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手性與手性藥物

【摘要】    近年來,手性藥物的臨床意義引起人們的廣泛關注,手性藥物的開發已成為國際研究的熱點。本文對手性和藥物手性的概念、研究的實際意義以及手性藥物研究現狀進行闡述,說明手性藥物具有廣闊的市場前景。

【關鍵詞】  手性;手性藥物

  Chirality and Chiral Drug

    WAND Dan,HE Lang

    (Department of biochemistry and molecular biochemistry,Chengdu Medical College,Chengdu 610083,China)

    Abstract:Recently,clinical sigmificance of chiral drug attracts wide attention.Exploration of chiral drug was an heated discussion of internatiomal research.The paper expounded the concept of chirality and drug ,chiral actual meaning of research,and progresses on the research of chiral drug,showed that market foreground of chiral drug was extensive.

    Key words:Chirality;Chiral drug.

   1  手性

    手性是自然界的普遍特征。構成自然界物質的一些手性分子雖然從原子組成來看是一摸一樣,但其空間結構完全不同,他們構成了實物和鏡像的關系,也可比喻成左右手的關系,所以叫做手性分子[1]。在生命的產生和演變過程中,自然界往往對一種手性有所偏愛,如自然界中,糖的構型為D-構型,氨基酸為L-構型,蛋白質和DNA的螺旋構象又都是右旋的,等等。因此,分子手性在自然界生命活動中起著極為重要的作用。人類的生命本身就依賴于手性識別。如人們對L一氨基酸和D一糖類能夠消化吸收,而其對映體對人類沒有營養價值,或有副作用。

    人們對手性的研究可以追溯到1874年第一位化學諾貝爾獎獲得者Jhvan[2]。當時他就提出了具有革命性的理論化學分子為三維結構,一些化合物存在兩種構像,且兩者互為鏡像。1886年,科學家報道了氨基酸類對映體引起人們味賞感受的差別。1956年Pfeifer根據對映體之間藥理活性的差異,總結出:一個藥物的有效劑量越低,光學異構體之間藥理活性的差異就越大。即在光學構體中,活性高的異構體與活性低的異構體之間活性比例越大,作用于某一受體或酶的專一性越高,作為一個藥物它的有效劑量就越低。20世紀50年代中期,反應停(沙利度胺,Thalidomide)作為鎮靜劑,有減輕孕婦清晨嘔吐的作用而被廣泛應用。結果在歐洲導致1.2萬例胎兒致殘,即海豹嬰。于是1961年該藥從市場上撤消。后來發現沙利度胺R型具有鎮靜作用,而S型卻是致畸的罪魁禍首。研究人員進一步研究發現沙利度胺任一異構體在體內都能轉變為相應對映體,因此無論是S型還是R型,作為藥物都有致畸作用。1984年荷蘭藥理學家Ariens極力提倡手性藥物以單一對映體上市,抨擊以消旋體形式進行藥理研究以及上市。他的一系列論述的發表,引起藥物部門廣泛的重視。2001年諾貝爾化學獎授予了3位美日科學家,表彰他們在手性催化氫化反應和手性催化氧化反應領域所做出的重大貢獻。目前,研究和發展新的手性技術,借此獲得光學純的手性藥物,已成為許多實驗室和醫藥公司追求的目標。

    2  藥物的手性

    據統計,1800個藥物,具有手性中心的就有1026種,占57%。現在市場上只有61種藥物是以單對映體形式存在,其余均為外消旋體(左、右旋各半)混合形式。研究表明,不同的對映體在人體內的藥理,代謝過程,毒性和療效存在著顯著差異[2-5],大致有以下幾個類別:

    2.1  對映體之間有相同或相近的某一活性

    如丙氧芬右旋具有鎮痛作用,左旋具有鎮咳的作用,二者作用相似。而普萘洛爾左旋體和右旋體具有殺滅精子的作用,其對映體均可作為避孕藥,作用相同。抗凝血藥華法林(Warfarin)以外消旋體供藥,研究發現其S-(-)異構體的抗凝血作用比R-(+)體強2 6倍,但S-(-)異構體在體內消除率亦比R-(+)體大2—5倍,所以,實際抗凝血效力相似。

    2.2  一個對映體具有顯著的活性但其對映體活性很低或無活性

    一般認為若某一對映體只有外消旋體的1% 的藥理活性,則可以認為其無活性。因為這微小的活性可能來源于摻雜于該單一對映體中微量的活性單一對映體。例如氯苯吡胺(撲爾敏,Ehlorpheniramine)右旋體的抗組胺作用比左旋體強100倍。抗菌藥氧氟沙星的s-(-)-異構體是抗菌活性體,而R-(+)-異構體則無活性。屬于這一類的藥物還有是氯霉素、芬氟拉明、吲哚美辛等。

    2.3  對映體有相同、但強弱程度有差異

    某一活性抗癌藥環磷酰胺(Ey-elophosphamide),其手性中心不是在通常的碳原子,而在磷原子。其(S)-異構體活性是(R)-異構體的2倍,然而,對映體毒性幾乎相同。有時一個異構體具有較強的副作用,也應予考慮。如氯胺酮(Ketamine)是以消旋體上市的麻醉鎮痛劑,但具有致幻等副作用,進一步的藥理研究證實(S)-異構體活性是(R)-異構體的三分之一,卻伴隨著較強的副作用。

