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基因編輯培育出首例白化西藏小型豬

來源:廣州日報 作者: 2017-1-18

摘要: 從南方醫科大學獲悉,該校實驗動物中心科研團隊運用 CRISPR/Cas9 基因編輯技術,成功培育出世界首例白化西藏小型豬,同時敲除了與免疫相關的基因,這標志著自主構筑的基于小型豬受精卵制備基因修飾豬的平臺取得了突破性進展。南方醫科大學實驗動物中心主任顧為望在接受采訪時談到,作為引進西藏小型豬研究的倡導者和發起......


從南方醫科大學獲悉,該校實驗動物中心科研團隊運用 CRISPR/Cas9 基因編輯技術,成功培育出世界首例白化西藏小型豬,同時敲除了與免疫相關的基因,這標志著自主構筑的基于小型豬受精卵制備基因修飾豬的平臺取得了突破性進展。而在此之前,全世界尚未有純白藏豬的先例。

藏豬作為我國獨有的高原特殊品種,全身被毛為烏黑或黑灰色,少數個體為棕色,皮膚為淺黑色。南方醫科大學實驗動物中心主任顧為望在接受采訪時談到,作為引進西藏小型豬研究的倡導者和發起人,他和其他專家于 2003 年在西藏考察時,發現藏豬不僅體形小,而且高原抗應激能力強,于是引進了這一品種。南方醫科大學成為了廣東省第一家實驗用小型豬生產許可證的單位。第一次完全利用自身科研團隊,獨立研發世界首例白化西藏小型豬。

這次世界首例白化西藏小型豬的成功培育,所采用的技術路線是 “同步發情、人工授精、同步取卵、受精卵移植”,受精卵在體外進行基因修飾,敲除白化相關基因及免疫相關基因,然后進行胚胎移植。目前出生仔豬白化表型明顯,而免疫缺陷表型有待進一步鑒定。

據悉,豬的消化系統、心血管系統、代謝過程等解剖結構以及生理功能和人類特別接近,是一種理想的實驗動物。豬在臨床實驗已有多個突破。用豬可以生產出人用生物活性物質,如胰島素是人體最重要的影響代謝的激素之一,而豬的胰島素與人相比只差一個氨基酸,通過提純之后不需要進行改造,直接可以注入人體以治療糖尿病

在臨床醫師的技能培訓和實驗研究中,都廣泛運用豬做實驗動物,就臨床而言,醫院的骨科、耳鼻喉、眼科、整形等眾多科室研究中都會陸續運用到這些技術和方法。

據悉,該團隊接下來將致力于把白化藏豬做成免疫缺陷豬,有免疫缺陷的動物可以把人的腫瘤細胞原位或異位移植到體內,然后進行發病機理研究、臨床療效觀察及藥物開發。

這只豬厲害了!未來人體細胞甚至器官都有可能來自它——南方醫培育世界首例白化西藏小型豬

記者王倩、通訊員黃瑤報道:提起豬對人的貢獻,從肉到骨和我們的生活密不可分,不僅如此,豬在醫學領域的作用也非常重要,去年,中國自主研發的生物工程 “豬角膜” 已經成功為江西一名 14 歲少年恢復光明。不過科學家們對豬的期待還遠不止這些,日前,南方醫科大學實驗動物中心科研團隊運用 CRISPR/Cas9 基因編輯技術,成功培育出世界首例白化西藏小型豬,這種豬的厲害在于,經過改造后它成為最優良的醫學實驗動物,最適合大量繁殖并高度接近人的特性讓它可能成為新的人體細胞工廠,甚至進行器官異種移植。

