主題:白色念珠菌

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微生物所在白色念珠菌有性生殖的社會性調控研究中取得重要進展

白色念珠菌white細胞促進opaque細胞交配有性生殖是地球上生物進化的重要推動力,其方式多種多樣,并普遍存在于真核生物中。人體病原真菌白色念珠菌有性生殖方式的獨特之處在于...即將發布

日期:2014年10月23日 - 來自[技術要聞]欄目

微生物所白色念珠菌形態發生和致病性研究取得突破


菌落與細胞形態 A. 白色菌落為“White”形態,粉色菌落為“Gray”形態,紅色菌落為“Opaque”形態;B. 三種形態的掃描電鏡照片。

生物應對環境變化和生存的能力與其獨特的生物學特征密切相關。白色念珠菌(Candida albicans)是人體內常見的一種機會性致病真菌。由于抗生素的濫用、艾滋病的流行、癌癥化療和器官移植等新的醫療技術的應用,導致有免疫系統缺陷的人大量增加。因此也導致以白色念珠菌為主的真菌感染成為我國及全世界日益嚴重的問題。白色念珠菌的最重要的生物學特征就是形態的可塑性和多樣性。越來越多的研究表明,白色念珠菌應對宿主體內環境變化的能力和致病能力與其形態多樣性密切相關。

最近,中國科學院微生物研究所真菌學國家重點實驗室黃廣華課題組在白色念珠菌中發現了一種新的形態,稱之為 “Gray” 形態(the gray phenotype)。“Gray” 形態與上個世紀80年代發現的 “White” 和 “Opaque” 形態可以相互轉換,并形成一種 “white-gray-opaque” 三穩態的轉換系統。很大一部分被測試的菌株都能進行這種三穩態形態轉換,說明該轉換系統普遍存在于臨床菌株中。“Gray” 形態與 “White” 和 “Opaque” 形態的白色念珠菌在細胞形態、交配能力和致病性等方面有明顯的區別。“Gray”細胞為桿狀、形態較小,“White” 細胞為橢球形、中等大小,而 “Opaque”細胞較大、也呈桿狀。“Gray”細胞交配能力介于“White” 和 “Opaque”細胞之間。胞外分泌性的天冬氨酰蛋白酶(Saps)是白色念珠菌中主要的毒性因子,尤其在皮膚和黏膜感染中起重要作用。在蛋白質或皮膚組織的誘導下,“Gray”細胞分泌胞外天冬氨酰蛋白酶的能力最強。因此,在皮膚和黏膜感染中,“Gray”細胞致病力最強。在系統感染中,“White” 細胞致病力最強,“Gray”和 “Opaque”細胞較弱,這可能是由于“White” 細胞具有較強的菌絲生長能力。轉錄組分析表明,三種不同形態細胞各種表達譜明顯不同,并各自表達一系列獨特的形態特異性相關基因。在三種形態相互轉換的調控中,轉錄因子Efg1和Wor1起關鍵的作用。EFG1是維持“White” 細胞穩定必需的基因,而WOR1是維持“Opaque” 細胞穩定必需的基因。同時敲除EFG1和WOR1則可以將細胞鎖定在“Gray”細胞狀態。因此,Efg1和Wor1協同調控“white-gray-opaque”三穩態轉換系統的運轉。該研究揭示了一種全新的白色念珠菌致病形態,豐富了對該菌形態多樣性和致病特性的認識,提出了“三穩態”系統概念,將為進一步揭示致病菌與宿主相互作用的機理,尋找新型抗真菌藥物靶點提供理論依據。 

該課題在中科院“百人計劃”和國家自然科學基金委相關項目資助下完成,并得到了微生物所鐘瑾課題組和白逢彥課題組的支持。相關研究成果最近發表在國際雜志PLoS Biology上。

日期:2014年4月11日 - 來自[技術要聞]欄目

微生物所致病真菌白色念珠菌形態轉換研究取得新突破


A. 菌落與細胞形態(白色菌落為白菌,紅色菌落為灰菌);B. 白菌-灰菌形態轉換調控模型。

形態轉換對于病原真菌迅速適應宿主多變的微環境具有重要作用。白念珠菌(Candida albicans)是人體內一種重要的機會性致病真菌,通常共生于健康人體內不引起任何不良反應,但在免疫受損的人群中可能引起器官黏膜感染和危及生命的血液感染。近年來,由于廣譜抗菌素的廣泛使用,癌癥化療和器官移植等新的醫療技術的應用,艾滋病的流行和人口的老齡化,導致以白色念珠菌為主的真菌感染成為臨床上日益嚴重的問題。

白色念珠菌既是人體共生菌又是病原體的兩面性,是由其獨特的生物學特征決定的,是與宿主相互作用中長期共進化的結果。白色念珠菌致病性與其形態發生和有性生殖密切相關。上世紀80年代,美國Soll實驗室首次發現白色念珠菌能進行一種可逆且可遺傳的形態轉換,即“白菌-灰菌形態轉換”。白菌和灰菌細胞在形態、毒性、對宿主免疫細胞的敏感性及交配能力等多個方面都有差異。長期以來,人們一直認為臨床上只有小部分菌株(低于8%)能進行白菌-灰菌形態轉換,這些菌株交配型都是純合的(MTL, a/a或α/α)。而在臨床上占主導地位的MTL雜合型(a/α)菌株,雖然其基因組中含有全部形態轉換所必需的基因,但以前從未發現過有白菌向灰菌轉換的現象。

最近,中科院微生物研究所黃廣華課題組和白逢彥課題組合作研究發現,在模擬宿主環境條件下,白色念珠菌MTL雜合型菌株與純合型菌株一樣,也能進行白菌-灰菌形態轉換。MTL雜合型菌株的灰菌菌落和細胞形態與純合型菌株相似,且灰菌與白菌在不同小鼠感染模型下的毒性具有明顯差異。進一步研究發現,轉錄因子Rfg1、Brg1和Efg1等作為負調控因子,Wor1、Wor2和Czf1等作為正調控因子,協同調控白菌-灰菌形態轉換關鍵基因WOR1的表達,從而決定MTL雜合型菌株形態的建成。該研究揭示了白色念珠菌白菌-灰菌形態轉換的普遍性特征,增進了對該菌宿主微環境適應、致病性和有性生殖中的認識,修改了白菌-灰菌形態轉換調控理論,并為預防和治療念珠菌病提供了新的思路,具有重要的臨床意義。 

