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研究人員首次對 “CRISPR 基因組編輯如何工作” 進行全原子模擬

來源:生物通 作者: 2017-1-13

摘要: 在過去的十年里,談論最多的生物學突破就是,基因組編輯工具 CRISPR/Cas9 的發現,它能夠修改 DNA,并可能在根本上消除許多遺傳性疾病的根源。CRISPR 相關蛋白 9(CAS9),最初發現是作為化膿性鏈球菌細菌免疫系統的一部分,在其原生狀態,可識別外源 DNA 序列和抑制它們。CRISPR 表示包含短重復堿基序列的 DNA 片段,重......


在過去的十年里,談論最多的生物學突破就是,基因組編輯工具 CRISPR/Cas9 的發現,它能夠修改 DNA,并可能在根本上消除許多遺傳性疾病的根源。

CRISPR 相關蛋白 9(CAS9),最初發現是作為化膿性鏈球菌細菌免疫系統的一部分,在其原生狀態,可識別外源 DNA 序列和抑制它們。

在細菌中,該系統被用于靶定來自噬菌體的外源病毒 DNA——這些 DNA 在其進化歷史中已被公認為是敵人,并將一個記錄整合到自己的 DNA 中。

CRISPR 表示包含短重復堿基序列的 DNA 片段,重復序列后面是來自以前暴露外源 DNA 的 “間隔 DNA” 短片段。該復合體包括解開 DNA 的蛋白質,以及能夠識別細胞中敵方 DNA 的向導 RNA。

研究這一古老免疫系統的研究人員認識到,通過改變向導 RNA 序列與給定靶標匹配,它不僅可以用來切割病毒 DNA,而且可以在精確選擇的位置切割任何 DNA 序列。此外,新的 DNA 片段可以被引入到新的切割部位。

該方法首先是由加州大學伯克利分校的 Jennifer Doudna 和瑞典于默奧大學的 Emmanuelle Charpentier 構思和開發出來的,已用于培養細胞——包括 STEM 細胞,和受精卵,來制備具有靶向突變的轉基因動物,有助于研究基因功能。CRISPR/Cas9 可以同時影響許多基因,從而可治療涉及多基因相互作用的疾病。延伸閱讀:CRISPR 先驅獲得新突破:開發更安全的 CRISPR-Cas9 基因療法。

該方法正在迅猛發展,預計有一天可應用在基礎研究、藥物開發、農業和治療人類遺傳性疾病患者中。

然而,產生靶向的 CRISPR/Cas9 基因突變在目前是昂貴和費時的,特別是對于大型的研究來說。這個過程也容易出錯,從而限制了它的廣泛使用。這些問題部分是由于我們對于 “CRISPR/Cas9 在分子水平上是如何工作的” 缺乏充分的了解。

在 2016 年十一月,來自北得克薩斯大學(UNT)一個以 Jin Liu 為首的研究小組,采用德克薩斯高級計算中心(TACC)的 Maverick 超級計算機,首次對 Cas9 催化的 DNA 裂解作用進行了全原子分子動力學模擬。

相關模擬結果發表在《Scientific Reports》雜志,揭示了 Cas9 基因組編輯的過程。他們還幫助解決了關于 “切割的特定方面” 的爭議:例如,編輯發生的精確部位以及 Cas9 是否產生鈍端或交錯末端的裂解。

Liu 說:“現在,在如何將這項技術用于治療上,存在相當多的問題。酶的特異性和效率不高。將酶傳遞到基因編輯的位置也很困難。要解決這些問題,首先,我們需要知道這種酶是如何工作的。我們的研究為 Cas9 機制的理解,提供了基礎。”

以前,科學家們通過 X 射線晶體學確定了 Cas9 在活動狀態時的結構,但是基因編輯過程發生的如此之快,沒有哪種實驗技術可以捕捉它的狀態變化,并確定它是如何工作的。

利用分子動力學模擬——通過模擬固定時間內大量原子間相互作用來研究分子動力學的方法,Liu 和 UNT 的合著者 Zhicheng Zuo,能夠在飛秒時間分辨上觀察到 Cas9 酶中的變化,并捕獲到系統活躍狀態的過渡。

這些模擬包括 Mg2 + 離子,它們被認為可誘導 Cas9 的構象變化,從而它能發揮作用。研究人員推測,Mg2 + 離子可通過促進 Cas9 位點和 DNA 的接近,誘導到一個活躍狀態的構象變化。

Liu 和 Zuo 在 Maverick 上運行的模擬,包含 280000 個相互作用的原子。根據 Liu 介紹,最具挑戰性的部分在于,有效地采集構象空間來定位活動狀態。

Liu 說:“我們盡力提高我們模擬結果的可靠性。我們做了幾個長 200 和 300 納秒的軌跡,也做了幾個短的 60 納秒的軌跡,以確保我們有一致的結果。對于每次配置,我們進行了至少六次并行模擬。”

除了研究 CRISPR/Cas9 復合物如何變成它的活性狀態,這些模擬揭示了它在哪里剪切 DNA。

UNT 藥學助理教授 Liu 說:“通常人們認為,它是在一個位置上切割,但沒有明確的證據表明。使用我們的計算方法,我們確定了切割發生在另一個位置,這可能意味著,這種酶可以一種更可控的方式切割 DNA。因此,通過做這項工作,我們為設計更有效的酶——可以一種更具體的方式切割 DNA,打開了新的途徑。”

他們最終的結果回答了 “基因組編輯是否產生鈍端或交錯端” 這個懸而未決卻有著實際意義的問題。

CRISPR/Cas9 切割雙鏈 DNA 的兩半。如果它在兩條鏈的同一位置上切割,就會產生鈍的端部;如果它在略有不同的位置切割,就會產生交錯的端部。他們的模擬結果表明,CRISPR/Cas9 創建了交錯末端。

她說:“這對于基因編輯將是非常重要的,因為交錯端 DNA 比鈍端 DNA 更加可控。”

UNT 醫藥科學主席 Iok Hou Pang,利用 CRISPR/Cas9 在他的實驗室做實驗性眼科研究。對于他當前和未來的研究,他看到了 “更深入了解這種酶的行為” 的價值所在。

Pang 說:“我的實驗室一直使用 CRISPR/Cas9 基因編輯系統,來敲除培養小鼠視神經星形膠質細胞中的一個新蛋白。Liu 博士的工作將幫助我們了解這個酶系統和它底物之間的分子相互作用,并最終有助于提高其效率,對于這種奇妙的分子技術來說這是非常有用的。”

2015 年,在美國國家科學院的主持下,全球科學家宣布禁止利用 CRISPR/Cas9 來編輯人類基因組,然而有跡象表明,研究人員已經打破了這一禁令。他們說,我們對該過程和這樣做的長期影響知之甚少。但是像 Liu 這樣的研究,將來可能會對 “調整這些工具并使它們可用于人類” 發揮一定的作用。

Liu 說:“我們試圖理解基因組編輯酶的機制,這可能對未來的藥物和治療應用有很大的潛力,可以讓我們更接近于將這種技術用于人類疾病治療。沒有 TACC 資源,這項研究將無法完成。”


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