南方醫實驗動物中心與中科院廣州生物醫藥與健康研究院賴良學研究員(世界第一例體細胞克隆豬創制人)一直多有合作,他們于 2007-2010 年期間利用西藏小型豬克隆技術已成功培育出不同的轉基因體細胞克隆豬,包括紅、黃、藍、綠四色熒光蛋白轉基因克隆豬等。兩家單位共同申報的 “大動物基因修飾技術研究及基因修飾動物模型的建立” 項目于 2014 年獲得廣州市科學技術進步獎一等獎;2016 年,“豬基因突變技術創新及基因修飾豬模型的建立” 又獲得廣東省科學技術一等獎。

作為引進西藏小型豬研究的倡導者和發起人,南方醫實驗動物中心主任顧為望表示,此次培育成功的白化西藏小型豬同時敲除了與免疫相關的基因,并且可以迅速實現大規模繁殖,并且對于實驗動物學、生物醫藥以及臨床醫學研究等領域都具有重大意義。

記者在實驗動物中心看到,通過人工輔助生殖技術,科學家將原始豬種的受精卵取出,進行基因修飾,然后植入 “代孕豬媽媽” 體內,最終產出 4 只小豬,從外觀上看,有 2 只有天然的黑色轉為白化。飼養工作人員告訴記者,如今它們成長得很健康,幾個月后就可以達到性成熟,并可以進行自然繁殖,繼續生出攜帶白化基因的小型豬。

為什么是豬?

豬比鼠像人比猴子更便宜

在常用的實驗動物中,鼠類、兔類、犬類和靈長類動物都很常用,但科學家們也發現,新藥研發要求必須用兩種以上的動物做實驗,其中一種需為非嚙齒動物。鼠類等嚙齒類動物和人類相差甚遠;猴子繁殖率低,成本又太高,做實驗受到很大限制;犬作為寵物,和人情感太親密也常常受到人們的心理抗拒。而豬被人長期豢養,已經成為與人類非常相近的一種動物,尤其是豬的消化系統、心血管系統、代謝過程等解剖結構以及生理功能和人類特別接近,是一種理想的實驗動物。同時,豬作為傳統定義上的食用動物,用它來做實驗更容易被人們所接受,這個尤其符合國際上通行的動物實驗的福利和倫理要求,實驗結果容易被國際社會所認同。

“普通的家豬主要缺點在于體型過大,常常達到五六百斤,在新藥研發實驗過程中,用量和人差異太大,實驗室飼養操作也比較困難。” 因此顧為望認為,成年體重在 30 公斤左右的小型豬是更為理想的實驗品種。

為什么要白?

白色皮膚更便于醫學觀察

大多數常用實驗動物如豚鼠、大鼠、小鼠、兔子,大多是白化品種品系,因為白色動物更加便于觀察它的發熱、過敏、炎癥等癥狀以及皮膚角膜等損傷與修復的過程,這同樣也是白化藏豬的優勢所在。

顧為望告訴記者,由于豬的皮膚和人非常相似,下一步,還計劃將白化藏豬培育成無毛白化藏豬,用于化妝品的研究開發和應用,研究化妝品對皮膚的刺激性和抗皺、防衰老等功效;還可以用于皮膚用藥的效果觀察或皮膚用藥研究。

基因如何修飾?

這次所采用的技術路線是 “同步發情、人工授精、同步取卵、受精卵移植”,受精卵在體外進行基因修飾,敲除白化相關基因及免疫相關基因,然后進行胚胎移植。目前出生仔豬白化表型明顯,而免疫缺陷表型有待進一步鑒定。

顧為望表示,此次實驗是南方醫實驗動物中心科研團隊完全利用自身科研團隊獨立研發,最大亮點是運用最新基因編輯技術 CRISPR/Cas9,設計和制備 sgRNA,基于小型豬受精卵制備基因修飾豬,在世界上獲得首例白化、同時敲除了免疫相關基因的實驗用西藏小型豬。與轉基因克隆豬相比,運用受精卵基因修飾獲得的轉基因豬的優勢在于可以迅速實現大規模繁殖,批量生產供應實驗研究用。

實驗豬能做什么?