該研究在“百人計劃”和國家自然科學基金委相關項目資助下完成,并得到了微生物所張立新課題組和美國加州大學舊金山分校 Sandy Johnson實驗室的支持。相關研究成果最近發表在國際雜志PLoS Biology上。 

日期:2013年4月9日 - 來自[技術要聞]欄目

Nature:新發現改寫微生物教科書

白色念珠菌Candida albicans通常是一種無害的微生物,但有時也會轉變為致命的病原菌。與許多其他真菌和單細胞生物一樣,白色念珠菌一直被認為只進行無性繁殖。但明尼蘇達大學和特拉維夫大學的新研究顯示,白色念珠菌是可以進行有性繁殖的。

這一突破性的發現于一月三十日發表在Nature雜志上,有助于理解白色念珠菌的演化,幫助人們預防和治療這一致病菌引發的嚴重感染。

白色念珠菌是最常見的一種感染人類的真菌,存在于人體腸道的大型微生物群之中。人體腸道的大多數微生物都是無害的,與之不同的是,白色念珠菌這種單細胞酵母有時會引發疾病,例如鵝口瘡(口腔感染)和系統性血液感染等等。HIV/AIDS、器官移植或化療導致的免疫缺陷者常會發生白色念珠菌系統性血液感染,最終導致器官衰竭和死亡。

自然界大多數單細胞生物是通過分裂來進行繁殖的,不過也有一些能進行無性生殖、準性生殖(parasexually)或有性生殖。而科學家們長期認為白色念珠菌的繁殖不需要進行交配。

采用無性生殖或準性生殖的生物是二倍體,它們具有兩套染色體,因此不需要配偶就可以進行繁殖。有性生殖的生物是只具有一套染色體的單倍體。人們一直認為白色念珠菌是雙倍體,但新研究顯示這種酵母有時也以單倍體形式存在,而且這些單倍體可以進行有性生殖。

有性生殖能夠結合兩個親本的遺傳物質,是高等生物演化的推動力。盡管白色念珠菌的單倍體分離株在群體中并不多見,Judith Berman教授還是在體外培養和動物宿主中分別檢測到了單倍體形式的白色念珠菌。研究顯示,這些白色念珠菌單倍體能與其他單倍體交配生成雙倍體菌株,它們的遺傳物質相結合為真菌演化提供了必要的多樣性。

現在,研究人員能夠利用白色念珠菌的單倍體分離株,對這種病原菌進行遺傳學研究,例如可構建白色念珠菌的隱性突變文庫。此外,人們還可以利用單倍體的有性生殖,設計基因工程改造的二倍體菌株,以便更好的理解白色念珠菌與其宿主之間的相互作用,解析它們從無害微生物轉變為致命病原菌的具體機制。

(生物通編輯:葉予)

日期:2013年1月31日 - 來自[技術要聞]欄目

123株白色念珠菌耐藥基因CDR1和CDR2表達研究

【摘要】  目的 了解白色念珠菌對常用抗真菌藥物的耐藥性及其耐藥基因CDR1、CDR2的表達情況。 方法 常規方法分離123株臨床菌株,科瑪嘉念珠菌顯色培養基作菌種鑒定,采用Rosco紙片擴散法進行藥敏試驗,所有耐藥株與隨機選擇的同等數量的敏感株(對照株)用聚合酶鏈反應(PCR)擴增目標基因CDR1、CDR2,擴增產物經凝膠電泳后進行初步分析。 結果 123株白色念珠菌分布于呼吸道50.4%(62/123)、泌尿道28.5%(35/123)、生殖道14.6%(18/123)和其它6.5%(8/123)。通過藥敏篩選,獲得耐藥菌株35株,其中有15株出現交叉耐藥。受試菌對兩性霉素、5-氟胞嘧啶、咪康唑、伊曲康唑和氟康唑的敏感率分別為99.2%、85.4%、87.0%、84.6%、和83.7%。35株耐藥株和對照株均出現耐藥基因CDR1、CDR2。 結論 白色念珠菌對常用抗真菌藥物的敏感性呈下降趨勢,編碼外排蛋白的耐藥基因CDR1和CDR2可能同時存在于全部受試菌株內。

【關鍵詞】  白色念珠菌 耐藥 CDR1 CDR2

近年,廣譜抗生素和免疫抑制劑的廣泛使用、年齡結構老齡化、有創性診斷和治療技術的推廣,導致條件致病性白色念珠菌感染的機會大幅增加。然而,隨著抗真菌藥的大量和長期應用,耐藥菌株相繼出現,已成為臨床治療的難題。為此,我們收集123株白色念珠菌,就其耐藥情況和耐藥基因CDR1、CDR2基因的表達情況進行初步研究,為臨床治療提供參考依據。

  1  材料與方法

  1.1  材料

  1.1.1  標本來源  收集2007年5~7月廣州醫學院第一附屬醫院和廣東省中醫院臨床分離的白色念珠菌123株。

  1.1.2  質控菌株  質控菌株ATCC64548、ATCC45550購自衛生部藥物鑒定所。

  1.1.3  主要試劑  科瑪嘉(CHROMagar)念珠菌顯色培養基(鄭州博賽生物科技有限公司),改良SHADOMY真菌藥敏平板(江門凱林貿易有限公司),蛋白胨、葡萄糖、瓊脂、酵母提取物Yeastextact(英國,OXOID公司),氯仿、異丙醇(江都市陽光節能化工有限公司),trizol試劑(凱基生物科技發展有限公司),基因擴增增引物、DNA Marker、RNA逆轉錄配套試劑、PCR配套試劑(北京賽百盛公司)。