    2.4  對映體具有不同性質的藥理活性,可以分幾種情況來討論

    2.4.1  對映體的不同活性,可起到“取長補短、相輔相成”的作用  一個突出的例子是利尿藥茚達立酮(Indaerinone)。其(R)-異構體具有利尿作用,但有增加血中尿酸的副作用;而(S)-異構體有促進尿酸排泄的作用。進一步的研究表明對映體達到一定比例能取得最佳療效。

    2.4.2  對映體存在不同性質的活性,可開發成2個藥物   丙氧芬(Pmpoxyphene)的右旋體(2S、3R)為鎮痛藥,但左旋體(2R、3S)具有鎮咳作用,現在兩者已分別作為鎮痛藥和鎮咳藥應用于臨床。柳氨芐(Labetalol)是一種心管藥,其RR異構體是α1阻滯活性的β阻滯劑,產生β阻滯作用,而阻滯活性則歸因于SR體,用于治療高血壓的是RR體。

    2.4.3  一個對映體具有療效,而其對映體產生副作用或毒性  青霉胺(Penieillamine)的D一型體是代謝性疾病和鉛、汞等重金屬中毒的良好治療劑,但它的L-型體會導致骨髓損傷,嗅覺和視覺衰退以及過敏反應等臨床上只能用D-青霉胺。又如,酞胺哌啶酮(反應停)的S-(+)異構體具有鎮靜的作用而R-(-)異構體可引起致畸反應。

    2.4.4  對映體具有相反的活性  巴比妥類藥物的對映體對中樞神經系統發生相反的作用,如1-甲基-5-苯基-5-丙基巴比土酸,其(R)-異構體有鎮靜、催眠活性,而(S)-異構體引起驚厥。

    由此可見,當手性藥物、農藥等化合物作用于這個不對稱的生物界時,兩個異構體表現出來的生物活性往往是不同的,甚至是截然相反的:即一個異構體對疾病起作用,而另一個異構體卻療效甚微,或不起作用,甚至可能有毒副作用。為此,1992年美國FDA[6]開始要求,手性藥物以單一對映體(對映體純)形式上市。這樣不僅療效確切、副作用小,且臨床用量少。

    3  手性藥物

    手性藥物(chiral drug)是指其分子立體結構和它的鏡像彼此不能夠重合,將互為鏡像關系而又不能重合的一對藥物結構稱為對映體(enantiomer),對映體各有不同的旋光方向:左旋、右旋、外消旋,分別用(-)、(+)、(±)符號表示。藥物分子的手性標記通常采用R/S序列標記法。對于氨基酸、肽類、糖類、環多元醇及其衍生物的立體命名,也用D、L或俗名表示。過去多數化學藥品是由等量的左旋(S型)和右旋(R型)兩種對映體組成的外消旋體,只含有單一對映體即光學純度較高的藥物,與外消旋藥物相比,具有療效好、副作用小等特點[7]。

    3.1  手性藥物的作用機制

    手性藥物的藥理作用是通過與體內大分子之間的嚴格手性匹配與分子識別而實現的[8],也就是在人體內藥物通過與具有特定物理形態的受體反應起作用。藥物的兩種立體異構體中,只有一種更適合與受體或活性部位結合。如果兩種立體異構體都能適合受體,結合將是不太緊密的,因而藥物將會不太活潑。通常,一種同分異構體有選擇地結合,而另一種具有較小的或無活性。

    3.2  手性藥物的制備

    合成手性藥物的方法主要有化學合成法和生物合成法兩種[9-11]。化學合成法是指采用化學控制等手段來獲得手性化合物,主要有:①不對稱合成法就是將不對稱因素如手性試劑、催化劑等作用于某種底物進行反應,使之只形成一個對映體的手性產品;②化學拆分法將外消旋體轉化為非對映體,由于非對映體的物理性質不相同,人們可以將它們分開,最后再把分離得到的兩種衍生物分別變為原來的旋光化合物,即可達到拆分的目的。③選擇吸附法利用某種旋光性物質作為吸附劑,使之選擇性的吸附外消旋體中的一個異物體,從而達到拆分的目的。另外,還有動力學拆分法、色普拆分法、物理拆分法、手性源合成法等。

    生物合成法是指利用生物催化劑進行手性化合物拆分核不對稱合成的方法。主要有①天然產物提取法從生物體內分離提取手性化合物是最直接、最原始的獲得手性物的方法。由于受生物資源和手性物含量的限制,此法難以滿足人類對某些有價值的手性物日益增長的需要;②酶法拆分外消旋體利用生物酶將外消旋體進行拆分,得到光學純的化合物;③酶法不對稱合成利用酶的高度立體選擇性,潛手性的底物可選擇性地轉化為光活化合物。另外,還有微生物法、催化抗體法、現代生物技術等方法獲得手性藥物。

    3.3  手性藥物的研究現狀

    自從1992年美國FDA開始要求手性藥物以來,手性藥物在研發的新藥中所占比例逐年增加[18],據市場統計1993年單一對映體藥物的銷售額為350億美元,而至1997年年銷售額約增加到400~600億美元,1999年世界藥品市場有1/3為手性藥物,2000年增加到40%,全球銷售額達到1330億美元,2002年全球500種暢銷藥物中手性藥物有289種,占59%,專家預計2008年達到2000億美元,2010年可望超過2500億美元。由于手性藥物市場前景看好,巴斯夫、陶氏化學、羅地亞等國際知名企業均成立了各自的手性中間體開發機構。如美國陶氏化學與澳大利亞Alchemia公司合作,專門從事手性碳水化合物類藥品與營養品寡聚糖類的開發;羅地亞與Aldrich公司合作,共同投資300萬美元生產手性醫藥中間體;Cambrex公司與Syn-thon公司也在著手開發一系列手性藥物中間體[12-14]。