實驗用豬可以生產出人用生物活性物質,如人的胰島素、凝血酶原、白蛋白。另外,還可以用豬的神經干細胞治療帕金森綜合癥、老年性癡呆。

顧為望說,他們將首先把白化藏豬做成免疫缺陷豬。一般情況下,人類腫瘤細胞在動物身上接種一般很難成活,但是有免疫缺陷的動物可以把人的腫瘤細胞原位或異位移植到體內,然后進行發病機理研究、臨床療效觀察及藥物開發。

他們將利用小型豬動物模型進行診斷、干細胞治療和腫瘤防治,培育出有高血糖、先天性心臟病、輻照損傷等疾病的動物模型。譬如,可以用基因改造的辦法把免疫缺陷豬的肝臟做成條件性損傷的肝臟,再把人的干細胞體外分化后注入豬體內,讓豬的肝臟生長出人的肝細胞,用來治療肝臟疾病;另外用豬生產的人源化干細胞做成的生物人工肝可以更有效地治療肝衰,豬產生的人的肝細胞在新藥研究開發中有廣闊的市場前景。

豬器官怎么用?

在異種移植領域,豬是最有希望成為人的異種移植供體的動物。在組織移植、瓣膜、角膜和皮膚移植領域,醫療方面有廣泛的實驗,用豬的瓣膜修補人的心臟瓣膜缺損,已經在臨床上大規模運用。角膜移植也已經進入臨床實驗研究階段,通過移植豬的角膜,修補治療病人的角膜缺損,可以使其視力恢復到 0.4 以上。另外,豬的皮膚和人特別接近,把豬皮經過處理后作為良好的創口覆蓋物,使人的受創皮膚自動愈合,用豬皮做基因工程皮膚已處在實驗研究向臨床過渡階段。把豬皮脫去細胞,然后覆蓋上人的皮膚干細胞,做成組織工程皮膚,用于治療大面積的燒傷、凍傷和化學品灼傷。

在器官移植領域,全世界只有 5% 的人可以得到腎、肝、心、肺等供體,絕大部分人只能在等待中瀕臨死亡。最終能夠解決這一問題的就是異種移植。2008 年,第一個基因敲除克隆豬經過基因改造之后,豬腎臟成功移植到狒狒身上,使狒狒存活了 83 天;豬心臟移植到狒狒身上則存活了 179 天。目前,又有科學家將基因改造豬的心臟移植到狒狒體內,而這次存活的時間達到 945 天。

日前,我校實驗動物中心科研團隊運用 CRISPR/Cas9 基因編輯技術,成功培育出世界首例白化西藏小型豬,同時敲除了與免疫相關的基因,這標志著自主構筑的基于小型豬受精卵制備基因修飾豬的平臺取得了突破性進展。而在此之前,全世界尚未有純白藏豬的先例。這項突破性成果不僅可以迅速實現實驗用白化西藏小型豬的大規模繁殖,并且對于實驗動物學、生物醫藥以及臨床醫學研究等領域都具有重大意義。

國內首次引進藏豬研究,列入科技援藏項目標志性成果 藏豬作為我國獨有的高原特殊品種,主要分布于我國青藏高原的農區和半農半牧區,是世界上分布于海拔最高地區的豬種,能適應惡劣的高寒氣候和以放牧為主的低飼養條件,是藏族牧民馴化當地野豬形成的群體。

藏豬頭型、體重、體型與當地野豬相似,全身被毛為烏黑或黑灰色,少數個體為棕色,皮膚為淺黑色。肌肉發育良好,體型緊湊,體質結實,免疫力強。

實驗動物中心主任顧為望在接受采訪時談到,作為引進西藏小型豬研究的倡導者和發起人,他和其他專家于 2003 年在西藏考察時,發現藏豬不僅體型小,而且高原抗應激能力強,于是引進了這一品種。我校成為了廣東省第一家實驗用小型豬生產許可證的單位,同時也是中國實驗動物學會實驗小型豬專業委員會主任委員單位。藏豬也成為國家科技部認可的實驗動物品種,被列入公共服務平臺建設范疇。2010 年 1 月,我校成功主辦首屆國際小型豬學術論壇;2011 年 11 月 25 日在東莞松山湖召開第二屆國際小型豬學術論壇;今年 8 月 21 日,第三屆國際小型豬學術論壇也在廣州珠江賓館如期召開。

