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高效液相色譜法測定萬壽菊花萃取物中的葉黃素含量

來源:中國論文下載中心 作者:未知 2009-9-25

摘要: 【摘要】 目的用高效液相色譜法對萬壽菊花萃取物中所含的葉黃素含量進行分析測定。方法首先由萬壽菊花萃取物制備出葉黃素單體,使用色譜柱為Diamonsil C18柱。結果該方法最低檢出限量1×10-7g·ml- 1 ,葉黃素在0。【關鍵詞】 萬壽菊 葉黃素 高效液相色譜法葉黃素(Lutein),又名“植物黃體素”,是一種廣泛存在于蔬菜、花......


  【摘要】  目的用高效液相色譜法對萬壽菊花萃取物中所含的葉黃素含量進行分析測定。方法首先由萬壽菊花萃取物制備出葉黃素單體,使用色譜柱為Diamonsil C18柱;流動相為甲醇-乙腈-醋酸乙酯-水(30∶29∶40∶1); 流速0.75 ml· min-1; 檢測波長450 nm; 柱溫25 ℃; 進樣量20 μl。結果該方法最低檢出限量1×10-7g·ml- 1 ,葉黃素在0.8~24 μg·ml- 1范圍內線性關系良好,方法精密度RSD(相對標準偏差) 為0.96% ,加標回收率為99. 49 %~100. 22% ,RSD 為 0.82%~1.64 %。結論該方法簡便、準確、重復性好。

  【關鍵詞】  萬壽菊 葉黃素 高效液相色譜法

  葉黃素(Lutein),又名“植物黃體素”,是一種廣泛存在于蔬菜、花卉、水果與某些藻類生物中的天然抗氧化劑。葉黃素高活性、富含電子的長多烯碳鏈,能保護人體免受單線態氧和自由基的作用而帶來的傷害[1],而且葉黃素是人體血液中主要的類胡蘿卜素之一,能夠抑制腫瘤生長,可以預防因機體衰老而引發的心血管硬化、冠心病[2,3];葉黃素能夠很好地保護皮膚免受陽光灼傷,減少人體所受來自于電腦屏幕、電視屏幕等的輻射和超量紫外線照射的損害[4],具有明顯的防輻射、護膚、潤膚和抗衰老作用。另外,葉黃素和玉米黃質是眼睛中僅有的兩種類胡蘿卜素,預防老年性眼球視網膜黃斑區病變引起的視力下降與失明[5]、白內障等眼部疾病[6]是葉黃素的獨特的功能。此外,葉黃素還是一種很好的天然著色劑,在飼料中添加葉黃素不僅可以給動物補充營養,還可以提高動物肉質和蛋的品質,因此,葉黃素被廣泛應用于醫藥、保健品化妝品、食品著色、煙草、水產品及動物飼料[1]。在國際市場上,1 g葉黃素的價格與1 g黃金相當,所以人們把它稱為“植物黃金”。萬壽菊花花瓣中葉黃素是最主要的類胡蘿卜素,通常還有3%~6%的玉米黃質,其它類胡蘿卜素的含量很小,因此是非常好的葉黃素來源。從萬壽菊花中提取葉黃素已經成為國內外研究的熱點,所以建立科學、穩定、可靠的分析方法非常必要。目前,分析檢測葉黃素的主要方法有:紫外- 可見分光光度法、色譜法、質譜、液質聯用、核磁共振等,HPLC可以實現對待測物中葉黃素的定性定量分析[7,8]。本實驗主要研究了由萬壽菊萃取物制備的葉黃素的高效液相色譜分析方法。

  1  儀器與試劑

  LC5500 高效液相色譜儀, 北京東西電子技術研究所;ESJ120 - 4 型電子天平,沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司;ME211 型超聲波清洗器,美國Metter Electronics 公司; Millipore 膜過濾器及真空泵,美國Waters 公司;紫外可見分光光度計:UV22450 UV-Visible spectrophotometer ;葉黃素樣品,由萬壽菊干花經超臨界CO2萃取制備出浸膏,經皂化、分離和純化處理制得,所得的葉黃素樣品經天然產物標準樣品國家核心實驗室(北京)分析鑒定含量為97.29%作為標準樣品。分析用試劑為分析純,北京化工廠生產,水為二次蒸餾水。

  2  方法

  萬壽菊花經超臨界CO2萃取得到萃取物,將萬壽菊花萃取物在堿性條件下皂化,然后分離出游離葉黃素,經過純化處理得到葉黃素樣品。稱取葉黃素樣品20.0 mg,用流動相配成8×10-6g·ml- 1 的溶液。

  色譜條件: 色譜柱為Diamonsil C18柱;流動相為甲醇-乙腈-醋酸乙酯-水(30∶29∶40∶1); 流速0.75 ml·min-1;檢測波長450 nm; 柱溫25 ℃; 進樣量20 μl。