    我國手性藥物的工業生產多采用傳統的拆分方法,對外消旋最終產物或對消旋中間體進行拆分。早在上世紀6O年代我國就開展了甾體化合物的微生物轉化研究,并用于工業生產。從上世紀70年代后期開始,我國進行手性化合物的生物合成研究,實現了L天冬氨酸和L-蘋果酸的工業化。最近幾年,多種化學合成手性藥物及其中間體實現了工業化。我國手性藥物工業雖有一定基礎,但在化學合成和生物合成的工業化應用并不多,與世界手性工業的發展有較大差距。我國“十五”期間已投入200億元進行手性關鍵技術的研發,在該領域取得了重要的科研成果。四川大學在設計和制備手性固定相方面已獲得發明專利,并完成產業化技術的開發。此外,們還開發了生物催化拆分與獲得發明專利的特殊分離技術聯用,制備手性藥物中間體光學活性戊醇等的生產技術。中科院成都有機所將手性技術推向市場,將包結拆分技術應用于手性藥物的生產,取得了較好的經濟效益。成都生物所在手性生物技術開發和應用方面,也取得了顯著成就[15-17]。

    4  展望

    手性藥物不僅具有技術含量高、療效好、副作用小的優點,而且與創制新藥相比,開發手性藥物相對要風險小,周期短,耗資少,成果大,不僅具有重大的科學價值,同時也蘊藏著巨大的經濟效益。目前,我國面臨入世后的激烈競爭,如何發展有自主知識產權的手性藥物及合成方法,已成為化學、生物學、醫學和藥學等學科急待攻克的熱點問題。專家[18]對我國手性藥物的研發提出了4點建議:一是加強單一異構體的合成技術開發;二是開發具有自主知識產權的新藥;三是重視手性分析設備特別是手性柱的開發應用;四是加強與制劑、生物學等學科的合作交流。研究人員在選擇手性藥物產品開發課題前,應加強交流,優勢互補聯合攻關,避免重復投入。

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日期:2013年2月27日 - 來自[2006年第1卷第2期]欄目

柱前衍生化高效液相色譜法拆分人體血漿和尿液中阿替洛爾對映體的研究

    摘要高效液相色譜法分離和測定人體血漿和尿液中S(-)-和R(+)-阿替洛爾對映體。選用鹽酸甲氧胺為內標,R(+)-苯乙基異氰酸酯為衍生化試劑,ODS為固定相,流動相為水-甲醇-異丙醇-二氯甲烷(53.2∶41.6∶4.8∶0.4),熒光檢測波長235/300nm(Ex/Em)。血、尿樣品經堿化后乙酸乙酯提取,并用氯仿2次抽提。S(-)-和R(+)-阿替洛爾對映體血、尿樣品的線性范圍分別為10~1000ng/mL和25~1500ng/mL,絕對回收率均在84%以上,RSD均小于6.0%。此法已經用于阿替洛爾對映體的藥代動力學和藥效學研究。

  關鍵詞:阿替洛爾對映體高效液相色譜法衍生化法

  阿替洛爾(Atenolol,AT)為選擇性β1受體阻滯劑,存在著對映異構體(enantiomers),目前臨床上使用的制劑均以S和R對映體各半混合的外消旋體(racemate)形式給藥。2種對映體不僅在藥理作用的類型、強度而且在生物體內的吸收、分布、代謝等方面都存在顯著差異。因此,分離和測定生物體液中的AT對映體十分必要和具有重要意義。為了研究AT對映體的藥代動力學和藥效學,本文采用苯乙基異氰酸酯作為衍生化試劑,建立了柱前衍生化HPLC法,用于拆分人體血漿和尿液中的AT對映體。

  1、試藥與儀器

  S(-)-AT和R(+)-AT購自Aldrich公司,內標鹽酸甲氧胺(MethoxamineHCl)標準品購自Sigma公司。消旋AT標準品,含量>99%,由天津中央藥廠提供。鹽酸阿替洛爾片:50mg/片,為市售藥品。手性衍生化試劑R(+)-苯乙基異氰酸酯(R(+)-1-Phenylethylisocyanate,R(+)-PEIC)購自Fluka公司。水為三蒸水。其它試劑均為國產分析純。

  高效液相色譜儀(美國惠普公司),包括HP1050泵、1046A熒光檢測器、ODSHypersil(250mm×4mm,5μm)色譜柱和1050色譜工作站。

  2、實驗方法

  2.1 標準液的配制鹽酸甲氧胺、消旋AT、S(-)-AT和R(+)-AT分別用甲醇配制成儲備液,貯存于4℃冰箱,每次使用前再以甲醇稀釋成各種濃度的工作液。手性衍生化試劑R(+)-PEIC避光貯存于冰箱,臨用前以氯仿稀釋(1∶400)。

