主題:重組

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重組人干擾素α1b肌肉注射治療幼兒急疹70例臨床觀察

  【摘要】 目的  討論重組人干擾素α1b肌肉注射治療幼兒急疹的療效。 方法  入院患兒70例隨機分為兩組,兩組患兒均行相同的常規治療(炎琥寧靜點抗病毒,口服清開靈顆粒等),治療組輔助加重組人干擾素α1b肌肉注射按0.5μg/kg,連續3天給予。 結果  兩組患兒用藥3天后臨床療效比較,治療組總有效率91.9%,對照組總有效率51.5%。兩組對比差異有顯著性(P<0.01)。 結論  重組人干擾素α1b肌肉注射治療幼兒急疹,可以縮短療程。
      
 
  我院自1993年5月~2004年5月應用重組人干擾素α1b肌肉注射治療幼兒急疹,獲得了很好療效,現將應用情況報告如下。

  1 對象與方法
    
  70例均為住院患兒,隨機分為兩組,其中對照組33例,男23例,女10例;年齡:4~12個月29例,13~24個月4例;病程<3天17例,病程>3天16例;治療組37例,男25例,女12例;年齡:4~12個月31例,12~24個月6例;病程<3天30例,病程>3天7例。全部病例起病急驟,體溫38.6~38.9℃38例,39~41℃32例。在發病2天內血常規:白細胞4.0~12×10 9 /L15例,白細胞<4×10 9 /L55例。對照組與治療組病情相仿。兩組患兒均行相同的常規治療(炎琥寧靜點抗病毒,口服清開靈顆粒等),在此基礎上對治療組患兒輔加重組人干擾素α1b肌肉注射,按0.5μg/kg,每日1次,連續3天。療效判斷標準:(1)顯效:發熱在1~3天體溫驟降,皮疹出現;(2)有效:發熱在1~3天體溫逐漸下降,皮疹出現;(3)無效:發熱在3天后仍存在者。
     
  2 結果
    
  兩組患兒用藥3天內臨床療效比較,治療組顯效9例,有效25例,無效3例,總有效率91.9%;對照組顯效僅3例,有效14例,總有效率51.5%。經統計學處理差異有顯著性(P<0.01)。
    
  3 討論
    
  重組人干擾素α1b肌肉注射治療幼兒急疹的機制:幼兒急疹是一種無種族及性別差異,一般無流行性,全年均可發病的嬰幼兒期發疹性熱病。目前研究證實,幼兒急疹大部分是人類皰疹病毒-6型(HHV-6)感染引起,出疹前高熱不退,易引起高熱驚厥,因此控制體溫是至關重要的,臨床上除了應用退熱藥及補充水分以及清熱解毒的中成藥以外,應用一種有效的抗病毒藥物可以縮短療程也是不能忽視的。干擾素是一類具有多種生物活性的糖蛋白,分子量2萬~16萬,無抗原性,不被血清中和,也不被核酸酶破壞,具有抗病毒、免疫調節等作用,可分為α、β、γ3種主要類型,具有抗病毒作用的干擾素主要是INF-α、INF-β,其中INF-α抗病毒作用最顯著。它是與細胞表面受體結合,誘導細胞產生多種抗病毒蛋白,可選擇性阻斷病毒mRNA,從而抑制病毒蛋白的合成,也就抑制病毒在細胞內復制;可通過調節免疫功能增強巨噬細胞、淋巴細胞對靶細胞的特異細胞毒作用,有效地遏制病毒侵襲,增強自然殺傷細胞活性;誘導外周血液中單核細胞的2′,5′-寡核苷酸合成酶的活性 [1] 。一般α干擾素100萬IU,為兒科常用,但常常有發熱的副反應,對高熱的患兒需要在降溫后應用。而重組人干擾素α1b是大腸桿菌、酵母菌基因工程重組,臨床應用尚未 見發熱等副反應,而且在發熱時應用未見體溫增高的趨勢。根據臨床應用觀察,重組人干擾素α1b肌肉注射治療幼兒急疹可以縮短療程。     

  參考文獻
    
  1 陳新謙,金有豫,湯光.新編藥物學,第15版.北京:人民衛生出版社,2004,238.     

  作者單位:117000遼寧省本溪市中心醫院兒科

日期:2005年7月7日 - 來自[經驗交流]欄目

世界首個“重組人血小板生成素”正式獲準上市

    國家“863”計劃、 “十五”重大科技項目——重組人血小板生成素(rhTPO,商品名“特比奧”)在沈陽三生制藥股份有限公司10年潛心研發下,日前獲得國家一類新藥證書,成為世界上第一個完成rhTPO臨床試驗并被批準上市的基因工程藥物,從而填補了國際上對骨髓三大血細胞系(紅細胞系、粒細胞系和巨核細胞系)中缺乏調節巨核細胞特異性藥物的空白。 

