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Nature子刊:北大魏文勝、哈佛劉小樂課題組完成首次CRISPR lncRNA基因高通量功能篩選

來源:學術經緯 作者: 2016-11-14
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摘要: CRISPR–Cas系統是近年來興起的一種高效的基因編輯技術,具有廣泛的應用范圍,其中就包括功能基因篩選。人們可以建立一個單鏈向導RNA(sgRNA)的庫,用其中的sgRNA去靶向作用于多種基因的編碼區域,然后再以所研究功能相關的目標表型對結果進行評估,從而找到與該功能相關的基因。這一策略利用了細胞中傾向于產生差錯DNA......


CRISPR–Cas系統是近年來興起的一種高效的基因編輯技術,具有廣泛的應用范圍,其中就包括功能基因篩選。人們可以建立一個單鏈向導RNA(sgRNA)的庫,用其中的sgRNA去靶向作用于多種基因的編碼區域,然后再以所研究功能相關的目標表型對結果進行評估,從而找到與該功能相關的基因。

這一策略利用了細胞中傾向于產生差錯DNA修復途徑——非同源性末端接合(NHEJ),通過CRISPR–Cas系統在目標基因片段中制造DNA雙鏈斷裂,是細胞采用NHEJ進行修復,最終在原斷裂位點留下插入/缺失突變。對于編碼蛋白的基因,少數堿基對的加入或去除便可能帶來移碼突變、錯義突變等嚴重影響蛋白正常功能的因素,最終反映在表型上。

▲NHEJ過程(圖片來源:acsu.buffalo.edu)

然而,對于轉錄非編碼RNA的基因來說,上述策略則難以用于功能篩選,因為僅有插入/缺失突變很可能并不能顯著影響轉錄產物的表型。為此,人們需要制造影響更大的突變,比如基因中大片段的缺失,以造成可觀察到的表型改變,而這樣的突變可以通過配對向導RNA(pgRNA)來實現。CRISPR–Cas系統在兩種分別靶向目標基因不同位點的gRNA的指導下,在同一基因中造成兩處DNA雙鏈斷裂。在細胞對DNA進行修復的過程中,上述兩個斷裂點之間的基因片段可能會被“遺漏”,最終不會出現在修復完畢的基因中。

最近,北京大學魏文勝教授和哈佛大學劉小樂教授的聯合團隊基于上述策略,以慢病毒為載體構建出pgRNA庫,在全基因組范圍內對人源肝癌細胞系Huh7.5OC中的近700個癌癥或其他疾病相關長鏈非編碼RNA(lncRNA)的基因進行了功能篩選。這一成果發表于近期的Nature子刊《Nature Biotechnology》上。

▲魏文勝教授(左)和劉小樂教授(右)(圖片來源:北京大學和哈佛大學官網)

研究者以細胞增殖為表型,采用MAGeCK算法對lncRNA基因敲除影響的顯著性進行了分析,最終篩選出了43種和8種在敲除后分別抑制(即負向選擇)和促進(即正向選擇)細胞增殖的lncRNA基因。在接下來的驗證性分析中,研究者選取了5種負向選擇和4種正向選擇lncRNA,在Huh7.5OC細胞中對其進行了敲除、回補、轉錄激活或抑制處理,結果均符合其對細胞增殖或存活等方面的影響。在上述9個lncRNA中,正向選擇的LINC01087還被進行了進一步的功能分析。結果顯示,LINC01087的敲除導致一系列肝癌相關基因的表達上調,如FOS和FOSB等。

▲lncRNA基因功能篩選流程示意(圖片來源:Nature Biotechnology)

上述lncRNA的影響很可能還不局限于肝癌。研究者們選取了15個對細胞增殖影響最顯著的lncRNA,利用多個大型癌癥數據庫,分析了它們以及其他基因在五種癌癥腫瘤中的表達,包括肝癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌和多形性膠質母細胞瘤。結果顯示,許多與負向選擇lncRNA共表達的基因可促進RNA合成與細胞周期等過程;而許多與正向選擇lncRNA共表達的基因則參與抑制上述過程。這與上述lncRNA對之前Huh7.5OC細胞增殖和存活的影響相一致。

這一工作首次采用基于pgRNA利用CRISPR–Cas系統對lncRNA基因的高通量功能篩選研究,其基本策略和方法可被用于對其他非編碼RNA功能的分析中,具有巨大的潛在應用場景。


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