學校實驗動物中心與中科院廣州生物醫藥與健康研究院賴良學研究員(世界第一例體細胞克隆豬創制人)進行合作,于 2007-2010 年期間利用西藏小型豬克隆技術已成功培育出不同的轉基因體細胞克隆豬,包括紅、黃、藍、綠四色熒光蛋白轉基因克隆豬、亨廷頓舞蹈癥的轉基因克隆西藏小型豬和 Mx1(抗黏液病毒 1)轉基因克隆西藏小型豬等。兩家單位共同申報的 “大動物基因修飾技術研究及基因修飾動物模型的建立” 項目于 2014 年獲得廣州市科學技術進步獎一等獎;2016 年,“豬基因突變技術創新及基因修飾豬模型的建立” 又獲得廣東省科學技術一等獎。

廣東省科學技術廳、廣州市科技創新委員會把我校對藏豬的研究列入了科技援藏項目的標志性成果,并給予了支持和鼓勵。實驗動物中心申請的 “構筑制作遺傳工程小型豬的社會化服務支撐平臺” 被列為廣東省科學技術廳資助重點攻關項目,并予以經費支持。實驗動物中心于 2015 年被廣東省科技廳授牌成為 “廣東省實驗小型豬種質資源暨檢定用小型豬工程技術研究中心”。此外,廣州市科創委把藏豬異地保種和實驗動物化培育及相關研究列為廣州市科技援藏項目,數次予以經費支持。

第一次完全利用自身科研團隊,獨立研發世界首例白化西藏小型豬

我校專家利用西藏小型豬進行基因改造,取得了良好的實驗效果。在此之前,藏豬僅僅是一種服務于食品領域的動物,如今培育成實驗用西藏小型豬被廣泛應用于實驗動物學、生物醫藥大健康服務以及臨床醫學研究等領域。

這次世界首例白化西藏小型豬的成功培育,所采用的技術路線是 “同步發情、人工授精、同步取卵、受精卵移植”,受精卵在體外進行基因修飾,敲除白化相關基因及免疫相關基因,然后進行胚胎移植。目前出生仔豬白化表型明顯,而免疫缺陷表型有待進一步鑒定。

顧為望指出,此次實驗和以往不同,之前學校實驗動物中心是和國內其他優秀的技術團隊合作,并整合雙方的技術力量和動物資源進行研發。而此次實驗是我校實驗動物中心科研團隊完全利用自身科研團隊獨立研發,最大亮點是運用最新基因編輯技術 CRISPR/Cas9,設計和制備 sgRNA,基于小型豬受精卵制備基因修飾豬,在世界上獲得首例白化、同時敲除了免疫相關基因的實驗用西藏小型豬。與轉基因克隆豬相比,運用受精卵基因修飾獲得的轉基因豬的優勢在于可以迅速實現大規模繁殖,批量生產供應實驗研究用。

參與此項實驗的是一支技術精湛的科研團隊,該團隊主要科研成員包括顧為望教授帶領的在讀博士及碩士研究生劉薇、陳傍柱、顧鵬、劉玉敏、別亞男以及肖東研究員帶領的碩士研究生劉宇等。其中,陳傍柱因為學習努力、刻苦鉆研,被破格獲準碩博連讀,他和顧鵬、劉玉敏等人對白化西藏小型豬進行 24 小時視頻監控,并詳細記錄,精心照料。剛剛誕生的四個 F0 代豬寶寶(兩頭白色一雌一雄、一頭花白色、一頭黑色)目前發育良好。

對話專家 Q&A

Q:顧主任,為什么想到要用豬這種動物作為實驗動物的首選?