    科學研究發現,天然TPO是一種造血生長因子。其可通過與特異性受體結合,調節巨核細胞增殖、分化、成熟,從而形成血小板,增加循環血中的血小板數。RhTPO系采用現代重組DNA技術,以哺乳動物細胞作為宿主細胞進行分泌表達,表達產物與天然TPO結構和功能完全一致,能夠特異性提高體內血小板的水平,是國際上最被看好的基因工程蛋白藥物之一。目前國外一流的生物技術公司還處在對rhTPO進行先期臨床實驗階段。然而,沈陽三生制藥股份有限公司克服重重困難,率先完成了二期臨床實驗并獲得了新藥證書和生產批件,且獲得了兩項國家發明專利。此外,rhTPO在TPO重組細胞的構建及篩選、工程細胞的大規模培養、高塘基化蛋白的純化等技術點上都有創新性突破。

    rhTPO用于預防和治療癌癥病人放化療引起的血小板減少。目前治療血小板減少的常用方法是通過直接輸入血小板,該方法具有輸注昂貴、易感染和免疫力降低等缺點。rhTPO是具有糾正血小板減少癥的基因工程藥物,不良反應少。據悉,今年第四季度rhTPO即可完成批量生產且上市銷售。

(轉載自《中國醫藥報》)
日期:2005年6月28日 - 來自[動態]欄目

人組織激肽釋放酶單克隆抗體的制備與初步鑒定 (基金項目)

     基金項目:本課題由江蘇省教委產業化項目(JH01-066)

  【摘要】 目的 將人組織激肽釋放酶(基因命名為KLK1,酶命名為hK1)cDNA克隆入大腸桿菌表達質粒,以重組菌表達的GST-hK1融合蛋白免疫小鼠,獲得了分泌hK1特異單克隆抗體的雜交瘤細胞株。方法 將KLK1cDNA克隆入真核表達質粒,用獲得的重組質粒轉染COS-1細胞,經間接免疫熒光試驗證明,上述單克隆抗體能與轉染細胞發生特異反應。結果 經用方法證明,本研究研制的單克隆抗體還能與雞輸卵管表達的重組hK1發生特異反應。結論 這些試驗結果表明,本研究制備的單克隆抗體能用于hK1的分子特性研究。

Preparation and identification of a monoclonal antibody specific

for humantissue kallikrein

Zhang Lei,Sun Huaichang,Wang Anping,et al.

Jiangsu Provincial Center of Animal Transgenesis and Biopharning,Yangzhou University,Yangzhou225009.

【Abstract】 Objective Establishment of a hybridoma cell line secreting a monoclonal antibody to facilitate iˉdentification of human tissue kallikrein(KLK1gene,hK1protein).Methods Mice were immunized with E.coli-exˉpressed GST-hK1fusion protein and their spleen cells were fused with SP2/0myeloblastoma cells.Specificity of the monoclonal antibody was shown by Western blotting and by immunofluorescence.Results The monoclonal antibody reacted specifically to E.coli-expressed hK1and with the KLK1cDNA-transfected COS-1cells.In addition,the monoclonal antibody could recognize chicken oviduct-expressed hK1in a western blotting assay.Conclusion The monoclonal antibody is specific and useful for identification of hK1.

Key words human tissue kallirein monoclonal antibody identification

人組織激肽釋放酶(EC3.4.21.35)是一種絲氨酸蛋白酶,為激肽釋放酶-激肽系統的核心成員。hK1通過裂解激肽原的特異肽鍵而釋放激肽,從而發揮一系列的生物學功能。早在1934年,Elliot R等 [1] 就報道了hK1與血壓調節有關,這在以后的研究中得到進一步證實 [2,3]。近年來的研究結果表明,hK1除具有降血壓作用外,對腎臟損傷的修復也具有明顯的治療作用 [4] ,還可降低膠原密度、心肌細胞體積和左心室內徑,并能增大毛細血管密度,從而有利于心臟重塑 [5] 。因此,hK1在心血管疾病治療方面具有廣闊的應用前景。

目前,臨床上使用的組織激肽釋放酶主要從豬的胰腺中提取,不僅來源有限,而且有病原污染危險。為了便于hK1基因工程產品的研制,本研究以大腸桿菌表達的GST-hK1融合蛋白為抗原免疫小鼠,利用常規的雜交瘤細胞技術獲得了針對hK1的單克隆抗體,并對其進行了初步鑒定,為重組hK1的分離和鑒定打下了基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 原核表達重組質粒pGEX-KLK1 [6] 、真核表達重組質粒pcDNA-KLK1 [7] 和雞輸卵管特異表達重組載體pOVKLK1 [8] 由本室構建;DMEM基礎培養基、次黃嘌呤(H)、胸腺嘧啶(T)、氨基喋啶(A)為GIBCO公司產品;25kDa聚乙烯亞胺(polyethyleneimine,PEI)、弗氏佐劑和聚乙二醇資助(PEG,分子量1450)購自Sigma公司;GSH和GSSG購自上海伯奧生物公司;豬源性K1標準品購自上海生化試劑公司;雞輸卵管表達的重組hK1由本室制備;犢牛血清購于杭州四季清生物公司;二氨基聯苯二胺(DAB)為華美生物公司的產品;其余試劑均為國產分析純級。

1.2 細胞系和實驗動物 SP2/0骨髓瘤細胞系由揚州大學畜牧獸醫學院微生物教研室提供;COS-1細胞購自中科院上海細胞生物學研究所;ICR母鼠和8周齡BALB/c母鼠由揚州大學實驗動物中心提供。