  2.2 HPLC色譜條件流動相:水-甲醇-異丙醇-二氯甲烷(53.2∶41.6∶4.8∶0.4);流速1.0mL/min,柱溫25℃;檢測波長:λEx=235nm,λEm=300nm。進樣量:20μL。

  2.3 血、尿標本的提取和衍生化取血漿0.5mL或尿液0.2mL,加入內標溶液(100ng/μL)8μL,尿液樣品再加三蒸水稀釋5倍至總體積為1mL。混勻后各加1mol/L氫氧化鈉溶液0.1mL堿化樣品,振蕩10s,再加入乙酸乙酯3mL,異丙醇0.15mL,水平振蕩5min,2000r/min離心5min,取上層有機溶液40℃水浴氮氣流下揮干。殘渣加入濃氨水2μL及0.25%R(+)-PEIC氯仿液0.2mL,旋渦振蕩30s,4℃冰箱放置15min,室溫氮氣揮干有機溶液后,加入水0.5mL,氯仿2mL,用于提取、純化衍生化反應物,振搖30s后,1500r/min離心3min,40℃水浴氮氣流下揮干有機溶液,殘渣用60μL流動相溶解,待測。

  3、結果

  3.1 內標亦為對映體化合物,在相同的色譜衍生條件下發生不完全分離。AT對映體拆分完全,峰形對稱,與內標有很好的分離且無雜質干擾。

  3.2 線性關系

  3.2.1 血漿精取S(-)-AT和R(+)-AT標準儲備液配制成濃度為10、50、100、250、500、1000ng/mL的AT對映體的血漿樣品,余下按樣品提取和衍生化處理操作。以濃度(X)為橫坐標,以S(-)-AT、R(+)-AT與內標的峰面積之比(Y)為縱坐標,得血漿中S(-)-AT、R(+)-AT標準曲線的回歸方程分別為:

  Y=0.00140X+0.03914r=0.9915

  Y=0.00151X+0.04123r=0.9937

  3.2.2 尿液取S(-)-AT和R(+)-AT標準儲備液配制成濃度為25、50、750、1000、1500ng/mL的標準溶液,以下步驟同尿液樣品處理。以濃度(X)為橫坐標,以S(-)-AT、R(+)-AT與內標的峰面積之比(Y)為縱坐標,得尿液中S(-)-AT、R(+)-AT標準曲線回歸方程分別為:

  Y=0.00034X+0.03553r=0.9952

  Y=0.00036X+0.02630r=0.9963

  3.3 回收率用正常人空白血漿和尿液分別配制成濃度為10、200、1000ng/mL血漿和濃度分別為25、750、1500ng/mL的尿液標準樣品,依樣品提取與衍生化操作,得到血漿和尿液AT對映體的提取液,將提取處理后進行衍生化反應與未提取直接衍生化所得的色譜峰面積比較,計算絕對回收率。血漿標本:S(-)-AT回收率>85.7%;R(+)-AT回收率>86.3%。尿液標本:S(-)-AT回收率>84.8%;R(+)-AT回收率>85.5%。

  3.4 精密度試驗

  3.4.1 血漿標本1天內提取回收3種濃度(10、200、1000ng/mL)的S(-)-AT和R(+)-AT,在上述色譜條件下測定4次,計算日內誤差,RSD范圍:S(-)-AT為1.7%~4.3%;R(+)-AT為1.3%~3.8%。3種濃度分散于3個月內各測定5次,計算日間誤差,RSD范圍:S(-)-AT為2.8%~5.0%;R(+)-AT為2.9%~4.6%。

  3.4.2 尿液標本用3種不同濃度(25、750、1500ng/mL)的尿液樣品,每種濃度1天內連續進樣4次,得日內誤差,RSD范圍:S(-)-AT為0.6%~2.0%;R(+)-AT為0.8%~1.9%。3種濃度分散于3個月內各測定5次,得日間誤差,RSD范圍:S(-)-AT為1.0%~2.4%;R(+)-AT為1.0%~2.0%。

  4、方法的應用

  12名健康男性志愿者單次口服鹽酸阿替洛爾片2片(即AT為100mg)后,于服藥前和服藥后0.5、1、1.5、2、3、4、6、9、12、24h取外周靜脈血以及服藥后分段收集0~3、3~6、6~9、9~12、12~24h的尿液,采用本法分別測定血漿和尿液AT對映體的濃度C。結果顯示血漿R(+)-AT濃度較S(-)-AT顯著升高,S(-)-AT的AUC為(2.44±0.59)(μg/mL)*h,R(+)-AT為(2.64±0.61(μg/mL)*h(P<0.05),兩對映體的消除半衰期(T1/2)基本相近,S(-)-AT為(5.78±0.70)h,R(+)-AT為(6.03±0.71)h(P>0.05);而尿液S(-)-AT腎清除率(Cl)顯著大于R(+)-AT,S(-)-AT為(115.69±19.40)mL/min,R(+)-AT為(108.91±21.26)mL/min(P<0.05)。尿液計算的兩對映體的T1/2也基本相近,S(-)型為(6.35±2.98)h,R(-)型為(6.96±4.22)h(P>0.05),結果顯示,AT對映體人體藥代動力學過程存在立體選擇性差異。

  5、討論

  5.1 本研究通過改變流動相的組成和極性,發現在流動相中加入異丙醇能明顯縮短保留時間,加入少量二氯甲烷能消除拖尾,提高分離度。提取方法上考慮到乙酸乙酯提取回收率高但雜質峰較多,因此采用氯仿進行第二次抽提和純化。在此條件下,S(-)-AT和R(+)-AT衍生物分離良好且無雜質峰干擾,保留時間小于15min。