  1.1.4  主要儀器  Vitek-2全自動細菌鑒定儀(法國,Bio-Merieux公司),雙向電泳儀(中國,北京六一儀器廠),UP紫外凝膠成像系統UP紫外透射儀(英國,UVP公司),PCR擴增儀(美國,BioRad PE公司)。

  1.1.5  藥敏紙片  兩性霉素B 10μg/pic,氟胞嘧啶1μg/pic,咪康唑10μg/pic,伊曲康唑8μg/pic,氟康唑25μg/pic,均購自廣州市迪景微生物科技有限公司。

  1.2  方法

  1.2.1  標本分離與鑒定  標本按常規接種于沙氏平板培養24h,取直徑在0.5~1.5mm、光滑、凸起、濕潤的小白菌落涂片鏡檢,如為念珠菌,取菌落接種在科瑪嘉(CHROMagar)念珠菌顯色平板上,35℃培養24h,觀察結果。在顯色培養基上生長為淡綠色菌落為白色念珠,同時用Vitek-2全自動細菌鑒定儀進行菌種鑒定。

  1.2.2  藥敏試驗  將已鑒定的白色念珠菌、質控菌株ATCC64548和ATCC45550,分別用生理鹽水配制成0.25麥氏比濁懸液,菌液均勻涂布于真菌藥敏平板上。選用Rosco藥敏紙片:兩性霉素B(Amphotericin B,AMB)10μg/pic、5-氟胞嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)1μg/pic、咪康唑(Miconazole,MIC)10μg/pic、伊曲康唑(itraconazole,ITR)8μg/pic、氟康唑(fluconazole,FCA)25μg/pic,35℃孵育24h,量取藥敏環直徑。結果判斷參考美國NCCLSM-27A的真菌藥敏標準,藥敏抑菌環符合以下情況者為敏感株:AMP>15mm、5-FU>20mm、MIC>20mm、ITR>16mm、FCA>22mm。藥敏抑菌環只要符合下述標準中的其中一項則視為耐藥:AMP<10、5-FU<11、MIC<12、ITR<9、FCA<14。

  1.2.3    總RNA的抽提[1]和逆轉錄  所有耐藥株與隨機選擇的同等數量的敏感株(對照株)接種于YPD固體培養基(酵母提取物Yeastextact 10g,瓊脂、葡萄糖和蛋白胨各20g,10ml含50mg氯霉素的95%乙醇,加滅菌水至1 000ml配制而成),35℃培養24h,再一次轉種到YPD培養基,35℃培養24h以保證菌株的純度。選取3~4個單個菌落加入已有1mlTrizol試劑的1.5mlEP管,吹打混勻,室溫下靜置5min,加入氯仿0.2ml,振蕩器上振蕩15s,靜置3min,4℃ 12 000g離心5min,取全部上清并加入0.5ml異丙醇,靜置10min,4℃ 12 000g離心10min,棄去上清,加入75%乙醇1ml,振蕩1min,4℃ 7 500g離心5min,棄去上清,沉淀室溫下干燥5~10min,復溶于40μl 1%DEPC水中。取上述溶液5μl,加入oligo(DT)18 1μl,混勻,70℃水浴5min后,放置于冰上,加入5XM-MLV buffer 4μl,dNTP 1μl,100mMDTT 2μl,RNasin 0.25μl,Reverse Transcripase0.5μl,DEPC水6.25μl,混勻,置42℃,1h,95℃,10min。

  1.2.4  PCR擴增  使用CDR1,CDR2,TEF3(內參)引物3對[2],分別為:
   
  CDR1(UP)  5’-CCAACAATACAAGACCAGCAT-3’
   
  CDR1(DOWN)  5’-ACCATAGCCAATAACAACACG-3’
   
  CDR2(UP)  5’-GCAACTCACAACATCCAAGA-3’
   
  CDR2(DOWN)  5’-GAGTCGTCTGGTTTCTTCAA-3’
   
  TEF3(UP)  5’-AGAAACCGTCCACTTGTTG-3’
   
  TEF3(DOWN)  5’-GTGCAAGAAAATGGTGGCAAAT-3’
   
  反應體系[2]:PCR反應體系20μl,包括:10xTaq Buffer 2μl,MgCl2 1.6μl,dNTP 1μl,模板2μl,上游引物0.5μl,下游引物0.5μl,TaqDNA聚合酶,雙蒸水12.2μl。擴增程序:預變性94℃ 2min,94℃  30sec,50℃ 30sec,72℃ 30sec 30個循環,72℃延長10min。

  1.2.5  擴增產物電泳  取PCR擴增產物4.5μl與0.5μl 10×buffer 混勻后,在1%瓊脂糖凝膠(0.5xTBE緩沖液配制)中電泳20min(TAE緩沖液、100V),溴化乙錠染色,凝膠成像系統觀察記錄電泳結果。

  2  結果

  2.1  標本分布  所收集的123株白色念珠菌主要來源于呼吸道和泌尿系統,其中呼吸道標本62株(50.4%),尿液標本35株(28.5%),其次為白帶標本18株(14.6%),而源于其他的標本僅8株(6.5%)。

  2.2  藥敏試驗  藥敏試驗結果見表1。結果可見:白色念珠菌對兩性霉素B的敏感率最好,其余各種藥物都出現不同程度的耐藥。同時出現交叉耐藥的情況:5-FU耐藥的菌株中有2株耐MIC,1株耐ITR;在ITR耐藥株中,有2株出現MIC耐藥,7株出現FCA耐藥;在FCA耐藥株中,有1株MIC耐藥,還有1株對3種唑類藥物出現耐藥。

  表1  123株白色念珠菌對常用藥物的耐藥情況(略)

  2.3  PCR擴增結果  35株耐藥菌株和35株對照菌株,PCR擴增CDR1、CDR和TEF3(內參)基因,結果發現70株白色念珠菌均出現上述3個基因片斷。在517bp、566bp和380bp各處出現一明亮的條帶,與TEF3、CDR1和CDR2的擴增片斷大小相吻合。

  圖1  CDR1、DR2電泳結果(略)