1.3 免疫原的制備 GST-hK1融合蛋白在大腸桿菌中的表達及不溶性包涵體的制備按發表的方法進行 [9] 。將IPTG誘導和離心沉淀后的重組菌重懸于PBS中,于冰浴中用超聲波裂解菌體,經12000rpm4℃離心10min后,將沉淀(主要為不溶性包涵體)懸浮于洗滌緩沖液(50mMTris-C1,50mA NaCl,1mM EDTA,0.1%Triton x100,100mMβ-ME,2M尿素,pH8.0)中,12000rpm4℃離心10min,收集沉淀,如此反復洗滌3次。然后將沉淀在20mMTris-C1(pH8.0)中離心洗滌1次。向沉淀懸液中加入8M尿素,振蕩混勻和沉淀溶解后加入預冷的復性液(50mM Tris-C1,1mM EDTA,1mM GSSG,1mM GSH,pH8.0),使尿素的終濃度為0.1M,4℃復性12h,取10μl樣品進行SDS-PAGE電泳分析。

1.4 小鼠的免疫 按標準方法 [10] 進行。將50μg復性蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化后,腹部皮下多點注射每只小鼠,以后每隔2周注射1次與弗氏不完全佐劑混合的同量抗原,共注射4次。融合前采集血樣,并用ELISA檢測抗體效價 [11]

1.5 細胞融合及克隆化 免疫小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞的融合按常規方法 [10] 進行。融合細胞在含氨基喋啶的選擇培養液中培養至出現肉眼可見的克隆后,先以GST-hK1融合蛋白為抗原,分別用間接ELISA和Dot-ELISA篩選陽性克隆,然后再以親和層析純化的GST為抗原,篩除針對GST的陽性克隆,剩下的即為針對hK1的陽性克隆。陽性克隆經過2次亞克隆后,獲得1株穩定分泌hK1特異抗體的單克隆雜交瘤細胞株。腹水單抗的制備按常規方法 [10] 進行。

1.6 單克隆抗體的效價測定 以Glutathine Sepharose4B層析柱純化的GST-hK1融合蛋白為抗原,分別用間接ELISA和Dot-ELISA對荷瘤小鼠腹水中的抗體效價進行測定。

1.7 單克隆抗體的鑒定 分別以Glutathine Sepharose4B層析柱純化的GST-hK1融合蛋白、豬源性K1和含重組hK1的蛋清為材料進行蛋白質印跡雜交 [12] 。第一抗體為100倍稀釋的腹水單抗,第二抗體為HRP-標記的羊抗鼠IgG。將5×10 4 個/孔(70%密度)COS-1細胞接種于24孔細胞培養板,在含10%FCS的MEM中培養24h后,按發表的方法 [13] 進行基因轉染。轉染質粒為2μg pcDNA-KLK1,脂質體為10mM25kDa PEI,轉染時間為3h。基因轉染48h后,用預冷的PBS洗滌細胞3次,用預冷的丙酮/乙醇(3∶2)固定液固定3min后進行間接免疫熒光反應 [11] ,第一抗體為500倍稀釋的腹水單抗,第二抗體為FITC標記的兔抗鼠IgG。

2 結果

2.1 雜交瘤細胞株的建立 經4次免疫后,小鼠血清ELISA抗體效價高達1∶8000以上。融合細胞培養上清經DOT-ELISA和ELISA檢測,共獲得6個針對hK1的陽性克隆。對其中的1個克隆進行2次亞克隆和進一步鑒定,獲得1株穩定分泌hK1特異抗體的雜交瘤細胞株,命名為SP-KLK1。

2.2 單克隆抗體的效價 將10 5 個上述雜交瘤細胞注射入經降植烷處理的BALB/c小鼠的腹腔,9天后采集腹水。以親和層析純化的可溶性GST-hK1融合蛋白為抗原,經間接ELISA和Dot-ELISA檢測證明,腹水中的抗體效價高達1∶8000以上。

2.3 單克隆抗體的特異性 為了證明雜交瘤細胞株分泌的是針對hK1的特異抗體,分別以IPTG誘導的pGEX-KLK1轉化菌、IPTG誘導的pGEX-6p-1轉化菌和未誘導的pGEX-KLK1轉化菌裂解物為抗原,進行Western blotting分析,結果僅在IPTG誘導的pGEX-KLK1轉化菌裂解物中檢測到預計分子量(約48kDa)的特異條帶(圖1)。

2.4 單克隆抗體的應用 為了檢驗獲得的單克隆抗體能否用于重組hK1的鑒定,用表達人KLK1cDNA的重組質粒pcDNA-KLK1轉染COS-1細胞,然后以雜交瘤細胞株制備的腹水單抗為第一抗體,以兔抗鼠IgG熒光標記抗體為第二抗體,對轉染細胞進行免疫熒光試驗,結果僅pcDNA-KLK1轉染細胞出現特異的綠色熒光,而在未轉染細胞中無特異熒光(圖2)。

為了進一步驗證上述單克隆抗體能否用于重組hK1的鑒定,分別以正常雞蛋清、大腸桿菌表達的GST-hK1融合蛋白、豬源性K1和含重組hK1蛋清為抗體,以獲得的單克隆抗體進行Western blotting分析,結果正常蛋清未出現條 帶,GST-hK1融合蛋白為一條約48kDa的特異條帶,與豬K1呈陰性反應,在含重組hK1的雞蛋清中出現兩條帶(圖3),約30kDa條帶可能是成熟的rhK1,而33kDa條帶可能是rhK1酶原。