  5.2 R(+)-PEIC的含量影響衍生化反應。本實驗曾選用0.008%~0.5%不同濃度的R(+)-PEIC氯仿液進行衍生化,結果顯示R(+)-PEIC濃度太低時,樣品衍生化不完全,但隨著濃度增加,S(-)-AT和R(+)-AT衍生物相應增加,溶劑峰也隨之明顯增多,當R(+)-PEIC增加到一定濃度(0.5%)時,衍生化反應趨于飽和狀態,再增加R(+)-PEIC含量時,衍生物的生成并不增加。R(+)-PEIC活性較強,如溫度過高或暴露于空氣之中易于氧化,因此AT的衍生化反應在4℃冰箱放置15min,這樣不僅避免了R(+)-PEIC的氧化代謝,而且能得到單一、穩定、具有很強熒光的酰脲衍生物,此衍生物于室溫放置至少48h無變化。

  5.3 手性衍生化反應給內標的選擇帶來了一定的困難。我們選擇鹽酸甲氧胺作為內標,因為其為擬腎上腺素類藥,結構與AT相似,其與R(+)-PEIC衍生化反應后熒光光譜響應類似AT,因此同樣色譜條件下也分出2個洗脫峰(即對映體),取兩對映體峰面積之和作為內標計算值。

  5.4 采用柱前衍生化方法測定血漿和尿液中AT對映體需較純的提取物,以減少雜質峰的干擾。另外,堿化樣品能增加回收率,但堿性過高,雜峰也隨之增多。本法采用1mol/L氫氧化鈉溶液0.1mL堿化血漿和尿液,使pH高于ATpKa1~2單位,并于乙酸乙酯中加入少量異丙醇能顯著提高回收率。

  5.5 AT為水溶性藥物,吸收后幾乎全部以原形從尿液排出,故尿液中藥物濃度高。另外,考慮到衍生劑的量足以使衍生化反應完全,因此作尿液藥物分析時,樣品均先稀釋5~30倍,然后進行提取和衍生化反應。

  5.6 實驗精密度表明,本法測定結果穩定,具有良好的重現性,生成的酰脲衍生物單一、穩定,具有很強熒光。實際應用證明,本法能夠滿足血藥濃度監測和藥代動力學研究的需要。

日期:2010年7月15日 - 來自[色譜分析實例]欄目

液相色譜手性識別機理研究進展

    近20年來人們對于用高效液相色譜分離對映體的興趣與日俱增,發展高效的手性固定相(簡稱CSP)成為這一領域最活躍的部分,而與之相應的色譜手性識別機理的研究相對來說比較少。但研究色譜拆分機理又是非常重要的,這有利于獲得對手性識別更深入的理解,可以指導研制高效的CSPs及預示手性拆分的可能性,而且對理解手性藥物的藥理、藥物設計、生命化學中的立體化學問題等都具有重要意義[1]。
    物質對映異構體,僅在分子結構上具有不可重疊性。在對稱的環境里,無論是氣體、固體、或是溶液、液體狀態都表現出完全相同的物理化學性質。不管哪一種色譜,為了使互為對映體的物質轉化為化學和物理性質不同的非對映體,多宜提供一個手性源,使欲分離的對映體(樣品)和手性源(例如:手性固定相)之間形成一個非對映異構分子絡合物[2]。非對映分子復合體屬于不同的點群。僅對稱性的不同,在色譜上是不能被“識別”的,從熱力學過程的角度來說,二者必須有一定的自由能差別。

1 、手性分離的熱力學
    液相色譜手性固定相法直接拆分對映體,在色譜柱內存在著如下的平衡[3]:

   經典熱力學中自由能變化(DG)與焓(DH)、熵(DS)的關系遵從Gibbs方程:

    DG = DH - TDS 

在液相色譜中,保留參數即容量因子k’與溶質在流動相-固定相的熱力學平衡常數K的關系為:k’= fK(f是色譜柱相比)。對映異構體選擇性a = k’R / k’S (k’R > k’S)。色譜過程的自由能變化可以表示成:

    DG = -RTlnK = -RTln(k’/f) 

因此,不難導出:

    lnK = (-DH/R) × 1/T + DS/R (1)
    -DR,SDG0 = RT lna = -DR,S DH 0 + TDR,S DS0 
    lna = (-DR,SDH0/R) × 1/T + DR,SDS0/R (2)

式(1)、(2)表明lnK~1/T、lna~1/T呈線性關系

    在倒轉溫度Tinv時,非對映異構分子絡合物的熱力學平衡常數KR = KS,對映異構體同時流出,在該溫度時無對映異構體選擇性,aR,S = 1,理論上是由于:

    lna = (-DR,SDH/R) × 1/T + DR,SDS/R = 0 
    即: (-△R,S△H/R) × 1/Tinv = DR,SDS/R 
    -DR,SDH = TinvDR,SDS 

    在該點的兩邊,溫度對對映異構體選擇性系數的影響剛好相反,而且溶質對映體流出順序相反。該點的右邊,即:T<Tinv,色譜手性識別過程為焓變占優勢,隨著溫度的升高,a減小。該點的左邊,即:T>Tinv,色譜手性識別過程為熵變占優勢,隨著溫度的升高,a增大。在手性識別研究中,對映異構體流出順序在不同溫度下倒轉的現象迄今只有少量的報道。由于高效液相色譜的溫度變化范圍較窄,大多數情況下,Tinv不在該溫度范圍內,并且T<Tinv,色譜手性識別過程焓變占優勢,a值隨著溫度的升高而降低[6]。
    手性色譜的對映體分離是一個復雜的色譜過程,Pirkle[7]曾報道了lnK~1/T非線性的實驗結果。因此,在不同溫度下得到不同的對映體流出順序也可能是手性色譜保留和拆分機理的改變造成的。