  1:DNA Marker;2-3:耐藥株CDR1陽性;4:敏感株CDR1陽性;5-6:耐藥株CDR2陽性;7:敏感株CDR2 陽性;8:TEF3內參。

  3  討論
   
  白色念珠菌是臨床上最常見的致病酵母菌,近年來,由于艾滋病的流行,廣譜抗生素的濫用,化療、放療、免疫抑制劑的應用,年齡結構老年化,以及有創性診斷和治療的推廣,白色念珠菌的機會性感染率顯著上升,由此感染而引起的多器官功能衰竭以及死亡的產生日益增加。本試驗123株白色念珠菌的臨床標本分布發現,白色念珠菌感染主要侵襲呼吸道,其次為泌尿道和生殖道。值得注意的是呼吸系統的感染占主要地位,這可能與本院呼吸道感染患者較多,且多數患者病情重并較長時間使用抗生素密切相關。
   
  20世紀80年代以來,先后推出了酮康唑(KTC)、氟康唑(FCA)、咪康唑(MIC)、伊曲康唑(ITR)等抗真菌藥物,并在臨床上得到廣泛應用,隨之白色念珠菌對唑類藥物出現耐藥性,1978年,Holt等[3]首次報道念珠菌尿路感染的患兒在連續服用9周咪康唑后,對該藥產生耐藥,GrayBill[4]發現伴發念珠菌血癥的HIV患者抗真菌治療失敗率達20%~30%,這與念珠菌的高耐藥性相關。國內田防震等[5]報道白色念珠菌耐藥率分別為AMB(9.3%)、ITR(9.7%)、FCA(10.5%)。周小明[6]等則報告白色念珠菌對FCA的耐藥率高達46.8%,ITR、AMB分別為7.2%和3.6%,而沈萍[7]等認為白色念珠菌對5-FU、AMB、ITR和FCA均具有極高的敏感率(96.7%~99.7%),耐藥率最高的ITR僅為1.2%,其余3種抗真菌藥耐藥率均為0.3%。國內對白色念珠菌耐藥情況的結果差異較大。本試驗結果顯示,白色念珠菌對常用抗真菌藥的敏感率分別為99.2%(AMB)、85.4%(5-FU)、87.0%(MIC)、84.6%(ITR)和83.7%(FCA),結果與喻華[8]報道(ITR:82.26%、FCA:81.94%)相近,但與報道[2,4]有較大差異,與廣州地區的報道[9]相比,除了對AMB的敏感率(98.9%)接近外,對5-FU(94.9%)、ITR(67.0%)、FCA(91.2%)的敏感率也有較大差異,提示白色念珠菌耐藥性可能與各個醫院之間菌株來源和用藥壓力不同而導致的差異密切相關。本試驗結果還顯示白色念珠菌對兩性霉素B、氟胞嘧啶、咪康唑、伊曲康唑、氟康唑中度敏感率分別為0.8%、2.4%、8.9%、1.6%和7.3%,提示中度敏感菌株增多,而中度敏感菌株增多,提示白色念珠菌對唑類藥物敏感率下降。
   
  伴隨著臨床深部真菌感染率的上升,臨床使用抗真菌藥物的頻率、劑量明顯增加,白色念珠菌出現了交叉耐藥情況,Magaldi等[10]發現HIV患者44.7%的菌株對氟康唑產生耐藥,在這些耐氟康唑的菌株當中,又有93.3%對伊曲康唑交叉耐藥。本試驗123株白色念珠菌有35株耐藥菌株,其中有15株出現交叉耐藥,特別是有1株白色念珠菌同時對3種唑類藥物出現耐藥。提示白色念珠菌耐藥現象將越來越嚴重,交叉耐藥菌株的出現將給臨床治療帶來棘手的問題。
   
  藥物作用靶點的基因突變或過度表達以及細胞對藥物的主動外排以減少藥物在細胞內的積聚,是真菌的主要耐藥機制[11],其中,藥物外排能力的增強導致胞內藥物濃度降低,可能是白色念珠菌最主要的耐藥機制[12,13]。目前研究主要集中在外排基因CDR1的表達上,CDR1為白色念珠菌最早發現的外排基因,有研究顯示[14],白念珠菌CDR1 基因的高表達與氟康唑耐藥有關,氟康唑耐藥株CDR1 mRNA的表達水平比對應的敏感株要高出很多,而胞內藥物的濃度則很低,Lyons等[15]的研究證實,mRNA水平的升高是由CDR1、CDR2和MDR基因轉錄增強所致。國內韓旭東等[16]報道氟康唑能誘導白色念珠菌外排基因CDR1高表達而引起耐藥,但也有報道[17]認為并非所有耐唑類藥物的白色念珠菌都出現CDR1的表達,White[18]發現耐藥株和敏感株都出現CDR1的表達,結果差異提示有必要就CDR1的表達與白色念珠菌耐藥的關系作進一步研究。CDR2是白色念珠菌另一外排基因,但目前CDR2報道少見。
   
  本試驗對35株耐藥和敏感株(對照株)用PCR擴增目標基因CDR1、CDR2,結果發現耐藥和敏感菌株均分別在517bp、566bp和380bp處出現一明亮的條帶,與TEF3、CDR1和CDR2的質控片斷大小相吻合。外排基因CDR1和CDR2均在耐藥和敏感的白色念珠菌中表達,結果與文獻[15]報道相一致,提示白色念珠菌無論是耐藥還是敏感,都存在CDR1和CDR2外排基因的表達,都有可能出現對抗真菌藥物的外排,但外排能力的產生并不代表白色念珠菌耐藥現象的出現,CDR1或CDR2的表達量與耐藥性的關系,有待進一步研究。

【參考文獻】
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作者單位:廣州醫學院第一附屬醫院檢驗科,廣東 廣州 510120; 廣州醫學院檢驗系學生,廣東 廣州 510120