圖1 重組菌裂解物的Westernblotting分析

1.低分子量蛋白質markers;2.TPTG誘導的pGEX-KLK1轉化菌;3.IPTG誘導的pGEX-6p-1轉化菌;4.未誘導的pGEX-K

日期:2005年6月27日 - 來自[論著]欄目

重組人干擾素ω獲臨床批文

    太極集團擁有的我國自主知識產權的“重組人干擾素ω”已獲得國家食品藥品監督管理局頒發的臨床批文。研究表明,“ω干擾素”具有廣譜抗病毒、抗細胞增殖和調節肌體免疫功能的作用。該產品本次獲得的臨床批文有兩個劑型,一個是凍干劑,主要用于治療丙型肝炎,另一個是噴霧劑,主要用于治療鼻炎以及對流感的防治。該產品將由西南藥業生產。 

(轉載自《中國高新技術產業導報》)
日期:2005年6月25日 - 來自[質量監督]欄目

“注射用重組葡激酶”榮獲兩項世界第一和三項中國專利

    近日,國家科技部在北京召開的國家重大科技專項“創新藥物和中藥現代化”新藥成果新聞發布會上宣布,注射用重組葡激酶“施愛克”研發成功并開始實現產業化。這是國家科技部首次為創新藥物召開的新聞發布會。       注射用重組葡激酶是一種新型溶血栓藥物。它具有溶栓速度快、安全性好、血纖維蛋白特異性優等,是世界衛生組織(WHO)推廣進行臨床試驗的第三代溶血栓新藥。中國、比利時、德國、日本于1983年開始同步進行開發研究,我國研制的注射用重組葡激酶凍干粉針至少比其他三國提前兩年完成,并獲得了溶血栓藥物重組葡激酶、重組葡激酶的生產方法、重組葡激酶的抗體制備及檢測方法三項中國專利;同時在世界上第一個獲得《新藥證書》和第一個獲得《藥品生產批準文號》。       預計重組葡激酶的年銷售額可達10億元左右,目前國內外醫藥經銷商包括世界500強企業紛紛趕赴通化,爭奪銷售代理權。(作者:景中明)     (轉載自《醫藥經濟報》)
日期:2005年6月24日 - 來自[動態]欄目