A:豬被人長期豢養,早期和人類生活在同一個屋檐下,吃住在一起,是與人類最相近的一種動物。尤其是豬的消化系統、心血管系統、代謝過程等解剖結構以及生理功能和人類特別接近,是一種理想的實驗動物。

新藥研發要求必須用兩種以上的動物做實驗,其中一種需為非嚙齒動物。在進行藥物安全性評價時,常用大鼠做實驗,但大鼠和人的親緣關系較遠,很多新藥用大鼠做毒性實驗時是安全的,但進入臨床實驗往往不成功。通過移植干細胞治療肝硬化、酒精肝、肝損傷等實驗雖已經在大鼠身上取得成果,但由于大鼠的肝臟再生能力強,不能完全說明問題,這就需要用大動物進一步進行實驗驗證。臨床前實驗用非嚙齒實驗動物主要包括犬、猴、豬。猴子繁殖率低,成本又太高,做實驗受到很大限制;犬作為寵物,和人情感太親密也常常受到人們的心理抗拒。所以豬作為傳統定義上的食用動物,用它來做實驗更容易被人們所接受,這個尤其符合國際上通行的動物實驗的福利和倫理要求,實驗結果容易被國際社會所認同。

Q:臨床上用豬來做實驗,已經在哪些方面取得了一定的成果? A:豬在醫學研究中具有非常重要的意義,主要涉及以下多個領域。

用豬可以生產出人用生物活性物質,如胰島素是人體最重要的影響代謝的激素之一,而豬的胰島素與人相比只差一個氨基酸,通過提純之后不需要進行改造,直接可以注入人體以治療糖尿病。賴良學團隊已經通過基因編輯技術,使得用豬生產出的胰島素和人的胰島素一模一樣;從豬血中可以提取凝血酶原及其激活物做成醫用止血封閉劑;并且最近報道用豬可以生產出人的白蛋白。在異種移植領域,豬是最有希望成為人的異種移植供體的動物。通過移植豬的胰島細胞治療人的糖尿病,已經進入臨床實驗階段,目前在上千例接受豬的胰島細胞移植的人身上還未發現有明顯副作用。另外,還可以用豬的神經干細胞治療帕金森綜合癥、老年性癡呆,豬的神經干細胞移植被用于治療帕金森病和阿爾茨海默病也已經在猴子、狒狒身上取得了明顯療效。

在組織移植、瓣膜、角膜和皮膚移植領域,醫療方面有廣泛的實驗,用豬的瓣膜修補人的心臟瓣膜缺損,已經在臨床上大規模運用。角膜移植也已經進入臨床實驗研究階段,通過移植豬的角膜,修補治療病人的角膜缺損,可以使其視力恢復到 0.4 以上。另外,豬的皮膚和人特別接近,把豬皮經過處理后作為良好的創口覆蓋物,使人的受創皮膚自動愈合,用豬皮做基因工程皮膚已處在實驗研究向臨床過渡階段。把豬皮脫去細胞,然后覆蓋上人的皮膚干細胞,做成組織工程皮膚,用于治療大面積的燒傷、凍傷和化學品灼傷。

在器官移植領域,全世界只有 5% 的人可以得到腎、肝、心、肺等供體,絕大部分人只能在等待中瀕臨死亡。最終能夠解決這一問題的就是異種移植。2008 年,第一個基因敲除克隆豬經過基因改造之后,豬腎臟成功移植到狒狒身上,使狒狒存活了 83 天;豬心臟移植到狒狒身上則存活了 179 天。目前,又有科學家將基因改造豬的心臟移植到狒狒體內,而這次存活的時間達到 945 天。

在臨床醫師的技能培訓和實驗研究中,都廣泛運用豬做實驗動物如心臟導管支架實驗、微創手術和介入治療等。就臨床而言,醫院的骨科、耳鼻喉、眼科、皮膚、整形、心血管、糖尿病、內分泌、影像、微創介入、肝膽外科等眾多科室研究中都會陸續運用到這些技術和方法。

Q:那么藏豬相比家豬和其它類型的豬而言,它的優勢體現在哪里呢?而培育出的基因修飾白化西藏小型豬的獨特優勢又是什么?