日期:2010年1月13日 - 來自[2008年第8卷第8期]欄目

白色念珠菌磷脂酶B的研究進展

【摘要】  目的 介紹近年來對磷脂酶B及其與白色念珠菌毒力關系的研究進展。 方法 查閱國內外大量關于磷脂酶B的研究文獻,并進行詳述。 結果 白色念珠菌是最常見的條件性致病真菌。磷脂酶B是磷脂酶家族中的重要成員,與90%的念珠菌磷脂酶細胞外活性有關,在白色念珠菌的毒力方面起著重要作用。 結論 磷脂酶B的研究成果將有助于進一步明確白色念珠菌的致病機制、耐藥機制,為抗真菌藥物的開發及白色念珠菌病的診斷和治療等方面提供了新的前景。

【關鍵詞】  白色念珠菌 磷脂酶B 毒力

白色念珠菌(Candida albicans,CA)是人體皮膚粘膜的正常寄生菌,也是臨床上重要的條件致病性真菌。它可引起皮膚、黏膜及內臟的念珠菌病,是免疫力低下宿主感染的重要致病真菌之一,可導致淺表或深部的白色念珠菌病。因此,白色念珠菌的毒力問題一直廣受關注。目前認為,細胞外磷脂酶B是其潛在的毒力因素,在白念珠菌感染的早期發揮作用[1]。現將白色念珠菌磷脂酶B的研究進展綜述如下。

  1  白色念珠菌細胞外磷脂酶
   
  早在二十世紀六十年代,Costa等就報道了白色念珠菌分泌細胞外磷脂酶。隨后在含有血清和羊紅細胞的培養基上的研究也發現,很多白色念珠菌的致病性菌株具有磷脂酶活性[2]。在此之后,磷脂酶與念珠菌毒力的相關性就逐漸受到人們的重視。目前已經證實磷脂酶在念珠菌對宿主細胞的穿入、損傷和溶解中發揮著作用。因此,磷脂酶被納入念珠菌毒力因子的范疇內。同時,越來越多的學者開始對念珠菌細胞外磷脂酶進行研究。
   
  磷脂酶廣泛存在于生物體內。根據磷脂酶作用的特異性脂鍵的不同,將其歸為磷脂酶A、B、C和D四類。盡管所有磷脂酶都可以水解磷脂,但一種酶只能特異性地切斷某種脂鍵。Ibrahim等通過與標準的磷脂酶A2、磷脂酶B、磷脂酶C、磷脂酶D在蛋黃平板培養基上產生的沉淀圈的對照分析,發現白色念珠菌的磷脂酶主要是磷脂酶B[2]。Ghannoum認為在所有磷脂酶家族成員中磷脂酶B與90%的念珠菌磷脂酶細胞外活性有關[2]。

  2  磷脂酶B的分子生物學研究
   
  磷脂酶B具有水解酶和溶血磷脂酶-轉酰基酶的活性。水解酶的活性可清除磷脂(磷脂酶B的活性)和溶血磷脂中的脂肪酸(溶血磷脂酶的活性),轉酰基酶活性則將游離脂肪酸轉移到溶血磷脂而生成磷脂。這些復雜的性質導致了對其命名的混亂[2]。因此,有些學者稱為磷脂酶B,有些學者稱為溶血磷脂酶-轉酰基酶。近來,通過對磷脂酶B編碼基因的克隆和敲除,進一步證實了該酶具有水解酶和溶血磷脂酶-轉酰基酶的活性。
   
  研究推測,磷脂酶B包括5個多基因家族成員。但目前僅在白色念珠菌上分離到B1、B2、B5三個亞型,并已得到了白色念珠菌磷脂酶B1、B2的編碼基因[3~5]。20世紀90年代初,Mirbod等通過聚丙烯酰胺凝膠電泳技術從磷脂酶活性較高的白色念珠菌中純化了磷脂酶B。該酶是一種分泌型糖蛋白,分子量84kD,由605個氨基酸殘基組成。通過測序發現,其基因包括6700個堿基序列,其中包括一個1818個堿基對構成的開放讀框結構。該磷脂酶的水解酶活性為117μmol·min-1·mg-1,轉酰基酶活性為459μmol·min-1·mg-1,最適pH為6.0。而后,Leidich等[3]在研究中將該純化蛋白命名為白色念珠菌磷脂酶B1。應用wra-blaster技術打斷目的基因構建了磷脂酶B1缺陷型菌株,該株表達的磷脂酶B1分子量是66.441kD。其分子量低于野生菌株,推測野生型菌株與缺陷型菌株間這種分子量的差異是由于野生型菌株在蛋白質翻譯后再次進行糖基化的結果。白色念珠菌磷脂酶B1與釀酒酵母、點青霉、德色魯克串孢和粟酒裂殖酵母等真菌的磷脂酶具有較高同源性[6],其同源性分別為 45%、42%、48%和38%。另外,除白色念珠菌磷脂酶B1外,其它菌種的磷脂酶B1的羧基端都有一段信號肽,此信肽最終被糖基化磷脂酰肌醇(Glycosylphatidylinositol,GPI)結合位點所替代。此位點與磷脂酶B1結合后將磷脂酶B1固定在細胞膜上,或與細胞壁上的幾丁質結合而固定于細胞壁上。GPI結合位點對磷脂酶B1向細胞外的釋放起調節作用。由于白色念珠菌磷脂酶B1的羧基端無這一信號肽,其分泌失去了GPI位點對它的調節,故而持續性地分泌到細胞外。
   
  1999年,Sugiyama等[5]用相似于克隆caPLB1的方法克隆到caPLB2編碼基因而證實并純化了磷脂酶B2,該酶的分子量為67kD,由608個氨基酸殘基組成,與釀酒酵母、德色魯克串孢和粟酒裂殖酵母的同源性分別是42%、46%、42%。與白色念珠菌磷脂酶B1一樣無疏水性的羧基端,白色念珠菌磷脂酶B2的分泌同樣失去了GPI結合位點的調節,而持續性地分泌到細胞外[7]。
   