日本制藥企業掀起重組浪潮

    日本醫藥產業界的結構正在發生翻天覆地的變化,重組浪潮一波未平一波又起。這種潮水般的重組應該說是源于越來越壓迫各企業的“內憂外患”的心境。         在近年歐美大型制藥企業收購、兼并(M&A)的背景下,日本制藥企業也開始掀起了一波又一波的重組浪潮。日本醫藥產業界的結構正在發生翻天覆地的變化。         山之內制藥與藤澤藥品工業已于2005年4月1日完成合并,成立新公司Astellas;三共與第一制藥也將于05年10月完成事業合并。這樣,加上武田藥品工業,就形成了日本醫藥產業界三足鼎立的局面,三家企業無論是銷售額還是研究開發投入,規模均將其他企業遠遠地拋到后面。         縱觀上述實施重組的企業,無論是山之內還是藤澤,也無論是三共還是第一制藥,均可以說業績良好。而在并沒有出現業績惡化的日本制藥產業界卻相繼發生重組,其原因何在?         購并主因:成長低迷+外企重壓         一般說來,過度競爭或業績惡化是重組或合并的導火索。但在日本制藥界,這些參與購并的大企業并無赤字,在幾年前日本國內制藥企業也幾乎未曾發生過影響如此巨大的大型合并。然而,由于日本國內市場成長低迷,以及歐美大型制藥企業的重壓,日本各制藥企業相繼實施大型重組,而且愈演愈烈。         日本國內制藥企業正受到來自外資企業的壓力。歐美等外資企業為籌集巨額資金,不斷重組,擴大企業規模。這些重組不光是“相親相愛”的合并,也有兼并收購,而且劍指日本市場。         中外制藥已被羅氏收歸麾下,SS制藥也成為了德國貝林格的子公司等,歐美制藥企業正不斷地在日本擴大勢力范圍。         日本制藥企業雖然也擁有世界通用的研究開發能力,但股價低。市價居首的輝瑞約1800億美元,而日本最大的制藥企業武田也僅是輝瑞市價的五分之一。日本國內中等水平的企業則很有可能成為歐美企業收購的對象。         低迷的日本國內市場成長率使日本國內企業備感沉重。據日本醫藥產業政策研究所的調研,日本國內醫藥市場規模在1993年約為460億美元,2003年約為590億美元,增長率不過23%。而同期美國的市場規模則擴大了約3倍。         目前,日本約占世界市場份額的11%,是僅次于美國列居第二的國家。雖說日本市場低迷,但在外資企業眼里還是魅力無窮,并傾注全力開拓這一市場。         近年來,在日本的外資制藥企業實現了高速增長。         日本國內排名前10家的醫藥企業在1990年的市場占有率為35%,到2003年則下降至32%。而同期的外資10大制藥企業卻大幅度地提高了市場份額,從50%上升至59%。         在包括外資企業在內的日本國內市場上銷售額排名前10名的企業中,輝瑞、諾華、中外制藥(瑞士羅氏全資子公司)三家企業躋身其中。這些外資大型制藥企業不僅擁有新藥,而且還構筑了牢固的銷售基礎。         不僅是大型企業,一些中型企業也在日本市場發起了攻勢。德國貝林格的日本法人擁有帕金森病治療藥等4個世界級產品,揚言“2005年度實現1000億日元(約近10億美元)的銷售額沒有問題”。         此外,2006年度銷售額能進1000億日元的美國強生的衛星企業楊森制藥也聲稱“銷售基礎已經牢固,沒有必要與日本企業結盟了”。         野心勃勃:直指國際超大制藥企業         對于日本大型制藥企業而言,該如何及多大程度地提高其在世界最大的醫藥市場美國的地位乃是重組的最大課題,也是重組的重要目標。         藥品的創新研究必不可少。據美國研究制藥協會調研,該協會會員企業2003年研究開發費為332億美元,而10年前(1993年)僅為127億美元。10年間呈直線上升。         由于研究開發費一味狂漲,為了吸收消化如此龐大的研究開發投入,企業規模的擴大成為了必要條件。上世紀90年代后相繼發生的歐美大制藥企業的M&A就存在此類因素。從研究開發投入對銷售額的比率來看,歐美企業與日本企業差異不大。因而,擴大企業規模,便是增大研究開發費。         輝瑞的研究開發費約80億美元,比日本前10家制藥企業的合計還要多。有分析家指出,要想在全球市場上生存,研究開發費至少要達到Astellas的規模。Astellas的研究開發費為每年1400億日元(按現行匯率約合13億多美元),第一三共為1500億日元(14億多美元),武田為1300億日元(約12億美元)。在日本國內,研究開發投入能超過10美元的制藥企業只有這三家。         歐美企業的銷售額及研究開發投入極其巨大。全球銷售額超過百億美元的企業也只不過排名第14、15位。如三共與第一制藥合并后,銷售額近100億美元,可謂是大型制藥企業,但在世界排名也只不過是15~20名之間。要想參與世界競爭,就必須躋身于前10名,達到年銷售額200億美元以上。因此,必須把目標指向如惠氏、諾華以及羅氏這樣規模的公司。         能被列入世界超大型制藥企業,形成群雄割據局面的只有美國,其他發達國家均只有1~2家,如瑞士2家,德國1家,法國1家,英國2家等。         何去何從:繼續重組還是單打獨斗         可以說,日本制藥企業間重組仍將繼續。但迄今為至,重組尚未涉及日本最大的制藥企業武田,日本排名第4的衛材表示要單打獨斗,日本制藥產業將何去何從?         迄今為止,重組沒有涉及到日本最大的制藥企業武田,也許是因為其他企業還沒有達到能平等對話的規模。而現在應該說Astellas制藥和第一三共已經達到了相應的規模。         而日本排名第4、世界排名第19的衛材卻表示“不考慮與其他大制藥企業結盟”,主張單打獨斗。該公司除原有的神經系統、消化系統領域之外,今后將增加癌癥為重點戰略領域。該公司制訂了2006年銷售額6000億日元(約合57億美元),研究開發費1000億日元(約合9億5千萬美元),2012年銷售額1兆日元(不足100億美元),研究開發費2000億日元(19億美元)的新中期戰略規劃。         不能不說,將事業向特定疾病治療領域集中,也是作為特定領域的專業制藥企業衛材的一種選擇。但如此一來,衛材面臨著重點領域拓寬,而各領域均有世界級別的強大競爭者。從世界制藥產業界來看,與衛材規模相近并采取同樣戰略的有丹麥的諾和諾德公司。衛材將來究竟能否獨自展開事業,目前臨床試驗中的抗癌藥能否如期商品化乃是關鍵所在。         縱觀此波兼并,無論是山之內與藤澤,或是三共與第一制藥,起主導作用的企業經營者均為“工薪社長”,非家族企業的擁有者。而如衛材或鹽野義均為家族擁有的企業。因此,今后日本制藥企業界中家族企業的動態令人關注。         由于日本國家政策是抑制醫療費用,今后市場規模因而難有較大成長,因此,強化企業實力必須通過企業間的合作聯盟。近兩年來,日本制藥產業界相繼開始尋找合并對象。除山之內與藤澤、三共與第一制藥之外,大日本制藥和住友等也達成了合并協議,準備“聯姻”。因此,目前重組并非已到終點。         此外,銷售額百億美元的日本最大的制藥企業武田將何去何從也是今后的焦點。由于武田的戰略是海外先行,如此,也許武田會反過來收購一家歐美企業。 &nb
日期:2005年6月10日 - 來自[數據與行業分析]欄目