    Pirkle[2]和Davankov等曾分別研究了手性色譜分離對映異構體選擇性a和非對映異構體絡合物自由能之差(DDG)之間的關系:DR,S DG = -RT lna,考慮到實際的色譜分離過程,非常小的熱力學選擇性DDG,如果DDG = 0.024 kJ/mol,就可以得到一定的拆分,a = 1.01。隨著DDG 的增加,對映體選擇性將表現為相應的指數級增長。Pirkle等用實驗印證了這種關系[8],在圖2所示的CSP上,用30% 異丙醇/正己烷為流動相,N-(3, 5-二硝基苯甲酰基)-亮氨酸正己酰胺的對映異構體選擇性測定值a = 10.5,其中(S)-對映體保留較長,相互作用能之差DDG = -5.93 kJ/mol。
    同樣,對具有兩個手性中心如圖3所示化合物的(SS), (RR)對映體,可以預料:由于手性中心相隔較遠,與CSP作用的自由能之差為2DD Gm ,實驗所得的手性選擇性a為121,大致為前者的平方值a2。后來,Pirkle等再次通過設計出相應的實驗提出了這樣的論斷[9]:具有兩個溶質-CSP相互作用部位產生的對映異構體選擇性大致為只有一個作用部位所取得的對映異構體選擇性值的平方。Boehm等[10]用統計熱力學理論研究了化學鍵合手性固定相上溶質對映異構體(AR、AS)的保留行為和分離模式:

    k’= exp(-bDA) 

其中b = 1/(kT),bDA為溶質由流動相到固定相傳質過程的Helmholtz自由能,因此:

    a = ∑iexp(-bEiR)/∑jexp(-bEjS) 

    其中EiR和EjS分別為R-體(AR)和S-體(AS)在CSP上第i種和第j種作用能。并認為CSP與A的4種一點作用、36種兩點作用、12種三點和四點作用中,只有三點和四點作用存在手性識別能力。如果只有一種優勢識別模型,則lna 與1/T呈線性關系。
    Berthod等[11]用熱力學方法研究手性識別中手性碳原子所連四個基團各自對手性識別的貢獻,分析了126個化合物中81種與手性碳相連的基團,并設氫取代時DG = 0,化合物上各基團獨立與CSP作用,在E = ∑|acal - aobs|最小化條件下解如下方程:

    D(DGA)=(DGA11-DGA12)+(DGA21-DGA22)+(DGA31-DGA32)+(DGA41-DGA42) 

    定量給出了各個基團對手性識別的貢獻(CSP為S-NEC-CD和R-NEC-CD),并發現SP2雜化的碳與手性中心相連比SP3雜化的碳手性識別能力強。該方法只能預示對映體能否被拆分,而不能預示流出順序。

2 、手性識別模型
    目前,關于手性識別的一般機理眾說紛紜。在手性色譜學這一領域,早在1952年,Dalgliesh[12]采用紙層析研究氨基酸對映體的分離時就提出了色譜直接拆分“三點作用”分離理論。后來,Lochmüler和Dobashi提出“兩點作用”模型;Lochmüler和Wainer提出“單點作用”機理,Lochmüler進一步提出某些系統存在“環境手性”而沒有專一的作用點。對映體的拆分過程可以是熵控制的,手性識別源于形狀選擇性的識別模型(圖4)。也就是說,在沒有結合點(如氫鍵、色散力、偶極作用、p-p相互作用等)的手性環境里,熵控制下,對映體在色譜過程中是可以被拆分的。事實上,由于熵變化值較小,從而導致a 值不夠顯著,因此,能夠通過增加作用點來提高手性選擇性值,識別模型如圖5所示,對映體的拆分源于分子形狀和相互作用力的共同貢獻。
    近些年來,Pirkle等[2]在深入研究手性固定相以及手性色譜立體識別機理的過程中,發展了Dalgliesh觀點,再一次闡述了“三點作用”分離理論:手性識別要求手性固定相和對映異構體之間至少有三個同時存在的作用力,這些作用力中至少有一個依賴于立體化學。也就是說,用其中的另一對映異構體(不作任何構象改變)來替代后,至少有一個作用力不復存在或明顯改變其性質。用如圖6所示的手性識別模型表達:在手性固定相上有三個作用點A、B、C,與之作用的對映異構體也同樣有三個作用點A’、B’、C’。對映體I與CSP形成A-A’、B-B’、C-C’三個作用力,對映體II則不存在C-C’作用力。如果C-C’作用力使形成的非對映分子絡合物穩定化,那么,色譜分離過程中對映體I比II滯后;反之,對映體I由于C-C’的排斥作用先流出色譜柱。如果C-C’作用力很小,則對映體I、II不能被色譜拆分。