  最近,Theiss等人[3]又首次分離到了磷脂酶B5,它是目前在白色念珠菌分離到的磷脂酶B家族的第三個成員。但是目前對其功能尚不十分清楚。推測其具有GPI結合位點,通過RT-PCR發現,念珠菌絲狀生長及各種環境因素都會影響到該酶基因的表達。通過對基因缺失突變株的研究進一步發現,該酶是磷脂酶A(2)發揮功能所不可缺少的重要因素。
   
  目前認為這些被分泌的磷脂酶起源于細胞膜或細胞壁。Siafakas[8]等通過掃描新生隱球菌的磷脂酶B發現,磷脂酶B通過GPI結合在細胞壁上。磷脂酶B1上含有β-1,6-葡聚糖,該結構與細胞壁上的β-1,3-葡聚糖形成共價結合。β-1,3-葡聚糖酶可以水解β-1,3-葡聚糖而使磷脂酶B從細胞壁上脫落下來。加熱等環境因素可以使磷脂酶B在細胞壁上聚集而使分泌量減少,以及細胞外磷脂酶上檢測到的β-1,6-葡聚糖結構都證實了細胞外磷脂酶來源于致病真菌的細胞壁。

  3  細胞外磷脂酶B與白色念珠菌毒力的關系

  3.1  對念珠菌侵襲力的影響  白色念珠菌磷脂酶B可以分解宿主細胞膜磷脂而引起膜的通透性增高和完整性受損,從而促進白色念珠菌的侵入。Leidich等[4]用掃描電鏡觀察磷脂酶B缺陷型和野生型白色念珠菌對上皮細胞和臍靜脈內皮細胞的穿透性時發現,它們對上皮細胞和臍靜脈內皮細胞的穿透率差異明顯。分別取野生型和缺陷型白色念珠菌培養的上清液加于上皮細胞,發現野生型菌株的上清液對上皮細胞的損傷率是缺陷型菌株上清液的兩倍。白色念珠菌的磷脂酶B1基因敲除株(CAplb1)的生長和出芽不受影響,僅出現磷脂酶活力的下降。采用二種動物模型測定了CAplb1株的致病性,在血源播散性小鼠模型中,CAplb1株在組織器官中的清除率和小鼠的存活率均有顯著提高;在口腔胃腸道幼鼠模型中,CAplb1株僅侵入腸粘膜內層,引起輕微的中性粒細胞浸潤性炎癥反應,而野生株可侵入粘膜下層,有明顯的中性粒細胞浸潤性炎癥反應,并可導致系統性感染。運用免疫熒光法測定磷脂酶B在白色念珠菌感染小鼠和患者體內的表達,結果顯示在感染的血清、組織器官以及在感染的過程中均有磷脂酶B的高滴度表達。以上數據證明了磷脂酶B是白色念珠菌經胃腸道感染和引起血源性感染的重要毒力因子[9]。但CAplb1株并非完全沒有毒力,這也證明了白色念珠菌的致病性是多種毒力因子共同參與的結果。

  3.2  磷脂酶B分泌的特殊性  正如前文所述,多數磷脂酶疏水的梭基往往被糖基化磷脂酰肌醇(GPI)替代[8],GPI可與細胞膜或細胞壁上的成分結合并調節這種酶的分泌。白色念珠菌磷脂酶B1、B2缺少這一結構,這也就意味著白色念珠菌磷脂酶B1、B2的分泌不像非病原性真菌磷脂酶分泌那樣需依賴GPI的調節,因此能直接而持續地分泌。

  3.3  磷脂酶B與藥物敏感性的關系  磷脂酶可以水解兩性霉素B脂質體中的磷脂鍵,而促進其釋放。Swenson等[10]研究發現,兩性霉素B脂質體對磷脂酶B缺陷型菌株的最小抑菌濃度高于野生型菌株,提示白色念珠菌磷脂酶B有可能促進了兩性霉素的釋放。但是,通過兩性霉素B脂質體治療磷脂酶B缺陷型菌株感染的小鼠模型依然有效,因而推測兩性霉素B脂質體中兩性霉素B的釋放與白色念珠菌和宿主的磷脂酶B均有關系。Gottfredsson等[11]將白色念珠菌和新生隱球菌的磷脂酶缺陷株與野生株分別進行藥敏試驗,卻并沒有發現兩者對兩性霉素B脂質體敏感性的顯著性差異,并據此認為細胞外磷脂酶活性并不影響其對兩性霉素B脂質體的敏感性。可見兩性霉素B的釋放機制復雜,尚需進一步研究。

  3.4  磷脂酶B與其他毒力因子的關系  凡是能夠在宿主體內表達并增強念珠菌致病力的因素,我們均可認為是念珠菌的毒力因子。比較公認的毒力因子包括粘附力、分泌型蛋白酶、磷脂酶等。許多學者認為白色念珠菌磷脂酶B與白色念珠菌對上皮細胞的粘附有關。但是Leidich等[3]通過掃描電鏡觀察磷脂酶B缺陷型菌株和野生菌株對上皮細胞的粘附性時,并未發現二者有明顯差異。因此,認為磷脂酶B僅直接損傷宿主細胞膜,并不直接影響白色念珠菌的粘附力。Samaranayake等人[12]通過研究HIV患者口腔念珠菌磷脂酶的活性與其他毒力因子的相關性時,也指出念珠菌磷脂酶B基因的表達與其他毒力因子沒有明顯的相關性。

  4  展望
   
  重要的臨床致病真菌如白念珠菌、新生隱球菌及煙曲霉均產生磷脂酶B,說明此酶可能是在致病真菌中普遍存在的毒力因子[13]。因此我們應進一步深入研究磷脂酶B對宿主細胞侵害的具體機制,了解其致病機理,而有可能通過抑制該酶而進行念珠菌病的治療。Chen等已首先鑒定了念珠菌磷脂酶的抑制因子并分析了這種能夠抑制磷脂酶活性物質的結構。可以預測,以真菌磷脂酶為靶位點的研究開發等將具有廣闊的研究前景。
   
  多種致病真菌均可產生磷脂酶B。隨著分子生物學研究的不斷深入,念珠菌基因組全序列測定的完成[14],以及各種亞型磷脂酶B的提純和編碼基因的克隆,我們可以生產出各種特異性的念珠菌磷脂酶B作為抗原抗體反應的抗原。應用該純化的抗原與患者血清中的抗體結合,進行高度特異和敏感的診斷性實驗,該血清學診斷方法,將能很好的解決傳統單純培養的陽性結果不能很好區分是正常寄生還是已經發生病的問題,做到對念珠菌病的早期診斷。
   
  我們可以相信,磷脂酶B的研究成果將有助于進一步明確白色念珠菌的致病機制、耐藥機制,為抗真菌藥物的開發及白色念珠菌病的診斷和治療等方面提供了新的前景。

【參考文獻】
    [1] 蘇英,李春陽.敏感和耐藥白念珠菌磷脂酶活力與其毒力關系的研究[J]. 2007, 45 (5); 535~537.