天目藥業重組生變,青春寶尋找一線機會

    青春寶集團借收購天目藥業上市的計劃落空了。記者日前從天目藥業一位負責人處獲悉,天目藥業的重組已經最終確定了4家企業,此前呼聲頗高的青春寶集團黯然出局。         據了解,這4家企業分別為浙江萬馬集團、中天建筑集團、奧的斯電梯以及一家上海的房地產企業。         青春寶心動天目         天目藥業是杭州臨安的上市公司。旗下的拳頭產品包括珍珠明目液和復方鮮竹瀝液。從2004年半年報看,這兩個拳頭產品的毛利率高達85.92%和57.05%,但公司的業績一直不好,其中大股東占用資金是重要原因。         公開資料顯示,杭州天目永安集團持有天目藥業30.16%的國有法人股而成為第一大股東,幾年來卻占用上市公司的各項欠款竟然高達1.13億元,這嚴重阻礙了上市公司的發展。         2003年9月,中國證監會發布通知,明令大股東占用資金每個會計年度至少下降30%,并且不允許控股公司以資抵債。去年9月,天目永安集團無奈決定出售股權償還欠款。         “天目藥業在醫藥資源上有優勢,而且有作為殼公司的資源。”知情人士透露,另一個“極為重要”的原因是:天目藥業有一塊幾十畝的廠區地皮——在房價已經很高的杭州市,眼下此地皮已經漲到了200萬元/畝,而天目藥業最初是以8萬元/畝買進的。         “而且據說臨安市政府開的重組條件之一就是另劃一塊地給合作方,作為優惠條件。”一位接近收購方的人士透露,這也是導致天目藥業被頻頻“拋繡球”的重要原因。         可以說,從一開始天目藥業的重組就贏得了眾多企業的關注,而其中最先進入媒體視線的就是浙江萬馬集團和中國青春寶集團。         青春寶集團是我國中藥行業規模最大、經濟效益最好的現代化企業集團之一,依照集團董事長馮根生的理念:“沒有什么好的項目,就不要到股市圈錢。”因此,青春寶在資本市場一直沒有顯山露水。         但天目藥業這個項目卻讓青春寶動了心。去年下半年,集團負責人一直在跟永安集團和臨安市政府溝通,借殼上市之心迫切。         萬馬勝券在握         在此次收購過程中,青春寶遇到了另一個強勁對手萬馬集團。         萬馬集團發跡于臨安,目前總部已遷至杭州,但許多業務仍舊在臨安。該集團此前一直在搞產業,未曾進入資本市場。此次收購,集團專門成立了負責上市的戰略發展部。         業內人士透露,對臨安市政府來說,仍然希望天目藥業重組后仍然“嫁”在臨安。由此看來,萬馬集團勝算較大。而為何萬馬集團遲遲沒有動手將天目藥業拿下?知情人士告訴記者,主要是因為天目藥業這個殼公司要價太高,“比凈資產要高出將近一倍。”         從幾家企業的主業來看,青春寶顯然和天目藥業更為“般配”,但又為何出局?這令人百思不解。         然而,事情似乎還有轉機。知情人士告訴記者,青春寶有可能通過和奧的斯電梯合股收購的方式介入天目藥業重組,而青春寶投資部相關人士也證實了此事。而天目藥業的負責人則稱“還沒有最后定下來。”     (轉載自《醫藥經濟報》)
日期:2005年6月9日 - 來自[數據與行業分析]欄目

人堿性成纖維細胞生長因子基因的克隆、表達及生物活性分析

  【摘要】 目的 研究bFGF對缺血組織血管新生側支循環形成的作用。方法 采用RT-PCR方法,從人扁桃體組織中擴增得到人bFGF cDNA,利用基因重組技術將該基因片段重組與pcDNA3.1(+)真核表達載體上,構建成pcDNA/b。應用脂質體介導的基因轉移技術將重組質粒體外轉染至人臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC)。結果 重組質粒轉染能明顯促進內皮細胞的分裂增殖。進一步將重組質粒通過脂質體介導,體外轉染至人腎細胞293細胞系進行表達,經G418篩選獲得穩定表達的重組質粒細胞克隆。結論 表達產物經雞胚絨毛尿囊膜試驗表明有促血
管生成活性。

  關鍵詞 堿性成纖維細胞生長因子 基因克隆 基因放大 基因表達 

  of human basic fibroblast growth factor  

  Qi Yahui,Wang Yamei,Sun Licui,et al.
 
    Experiment Center,Capital University of Medical Sciences,Beijing100054.

    【Abstract】 Objective To study the bFGF’s effect on the newly formed vascular bypass of ischemic tissue.Methods The human basic fibroblast growth factor(bFGF)cDNA was amplified by RT-PCR from human tonsil tissue,after DNA sequenced,the bFGF cDNAwas inserted into eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+).The reˉcombinant plasmid pcDNA/b was transferred into HUVEC cells mediated by liposome.The transient expression of bFGF was detected by MTT,the results showed that bFGF protein was expressed in HUVEC cells72h after gene transfer.Results It had
 good biological activity to stimulate HUVEC proliferation.The recombinant plasmid pcDNA/b was transferred into293cells mediated by liposome,The positive cells stably expressing of bFGF gene was selected by G418.Conclusion Chick charioallantoic membrane(CAM)bioassay showed that recombinant protein has biologiˉcal activity of hbFGF.

    Key words basic fibroblast growth factor gene clone gene amplification gene expression  

  堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是一種具有多種生物學活性的細胞因子,它對中胚層及神經外胚層來源的細胞包括成纖維細胞、血管內皮細胞、血管平滑肌細胞等都具有明顯的促分裂增殖作用 [1]  。在眾多已發現的誘導血管生成因子中,bFGF被認為是血管生成因子的重要成員。近年來,應用bFGF基因治療缺血性心臟病及其他組織缺血性疾病的研究成為熱點 [2]  。為了深入研究bFGF對缺血組織血管新生、側支循環形成的作用,我們進行了bFGF cDNA基因的克隆及其真核表達載體的構建,并對其生物學活性進行了研究,觀察了重組質粒轉染后對體外培養的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)增殖作用。進一步將重組質粒通過脂質體介導,體外轉染至人腎細胞293細胞系進行表達,用G418篩選穩定表達的重組質粒細胞克隆,并通過雞胚絨毛尿囊膜試驗檢測表達產物的促血管生成活性。

