  突變可導致植物生長素信號通路發生中斷,以及  NAC1  mRNA  水平增加和更多的側根生成,而  miR164  大量表達則會導致  NAC1  基因表達的下調和減少側根的形成(Achard  等2004)。  



此外,miR393  也可以通過調節  TIR1  來調控信號通路(Wang  等2004)。擬南芥的  F-box  蛋白  TIR1  是植物生長素受體,也是泛素化降解途徑中的  E3  連接酶復合體的一種非常重要的組分,在應答激素反應中,TIR1  形成的  SCFTIR1復合體在不需要任何修飾的情況下可直接與生長素結合,從而導致  Aux/IAA  蛋白降解(  Dharmasiri  等2005;Kepinski  和  Leyser  2005)。還有報道認為,編碼  F-box  蛋白  TIR1  的  mRNA  是  miR393  的作用靶標(Jones-Rhoades  和  Barte1  2004;Sunkar  和  Zhu  2004),這表明  miRNA  同樣也能靶向作用于  F-box  蛋白和影響  E3  連接酶的活性。所有這些均表明,  miRNA  在激素調節和信號轉導中發揮作用。  



2.3  miRNA  與植物病害和應答環境脅迫  病毒感染是一個廣泛影響植物生長發育的生物因素,每年因植物病毒感染而導致大多數農作物和果樹減產30%左右。在長期的進化過程中,植物已經形成了一些抵制病毒感染的機制,其中一種機制就是病毒介導的轉錄后基因沉默。已有越來越多的證據表明,miRNA  與病毒介導的疾病以及病毒誘導的基因沉默有關(  Chapman  等2004)。現已從植物病毒中鑒定出的  RNA  沉默抑制因子有30多種,如P19、p21、p25  和  p69  等,這些抑制因子通常稱為致病因子。致病因子通常可阻礙  siRNA  的形成,或影響  siRNA  的穩定性,或干擾  siRNA  與  RISC  復合物的結合,并能導致植物的一些相關疾病的產生和引起發育畸型。植物中過量的  HC-Pro  蛋白酶(  helper  component-pmteinase  )會降低  miR171  水平,產生與  miR171  相關的發育缺失型植株(  Kasschau  等2003)。通過擬南芥中過量表達的  HcPro  基因,發現  miR171  的多數靶  mRNA  水平提高,致使植物出現受病毒介導的相關病癥(  Kasschau  等2003)。  



在植物形成的多種應答各種環境脅迫的機制中,還有一種是通過調節  miRNA  起作用。最近的研究發現,干旱、嚴寒和鹽分會影響植物  miR319c、miR393、miR395、miR397b  和  miR402  的表達,如  miR319c  僅由嚴寒因素誘導表達(  Sunkar  和  Zhu  2004),miR395  在低硫酸鹽的條件下誘導表達,此時  miR395  的靶標基因  APS1(ATP  sulfurylase  1)表達明顯下降(Jones-Rhoades  和  Barte1  2004)。Lu  等(2005)從楊樹中分析出48個  miRNA  序列,其中大多數  miRNA  靶向作用于與發育和脅迫以及抗病毒侵染有關的基因。植物  miRNA  還參與植物應答外界環境脅迫的反應,植物在環境脅迫因素作用下能誘導某些  miRNA  過量或低量表達,或直接合成一些  miRNA  并對外界環境脅迫做出應答反應。  



3  結語  



植物中的  miRNA  及其對植物生長發育的影響是植物生物學研究領域中的一個熱點,它為植物生物學的研究提出了新的研究思路。但是隨著研究的深入,越來越多的問題擺在人們面前有待解決,如  miRNA  對多個靶基因的網絡調控具體機制是怎樣的,miRNA  作用過程中是否有放大效應,植物中究竟有多少  miRNA,如何查清楚植物中的  miRNA  并找出它們的靶基因和揭示它們的功能。只有揭示其作用的靶基因后才能更好地進行功能研究,從而也才可以弄清楚它在生命活動中的作用。就目前的研究來看,雖然各個物種中發現的  miRNA  數量已不少,但能說明  miRNA  的靶基因及其功能的直接證據并不多,而且多數是通過篩選突變體獲得的。相信,隨著  miRNA  研究技術的不斷成熟,將有更多的  miRNA  及其靶基因被鑒定出來。

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