A:家豬體型太大,做實驗和藥物研究都不太好操作,用藥量太大,在新藥研究的時候,實驗室制備(合成、提取或表達)往往數量少,價格昂貴,不利于進行研究;而且長期觀察需要幾個月甚至一年,其要求飼養成本太高,飼養空間太大,動物質量難以控制。

藏豬體型小,體質好,抗應激能力強,成本低,用藥量少,便于操作和長期飼養觀察。經過改造后帶免疫缺陷的實驗豬,如果養在普通環境下很難存活。我們要把它養在 SPF (Specific Pathogen Free,無特定病原體) 環境下,所有的飼料、飲水、墊料全部經過嚴格消毒滅菌,24 小時不間斷空調,每小時全新風換氣 15 次,室外空氣需要經過初消、中消、高消三級過濾,更好地控制實驗用小型豬的質量,從而提高科研水平,使科研結果的準確性、科學性、可重復性大大提高。

在此之前全世界尚未有純白藏豬,我們通過基因改造,把藏豬做成白化品種,對于實驗動物學有著十分重要的意義。我們知道,大多數常用實驗動物如豚鼠、大鼠、小鼠、兔子,大多是白化品種品系,因為白色動物更加便于觀察它的發熱、過敏、炎癥等癥狀以及皮膚角膜等損傷與修復的過程,這同樣也是白化藏豬的優勢所在。

Q:我們下一步的研究方向是什么?

A:接下來,后續的研究工作主要有以下三個方向。

一是把白化藏豬做成免疫缺陷豬。一般情況下,人類腫瘤細胞在動物身上接種一般很難成活,但是有免疫缺陷的動物可以把人的腫瘤細胞原位或異位移植到體內,然后進行發病機理研究、臨床療效觀察及藥物開發。

我們利用小型豬動物模型進行診斷、干細胞治療和腫瘤防治,培育出有高血糖、先天性心臟病、輻照損傷等疾病的動物模型。譬如,我們可以用基因改造的辦法把免疫缺陷豬的肝臟做成條件性損傷的肝臟,再把人的干細胞體外分化后注入豬體內,讓豬的肝臟生長出人的肝細胞,用來治療肝臟疾病;另外用豬生產的人源化干細胞做成的生物人工肝可以更有效地治療肝衰,豬產生的人的肝細胞在新藥研究開發中有廣闊的市場前景。

二是把白化藏豬培育成無毛白化藏豬,用于化妝品的研究開發和應用,研究化妝品對皮膚的刺激性和抗皺、防衰老等功效;還可以用于皮膚用藥的效果觀察或皮膚用藥研究。

三是與其他學科領域專家不同的是,實驗動物學專家更側重培育可以在生命科學領域或是醫學各個臨床學科普遍推廣應用的實驗動物新品種品系,比如白化、無毛、免疫缺陷和微型豬等實驗用豬。

在主持 “廣東省實驗小型豬種質資源暨檢定用小型豬工程技術研究中心” 項目的基礎上,我們正在申報 “國家實驗小型豬種質資源暨檢定用小型豬工程技術研究中心” 培育項目,如若立項,有望在 2-3 年內獲得國家級小型豬工程技術研究中心。另外我們翻譯的《小型豬在生物醫藥研究中的應用》這本國外著作本月即將出版,相信對國內同行應用小型豬進行科研和教學會有所幫助。


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