  1 材料與方法

  1.1 材料

    1.1.1 菌種、細胞株及質粒 大腸桿菌DH5α為本室保存。 人臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC)購自北京清源生物公司。質粒pcDNA3.1(+)、pCR-TOPO載體購自Invitrogen公司。

  1.1.2 酶與化學試劑 TaqDNA聚合酶,T 4 DNA連接酶,限制性內切酶購自Promega公司;TOPO TA Cloning kit購自Inˉvitrogen公司;QIAquick gel Extraction kit,QIAGEN plasmid miˉni/midi kit購自QIAGEN公司;細胞培養基Medium-200購自北京清源生物公司;細胞培養基DMEM,G418,LipofecˉtAMINE  TM  Reagent購自GIBCOBRL公司;胎牛血清購自HyˉClone公司;其它試劑均為國產分析純。

  1.2 方法

    1.2.1 引物設計與合成 根據人bFGF cDNA基因序列,設計合成一對引物,引物中加入HindIII酶切位點:5′AAG CTT ATG GCA GCC GGG AGC ATC3′;5′AAG CTT TCA GCT CTT AGC AGA CATTGG AAG3′。

    1.2.2 反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR) 用TRIzol試劑盒提取扁桃體組織總RNA,經AMV逆轉錄酶進行RT-PCR合成cDNA。擴增參數為:50℃,30min;94℃,30s;68℃,3min,40個循環;72℃延伸8min。

    1.2.3 克隆載體的構建 使用新鮮PCR產物與pCR-TOPO載體連接,連接反應按pCR-TOPO載體使用說明進行,37℃LB瓊脂培養基培養,氨芐青霉素及藍/白篩選,挑白色菌落液體培養擴增,提質粒DNA作酶切鑒定,篩選出正確插入克隆。以通用引物SP6進行基因的DNA序列分析,篩選正確克隆pCR-T-b。

    1.2.4 重組真核表達質粒pcDNA/b的構建 用HindIII酶切克隆的pCR-T-b質粒,瓊脂糖凝膠電泳分離,回收純化目的片段;同時用HindIII酶切pcDNA3.1(+)載體,酶切后去磷酸化,瓊脂糖凝膠電泳分離,回收載體片段。用T 4 DNA連接酶將純化的bFGF基因與pcDNA3.1(+)載體片段連接,轉化E.coli DH5α感受態細胞,制備表達質粒;酶切鑒定篩選重組質粒,篩選出的重組質粒進一步測序鑒定。質粒DNA的制備、片段回收、酶切、連接、轉化,參照文獻 [3]  進行。

    1.2.5 重組質粒pcDNA/b轉染HUVEC細胞 采用脂質體轉染法,當HUVEC細胞長至50%~80%的單層后,重組質粒pcDNA/b經GIBCOBRL公司的LipofectAMINE  TM  Reagent介導,轉染HUVEC細胞,按GIBCOBRL公司提供的操作程序進行。轉染后37℃5%CO 2 條件下培養4h,然后更換完全培養基繼續培養,同時設置空白載體pcDNA3.1(+)轉染作為對照。

    1.2.6 MTT法檢測bFGF活性 重組質粒pcDNA/b轉染HUVEC細胞37℃5%CO 2 培養72h后,PBS清洗細胞,每孔加MTT反應液500μl,37℃溫育4h,加DMSO500μl使溶解,吸入96孔酶標板中,用酶標儀讀取A 570  的值,數據用SPSS10.0統計軟件包進行分析。

    1.2.7 統計學方法 數據用均數±標準差表示,用SPSS10.0做t檢驗,α=0.05為顯著性水平。

    1.2.8 重組質粒pcDNA/b轉染293細胞 采用脂質體轉染法,當293細胞長至50%~80%的單層后,將重組質粒pcDNA/b用GIBCOBRL公司的LipofectAMINE  TM  Reagent轉染293細胞,按GIBCOBRL公司提供的操作程序進行。轉染后72h用G418進行篩選,同時用未轉染的293細胞作陰性對照。

    1.2.9 表達產物的生物活性檢測 利用雞胚絨毛尿囊膜法檢測rhbFGF在293細胞中表達產物的生物學活性,實驗方法參照文獻 [4]  進行。

  2 結果

    2.1 人bFGF基因cDNA的RT-PCR結果 以扁桃體組織總RNA為模板,經RT-PCR擴增后,PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳,在標準核酸分子量500bp附近出現1條特異性擴增條帶(圖1)。

    2.2 克隆載體的構建與檢測 新鮮的PCR擴增產物直接與pCR-TOPO載體連接,并轉化到E.coli DH5α感受態細胞中。pCR-TOPO是一個高拷貝數的克隆載體,可以直接與PCR產物連接,重組克隆可直接通過藍/白篩選檢出。提取pCR-T-b重組質粒,用EcoRI單酶切后得到3.9kb(pCR-TOPO)和488bp(插入片段含酶切位點)兩個片段(圖2),表明PCR擴增的基因片段已插入pCR-TOPO載體中。以SP6為測序引物,重組質粒pCR-T-b中的插入片段經測序證明與文獻報道的人bFGF的基因序列一致。

    2.3 真核表達質粒的構建與鑒定 將測序正確的pCR-T-b質粒和pcDNA3.1(+)載體分別用HindIII酶切,瓊脂糖 凝膠電泳回收純化,經T 4 DNA連接酶連接,轉化E.coli DH5α感受態細胞。提取的重組質粒,經HindIII酶切鑒定,得到兩條帶,一條大約5.4kb條帶,另一條474bp左右的條帶,與目的基因預期酶切片段相符。我們選擇經HindIII酶切鑒定正確的3個重組質粒以T7通用引物測序鑒定,篩選出正向插入的重組質粒,插入的目的基因序列與文獻報道相同,表明得到了真核表達質粒pcDNA/b。見圖3。