    1992年,Taylor等[13]對“三點作用”原理評述認為:對映體與CSP的三個作用力中,至少有一個力具有立體選擇性即依賴于對映異構體和CSP的立體化學,而另外兩個作用力必須是兩種不同類型的作用力,如氫鍵、偶極作用、 p-p作用等,否則如果存在兩個相同的作用力,則可能產生不利的作用,使得CSP的手性識別能力降低或消失,例如當A-A’和B-B’作用力相同時,就可能使CSP失去手性分離能力(圖7)。
    事實上,手性色譜分離中有的對映體確實是靠氫鍵這一種類型的力在CSP上識別的[13,14],這種手性識別可以認為是對映異構體和手性固定相形成非對映異構絡合物的分子構象不同,使得其平衡常數K1、K2不同。另一方面,“三點作用”原理要求CSP分子和待分離對映異構體的手性中心附近都要有一定的剛性,柔韌性過強將會使手性識別能力喪失,如圖8所示。
    “三點作用”原理與Ogston [15]為解釋酶催化反應的立體專一性而提出的“三點鍵合”原理不同,二者的區別在于:“三點作用”原理沒有要求三點都是吸引力。在許多情況下,手性識別可以靠空間位阻的排斥力和兩個吸引力來實現(圖9),對映體II由于其大基團的空間位阻,使得其另外的氫鍵和p -p 作用明顯減弱。這種作用已被NMR分子間的核極化效應[16]和分子機理計算[3,17]所證實。表現在色譜過程中,對映體II的保留時間會低于對映體I。
    分子間作用力的單點性和多點性的特征由Pirkle等給出了明晰的描述[2]:兩個凸圓面相互接觸時,接觸處形成一個理想的點,于是將凸圓形電子軌道的相互作用描述成單點性的,如氫鍵、尾-尾偶極相互作用是單點性質作用力。通過線或面的基團的相互作用,如偶極堆積,p-p作用則為多點性質的。基于這些思想,可以將“三點作用”原理擴展:并不強調手性識別僅僅源于兩個手性四面體的角頂點的相互作用,也可以沿著AB和A’B’的偶極基團,通過多點性質的偶極堆積作用同樣達到兩個點作用的效果;芳環間的p-p作用亦是如此,手性識別模型如圖10所示。

    色譜手性識別是個復雜的過程,模型的提出是將復雜過程簡單明晰化。Pirkle在運用和發展“三點作用”原理時,強調形成非對映異構分子絡合物的CSP和對映體二者分子構象不發生改變,在模式上易于理解,但事實上并不完全如同所描述的那樣。色譜過程是時間的函數,分子不同的排列取向、不同的構象體、以及不同的相互作用(包括手性作用和非手性作用)都將影響到手性識別過程,大多數情況下考慮的是低能量的優勢構象的貢獻;再者手性識別也可能是多種機理的競爭。
    近年來,手性色譜學領域,機理的研究是一種趨勢[18]。人們試圖從理性的角度將手性色譜學導向深入。目前,用于手性識別機理研究的方法有三種[19]:
    (1) 色譜學研究,這是評估一種CSP特性的最通用的實驗方法,通過拆分現象推測色譜手性分離過程的最基本信息。
    (2) 光譜學研究,包括核磁共振、X射線衍射、熒光分析和紅外光譜等在CSP的性質和識別機理研究研究中的應用。這是最直接的研究手性識別機理的方法,然而在色譜手性分離系統中影響因素很多,此方法要求的條件非常嚴格。
    (3) 計算機輔助分子模型和理論計算方法,這是一種基于計算機技術的方法。借助于計算機輔助技術,運用分子模型和理論計算方法設計新的手性固定相、開發已有的手性固定相的應用和研究手性識別機理已經成為近年來色譜手性分離的新領域。

參考文獻
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日期:2010年6月8日 - 來自[色譜入門]欄目

高效液相色譜法拆分苯霜靈對映體

  【關鍵詞】  苯霜靈,對映體,殘留,高效液相色譜

  摘要  以高效液相色譜手性固定相法在對映體水平上建立了苯霜靈的分析方法。采用OD手性色譜柱,正己烷/異丙醇流動相,流速為1.0 mL/min,檢測波長206 nm,以圓二色檢測器對兩對映體進行出峰順序確證并考察了其圓二色特性。結果顯示,苯霜靈單一對映體在0.52~259.2 mg/L濃度范圍內具有較好的線性,線性相關系數均大于0.9994,最低檢出限為0.26 mg/L,在240 nm處的出峰順序為(+)/(-)。同時建立了苯霜靈對映體在土壤、水、葡萄中的殘留分析方法。土壤和葡萄樣品分別用丙酮和乙腈提取,水樣用固相萃取法(SPE)富集凈化。土壤中兩對映體在0.025~2.5 mg/kg范圍內的回收率為93.67%~108.95%之間;水樣品在0.005~0.5 mg/L濃度范圍的回收率在85.13%~100.79%之間,葡萄樣品在0.04~1 mg/kg濃度范圍的回收率在83.22%~106.62%之間;相對標準偏差RSD均小于6%。

  關鍵詞  苯霜靈,對映體,殘留,高效液相色譜

  1  引言

  N苯乙酰基N2,6二甲苯基DL丙氨酸甲酯(苯霜靈,benalaxyl)是內吸性殺菌劑,用于防治葡萄的單軸霉菌,馬鈴薯、草莓、番茄的晚疫菌,煙草、洋蔥、大豆的霜霉菌,黃瓜的假霜霉菌等。分子中含有一個手性碳原子,具有一對對映異構體。目前苯霜靈仍以外消旋體的形式生產和使用,未見有單一對映體的相關研究。