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  [3] Theiss S, Ishdorj G, Brenot A, et al. Inactivation of the phospholipase B gene PLB5 in wild-type Candida albicans reduces cell-associated phospholipase A2 activity and attenuates virulence[J]. Int J Med Microbiol, 2006, 296(6):405~420.

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  [5] Sugiyama Y, Nakashima S, Mirbod F, et al. Molecular cloning of a second phospholipase B gene, caPLB2 from Candida albicans[J]. Med Mycol, 1999, 37(1):61~67.

  [6] Merkel O, Fido M, Mayr JA, et al. Characterization and Function in Vivo of Two Novel Phospholipases B/Lysophospholipases from Saccharomyces cerevisiae[J]. J Biol Chem, 1999, 274(40):28121~28127.

  [7] Richard M L, Plaine A. Comprehensive Analysis of Glycosylphosphatidylinositol-Anchored Proteins in Candida albicans[J]. Eukaryot Cell, 2007, 6: 119~133.

  [8] Siafakas A R, Sorrell T C, Wright L C, et al. Cell Wall-linked Cryptococcal Phospholipase B1 Is a Source of Secreted Enzyme and a Determinant of Cell Wall Integrity[J]. J Biol Chem, 2007, 282(52):37508~37514.

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  [11] Gottfredsson M,Jessup CJ. Fungal Phospholipase Activity and Susceptibility to Lipid Preparations of Amphotericin B[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2001,45: 3231~3233.

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作者單位:大理學院基礎醫學院醫學微生物及免疫學教研室,云南 大理 671000

日期:2010年1月13日 - 來自[2008年第8卷第6期]欄目

培養條件對兩性霉素B抑制白色念珠菌作用的影響

【摘要】  目的 綜合考察各種因素(不同的培養基、培養基的pH值、真菌接種濃度等)對AmB抑制白色念珠菌作用的影響,為臨床合理用藥提供理論依據。方法 液體稀釋法。結果 在不同的培養基中,AmB對白色念珠菌的MIC值不同,隨著pH的增高及真菌接種菌液濃度增加,其MIC值增加。結論 AmB對白色念珠菌的MIC值會受到多種因素的影響,所以,進行藥物的抗菌活性研究時應制定并嚴格執行統一的標準。

【關鍵詞】  兩性霉素B;白色念珠菌;抑制

Influence of culture conditions on MIC values of amphotericin B against Candida albicans

    LIU Li-ying,DONG Xiao-qing,WAN Dan-min.Medical College of Chinese People’s Armed Police Force,Tianjin 300162,China

    【Abstract】  Objective  To investigate the effects of various factors, such as the type of medium, Ph of medium, size of inoculum on the activity of amphotericin B (AMB) against Candida albicans, so as to provide evidences for rational use of the drug. Methods  The broth dilution test was examined.Results  The activity of AmB against Candida albicans was influenced by the type of medium.The minimum inhibition concentrations (MIC) increased with the increase of pH and inoculum concentration. Conclusion  The study of antifungal activity must establish and strictly implement unified standard.

    【Key words】  amphotericin B; Candida albicans; inhibition

    藥物的抗真菌活性受到多種因素的影響,例如,不同的培養基、培養基的pH值、培養時間、培養溫度、真菌接種濃度、真菌形態、血清、有氧與厭氧環境等。兩性霉素B是目前臨床上應用的抗真菌藥物,本研究是綜合考察各種因素對其抑制白色念珠菌作用的影響,為臨床合理用藥及進一步藥用價值的開發奠定基礎。

    1  實驗材料

    1.1  菌株  白色念珠菌Cla,購于中國醫學真菌保藏中心。

    1.2  藥品  兩性霉素B(amphotericin B,AmB),上海先鋒藥業公司,上海第二制藥廠生產。AmB溶于蒸餾水中制備成濃度為1280μg/ml的藥物原液,過濾除菌。臨用時用滅菌蒸餾水稀釋為128μg/ml最高濃度藥液。

    1.3  培養基  改良沙氏液體培養基(1%蛋白脈,4%葡萄糖);YEPD培養基(2%蛋胨,2%葡萄糖,1%酵母浸粉)。

    1.4  其他  HZQ-X100A型恒溫振蕩培養箱(上海一恒科學儀器有限公司產品);5000μl、1000μl加樣槍(法國GILSON產品);SN-CS-2D單人凈化工作臺(蘇州凈化設備廠);改良沙堡氏液體培養基(北京奧博星生物技術責任有限公司)。血球計數板、顯微鏡、濾器(水質濾膜)等。

    2  實驗方法

    2.1  不同的培養基對MIC值的影響  取活化2次并處于對數生長期的白色念珠菌,用血球計數板計數菌濃度使約為105cfu/ml,以液體稀釋法[1]測定改良沙氏液體培養基和YEPD培養基對最低抑菌濃度的影響:(1)2~10管加1ml培養基;(2)1管加1ml藥液(128μg/ml),2管加1ml藥液(128μg/ml),然后用槍尖吹打混勻,吸取1ml到第3管,依次倍比稀釋至第8管后棄去;(3)取上述濃度為105cfu/ml的0.1ml菌液按9→1的順序加入上述9管中,28℃培養24h,不攪動情況下,以培養基清晰的試管為菌株100%受抑制,此管的藥物濃度即為最低抑菌濃度(MIC)。