  圖1 扁桃體組織RT-PCR結果略
   
    圖2 重組質粒pCR-T-b 的酶切分析略
   
    2.4 MTT法檢測bFGF活性 MTT檢測根據酶標儀讀取的各樣品組的A 570  值(表1),計算促細胞生長活性,公式為:促生長率(%)=(實驗組A 570  -對照組A 570  )/對照組A 570  ×100%與pcDNA3.1(+)空質粒對照組相比,pcDNA/b轉染HUVEC細胞后,表達產物能夠刺激HUVEC細胞對MTT的攝取,促生長率為10.48%,表明pcDNA/b組表達產物具有天然bFGF的生物學活性。

  圖3 重組質粒pcDNA/b 的酶切分析略
   
    2.5 pcDNA/b在293細胞中表達 采用脂質體法將 pcDNA/b轉染至293細胞,由于pcDNA3.1(+)帶有CMV啟動子和新霉素抗性基因Neo  r ,所以在動物細胞中可用G418篩選轉染pcDNA/b重組質粒的克隆。轉染72h后,用G418(400mg/ml)加壓選擇抗性細胞克隆,收集細胞培養上清液和細胞裂解液。

    表1 HUVEC細胞轉染72hMTT法A 570  值 (略)
    2.6 表達產物的生物活性分析 用pcDNA/b在293細胞中的培養上清液和細胞裂解液,檢測bFGF對雞胚絨毛尿囊膜誘導血管新生的作用,同時以生理鹽水,pcDNA3.1(+)空質粒在293細胞中的培養上清液和細胞裂解液為對照。實驗結果(圖4),顯示與生理鹽水組和pcDNA3.1(+)空質粒對照組相比,pcDNA/b組的細胞培養上清樣品對雞胚絨毛尿囊膜血管新生的促進作用不明顯,而pcDNA/b組的細胞裂解液樣品有較明顯的促血管生成作用,表明細胞裂解液中有rhbFGF的表達,具有促血管生成的生物學活性。

  圖4 rhbFGF誘導雞胚絨毛尿囊膜血管新生略

  
    3 討論

  bFGF是一種具有多種生物學活性的細胞因子,在機體胚胎發育、骨骼形成、血管新生、創傷修復以及腫瘤形成過 程中起著重要的作用。作為血管生成因子的成員,促進血管生成是bFGF重要的生物學功能之一 [5]。bFGF在體內可以趨化血管內膜的各類細胞,并誘導這些細胞表達組織重建所需的血漿酶原激活劑、膠原酶、蛋白水解酶等。這些酶類通過促使血管基底膜降解和刺激內膜各類細胞增殖與遷移,誘導血管內皮細胞在膠原基質中形成管腔,并促進神經元與新生血管共同生長 [6]  。因此,bFGF轉基因治療作為一種新的治療手段,在缺血性心臟病及其他組織缺血性疾病治療方面的研究倍受關注。

    本實驗通過RT-PCR技術從人扁桃體組織中克隆并篩選出bFGF的cDNA,經測序鑒定后,將目的基因克隆到帶有CMV啟動子和增強子的pcDNA3.1載體上,成功構建了真核表達載體pcDNA/b。我們以陽離子脂質體Lipofecˉtamine介導pcDNA/b轉染HUVEC細胞,經MTT檢測證實重組質粒轉染后,表達產物能夠刺激HUVEC細胞增殖,具有bFGF的生物學活性。進一步將重組質粒通過脂質體介導,體外轉染至人腎293細胞系進行表達,經G418篩選獲得穩定表達的重組質粒細胞克隆,表達產物經雞胚絨毛尿囊膜試驗表明有促血管生成活性。本研究證明,我們構建的bFGF真核表達載體在人血管內皮細胞以及人腎細胞293細胞系中均能正確表達,且表達產物具有較高的生物學活 性,為利用bFGF轉基因治療肢體及心肌缺血性疾病的研究奠定了實驗基礎。

  參考文獻

    1 Inoue K,Sakai T,Hattoori M.The cell-adhesive effect of basic fibrobˉlast growth factor on pituitary cells in vitro.J Endocrinol,1991,130(3):381-386.

    2 Giacia-Martinez C,Opolon P,Trochon V,et al.Angiogenesis induced in muscle by a recombinant adenovirus expressing functional isoforms of basic fibroblast growth factor.Gene Ther,1999,6(7):1210-1221.

  3 Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.分子克隆實驗指南.第二版.北京:科學出版社,1995:34-57.

    4 姜志鋼,鄂征.雞胚絨毛尿囊膜檢測腫瘤促血管生長作用改良技術方法.解剖學雜志,1989,12(2):143-145.

    5 王雅梅.血管生成因子研究進展.生物技術,2002,12(3):48-50.

    6 郭慶,溫進坤.堿性成纖維細胞生長因子.生命科學,1997,9(2):15-18. 

  基金項目:北京市科委科技合同項目(編號:954024800)

    作者單位:100054北京首都醫科大學實驗中心

日期:2005年5月25日 - 來自[論著]欄目
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