  3  結果

  3.1  色譜條件的確定試驗了不同體積比的甲醇-乙腈、甲醇-乙腈- 醋酸乙酯、甲醇-乙腈-醋酸乙酯- 水為流動相,最終確定流動相為甲醇-乙腈-醋酸乙酯-水(30∶29∶40∶1); 流速0.75 ml·min-1;分離度、柱壓及峰形均較理想,取葉黃素標準樣品適量,用流動相溶解, 制成8×10-6g·ml- 1 的溶液,用紫外-可見分光光度計在200~800 nm 的波長范圍內掃描(見圖1),最大吸收波長為450 nm ,本文選擇450 nm 為檢測波長。葉黃素樣品高效液相色譜圖見圖2。

  3.2  標準曲線的繪制及最低檢出限的測定精密稱取葉黃素對照品20.00 mg 置50 ml量瓶中, 用流動相溶解并稀釋至刻度。精密移取0.1,0.5,1,1.5,2,3 ml置50 ml量瓶中, 用流動相稀釋至刻度, 搖勻。在下進樣,以葉黃素峰面積A(mv ·s-1) 對進樣濃度C (μg ·ml- 1  ) 進行作圖得到標準曲線,如圖3。從圖中可以看出,葉黃素在0.8~24 μg·ml- 1 范圍內線性關系良好。利用此線性關系圖可以對葉黃素濃度與峰面積做定量分析。

  以葉黃素峰面積A(mv ·s-1) 對進樣濃度C (μg ·ml- 1  ) 進行回歸, 得到回歸方程為: Y= -14 377.4+59 811.7C, r=0.993 9。此方程可以用于葉黃素峰面積與濃度之間的定量分析與計算。

  配制1×10-7g/ml的葉黃素標準溶液,檢出信號微弱,確定最低檢出限為1×10-7g/ml。

  圖3  葉黃素標準曲線

  3.3   精密度實驗精密稱取葉黃素對照品20.0 mg,用流動相溶解制成8×10-6g/ml的溶液,在上述色譜條件下重復進樣6 次(實驗Ⅰ), 將上述溶液放置2 d后,再次重復進樣6 次(實驗Ⅱ)。結果見表1。從表1 數據可以知道,RSD為0.96 % ,表明該方法精密度良好。

  3.4  加標回收率按不同比例準確稱取已知含量的葉黃素樣品和葉黃素標準品,配制如表2所示的5種樣品, 并用流動相溶解,制得濃度為8×10-6g·ml- 1 的溶液,在上述色譜條件下測定,每種樣品進樣3次,結果見表2。回收率為99. 49 %~100.22% ,RSD 為 0.82%~1.64%。表1  精密度實驗結果

  3.5   樣品測定將2007-12-13制得的葉黃素樣品,分別于2007-12-14、2008-03-25、2008-04-29在上述色譜條件下檢測(其間樣品在暗處、0℃、密閉保存)每個樣品進樣3次,結果見表3。表3  樣品測定結果結果表明,葉黃素在暗處、0℃長時間放置對葉黃素含量有較明顯影響。

  4   結論

  實驗研究選定了以甲醇-乙腈-醋酸乙酯-水(30∶29∶40∶1)為流動相; 流速0.75 ml·min-1; 檢測波長450 nm; 柱溫25 ℃; 進樣量20 μl的色譜條件,有很好分離效果, 且解決了峰的拖尾問題。本實驗結果表明,葉黃素在一定濃度范圍內呈良好的線性關系, 回收率高, 重復性好,無雜質干擾, 是應用于制備葉黃素產品中控制和測定葉黃素含量,指導生產和控制產品質量的良好方法。

  【參考文獻】

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  [2] O’Donnell, C. D. Functional fututes[J].Prepared Foods,2004,173(4) :1.

  [3] O’Donnell, C. D. Buying into bioactives[J].Prepared Foods,2004,173(4 ) :9.

  [4] José A.Del Campo,José Moreno,Herminia Rodriguez,et al.Carotenoid content of chlorophycean microalgae:factors determining lutein accumulation in Muriellopsis sp.(Chlorophyta)[J].Journal of Biotechnolog y,2000,76:51.

  [5] Whitehead, A. J.; Mares, J. A.; Danis, R. P. Macular pigment: a review of current knowledge[J].Arch. Ophthalmol. 2006, 124:1038.

  [6] C.-Y.Tai,B.H.Chen. Analysis and stability of carotenoids in the flowers of daylily (Hemeorcallis disticha) as afected by various treatments[J]. J.Agri.Food Chem .,2 000,48:5962.

  [7] 王 琦, 許洪高, 高彥祥.葉黃素分析方法研究進展[J].中國食品添加劑,2007,6:100.

  [8] J. Christopher Young, EL-Sayed M., Abdel-Aal, et al.Identification of Synthetic Regioisomeric Lutein Esters and Their Quantification in a Commercial Lutein Supplement[J].J. Agric. Food Chem. 2007, 55:4965.

 


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