    2.2  培養基pH值對MIC值的影響  用0.1mol/L甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH 3~5)和磷酸鹽緩沖液(pH 6~8)調整沙氏培養基的pH分別為3、5和8,然后按上述方法測定MIC值。

    2.3  接種真菌濃度對MIC值的影響  將濃度為102cfu/ml,103cfu/ml,104cfu/ml,105cfu/ml,106cfu/ml的菌液接種于改良沙氏液體培養基,其余步驟與上法同,測定其MIC值。

    3  結果

    3.1  不同的培養基對MIC值的影響  AmB在兩種培養基中的最低抑菌濃度不同,在改良沙氏液體培養基(pH 5~6)中的MIC為8μg/ml,在YEPD液體培養基(pH 5~6)中的MIC為16μg/ml。

    3.2  培養基pH對MIC值的影響  結果發現在沙氏培養基中,pH為3時其MIC值為32μg/ml,pH為5時其MIC值為8μg/ml,pH為8時在最高藥物濃度的條件下白色念珠菌也能很好的生長。

    3.3  接種真菌濃度對MIC值的影響結果  見表1。表1  接種真菌濃度對MIC值的影響結果

    4  討論

    培養基的種類及其pH、接種真菌濃度對抗真菌藥物在試管內的抗真菌活性影響很大[2]。如氟康唑在低pH時活性可降低1000倍。甚至同一種培養基,由于pH不同,其抗菌活性也不一樣[3]。因此,國外在研究抗生素和化學合成藥物的抗真菌活性時,對使用的培養基種類及其pH非常重視,常選用不同的培養基和把同一種培養基調整成不同的pH進行研究。國內絕大多數研究者只用沙氏培養基,對培養基的pH也沒有進行調整,所以可能影響某些藥物的抗真菌效果。pH的不同可能是藥物在兩種不同培養基中的MIC不同的原因之一。在不同的實驗中,實驗條件不盡相同,需要接種與積累的菌量不同。所以需考察接種真菌菌液濃度對藥物敏感性的影響。如表1所見接種真菌量在102、103、104、105、106cfu/ml時,PLAB對白色念珠菌的MIC分別為2、4、8、8、32μg/ml。隨著接種菌量的增加,最低抑菌濃度也增加,這可能與藥物需作用于真菌細胞的數量有關,接種菌量的大小直接影響抗真菌藥物的抗菌效果。在一般情況下,在一定范圍內,接種的菌量越大,藥物的抗菌效果往往就越差。如很多研究者在做中藥抗絲狀真菌實驗時,直接從菌種中取一小塊菌塊接種到含藥培養基中。這樣,不同研究者取的菌塊大小差別較大,甚至同一研究者在同一批實驗中,在不同的試管中接種的菌量也不一樣,這就會影響中藥抗真菌實驗結果的準確性。這也可能是對同一種藥物,不同研究者所得的結果不一致的主要原因[4]。AmB具有較強的抗白色念珠菌的作用,其抗白色念珠菌的活性依賴于所選擇的實驗條件,體外MIC決定于培養基的種類、培養基的pH值、接種菌量、血清的加入量、培養時間、氧氣的含量等。在改良沙氏培養基的MIC低于在YEPD培養基中的MIC;接種濃度增加,抑菌效果降低;抑菌活性有pH依賴性,在低pH時,藥物的MIC較低,在高pH時,藥物的MIC顯著升高。多年來,抗真菌藥物敏感試驗方法不統一,與體內藥效不完全一致,以致發展緩慢。美國國家臨床實驗室標準委員會的抗真菌藥物敏感性試驗專門委員會于1992年公布了世界第一個試驗標準M27-P(NCCLS),酵母菌液體培養基稀釋法抗真菌藥物敏感性實驗的參考方法,用于規范藥物敏感性實驗的方法,以使得所得的實驗結果更加可信,更加有利于指導臨床用藥。

【參考文獻】
  1 劉運德.微生物學檢驗.北京:人民衛生出版社,2004,150-151.

2 劉偉,李若瑜.抗真菌藥物敏感性試驗在真菌感染防治中的作用.中華檢驗醫學雜志,2005,28(4):349-351.

3 關洪全.抗真菌中藥研究方法學的幾點思考.中國中醫基礎醫學雜志,2000,6(6):404-406.

4 Kazuo Iwata,Yoshinori Yamamoto,Hideyo Yamaguchi,et al.In vitro studies of Aculeacin A,a new antifungal antibiotic.J Antibiotics.1982,35(2):203-209.


作者單位:天津,中國人民武裝警察部隊醫學院

日期:2009年8月24日 - 來自[2009年第9卷第1期]欄目

白色念珠菌菌絲生長的誘導機制

人類血清可以有效地誘導多態真菌病原體——白色念珠菌的菌絲生長,白色念珠菌會導致嚴重感染。真菌腺嘌呤環化酶Cyr1p是cAMP/PKA信號傳導通路的一個關鍵組成部分,該通路控制著不同的相關感染性狀,包括菌絲的形態形成。然而,目前有關血清菌絲誘導特點及其真菌傳感器的機制仍屬未知。
  
在7月17日《細胞—宿主與微生物》(Cell  Host  &  Microbe)發表的一項最新研究中,Xu等人的分析結果表明,活化血清的組分中含有細菌的類肽聚糖(PGN)分子。而有幾個純化和合成的胞壁酰二肽(MDPs)與細菌的類肽聚糖的亞基能夠有效地促進白色念珠菌的菌絲生長。
  
通常情況下,哺乳動物的傳感器Nod1和Nod2可以通過LRR域識別PGN的類似物,Xu等人的研究表明,胞壁酰二肽(MDPs)可以通過直接與其LRR域結合來激活Cyr1p。如果在宿主和白色念珠菌感染的腸道內有豐富的PGN存在,新的研究結果對這種病原體的感染機制具有重大意義。(科學網  武彥文/編譯)
日期:2008年8月13日 - 來自[技術要聞]欄目
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