  苯霜靈的殘留分析方法在國內未見有報道,國外的相關研究也較少,Gambacorta等[1]曾用氣相色譜檢測了西紅柿中的苯霜靈殘留,樣品用丙酮和二氯甲烷提取;Patakioutas等[2]同樣用氣相色譜法分析了土豆田土壤和水中的苯霜靈,水樣用正己烷萃取,土壤樣品則以丙酮提取;Navarro等[3]也曾用氣相色譜檢測過苯霜靈在葡萄中的殘留。苯霜靈對映體在環境樣本中的殘留分析至今未見報道。

  本實驗使用高效液相色譜法實現了苯霜靈對映體的拆分,建立了分析方法,并對方法的有效性進行了驗證。另外對殘留于土壤、水、葡萄樣本中微量的苯霜靈進行了殘留分析,建立了提取、凈化、檢測方法。相關研究可為苯霜靈單一異構體的研究如殺菌活性、毒性毒理、代謝、環境殘留等奠定基礎。

  2  實驗部分

  2.1  儀器與試劑

  Agilent 1100高效液相色譜儀(美國Agilent 公司);DAD檢測器;HP Chemstation數據處理系統;JASCO 2000高效液相色譜儀(日本分光株式會社);UV2075紫外檢測器和CD2095圓二色檢測器,Chrompass工作站。

  C18固相萃取小柱(Supelco, 500 mg/3 mL),色譜柱250 mm×4.6 mm (i.d.),填充纖維素三(3,5二甲基苯基氨基甲酸酯)涂敷氨丙基硅膠手性固定相(OD),自制[4,5]。苯霜靈原藥,純度98%(農業部農藥檢定所);正己烷、異丙醇、丙酮、二氯甲烷、乙腈、甲醇、無水硫酸鈉、NaCl均為分析純(北京益利精細化學品公司)。正己烷和異丙醇流動相用前需重蒸,過0.45 μm濾膜。

  2.2  土壤、水、葡萄樣本的制備

  稱取陰干土壤25 g,置于250 mL錐形瓶中,加入10 mL去離子水。加入一定體積苯霜靈溶液(異丙醇溶劑),振蕩平衡1 h,加入50 mL丙酮,0.02 g活性碳,振蕩1 h,靜置,將上層溶液抽濾,剩余殘渣用20 mL×2丙酮再次提取,合并提取液,40℃旋轉蒸發,剩余溶液轉移至分液漏斗,加入5 mL飽和NaCl溶液,用30、20和15 mL二氯甲烷提取3次,合并提取液,旋轉蒸發近干,氮氣吹干后用異丙醇定容1 mL,待測定。

  自來水100 mL,加入一定體積苯霜靈溶液,搖勻,靜置1 h。

  C18固相萃取小柱先后用5 mL超純水、5 mL甲醇、5 mL超純水活化,水樣以約1 mL/min流速過柱,以10 mL超純水洗滌,真空抽干0.5 h。用5 mL無水甲醇洗脫,收集洗脫液,35℃氮氣吹干,異丙醇定容1 mL。

  稱取搗碎葡萄樣本25 g于250 mL錐形瓶中,加入苯霜靈溶液后振蕩平衡1 h,加入40 mL乙腈,振蕩1 h,抽濾上清液,殘渣用乙腈20 mL×2提取,合并提取液,40℃減壓濃縮,剩余液體轉移至250 mL分液漏斗中,加入5 mL飽和NaCl溶液,用30、20和15 mL二氯甲烷萃取,經無水硫酸鈉干燥,減壓濃縮近干,異丙醇定容1 mL,待測。

  2.3  色譜條件

  流動相:正己烷/異丙醇85/15,流速為1.0 mL/min;紫外檢測波長206 nm(最大吸收波長);溫度:室溫;進樣體積20 μL,本實驗涉及如下參數:容量因子(k′=(t-t0)/t0); 分離因子 (α= k′1/k′2) ,分離度(Rs=2(t2-t1)/(w1+w2)); t0為死時間;t為保留時間,k′1和k′2分別為先后洗脫對映體的容量因子,w為基線峰寬。

  3  結果與討論

  3.1  對映體的分離及出峰順序

  在正己烷/異丙醇體系內對苯霜靈對映體進行了拆分,考察了異丙醇含量對拆分的影響。苯霜靈兩對映體在OD手性柱上具有較好的選擇性,在所考察的異丙醇體積含量范圍(20%~2%)內都可以達到基線分離,表1列舉了相關數據。隨著異丙醇含量的減少分離度增加,但分析時間大大延長。綜合考慮到環境樣本中雜質的干擾、分析時間等因素,選擇正己烷/異丙醇=85/15為流動相。圖1為苯霜靈對映體的拆分色譜圖。

  圖1  苯霜靈對映體的拆分色譜圖(略)

  流動相(molbile phase): 正己烷/異丙醇(nhexane/isopropanol): 85/15; 1.0 mL/min; λ=206 nm。

  表1  苯霜靈對映體在正己烷/異丙醇體系內的手性拆分(略)

  使用JASCO高效液相色譜圓二色檢測器對出峰對映體進行了圓二色譜在線掃描,如圖2所示。縱坐標為圓二色響應和吸收強度,橫坐標為波長,兩對映體的圓二色吸收曲線以“0”刻度線對稱,“0”刻度線以下負值表示對映體為(-)CD信號,正值則表示(+)CD信號。圓二色譜圖顯示了連續波長下對映體的圓二色響應情況。在220~230 nm范圍內,先流出對映體為(-),后流出對映體則為(+)。而230~260 nm之間兩對映體的CD信號發生轉向, 最大圓二色吸收波長為240 nm,該處的出峰順序為+/-。本實驗中所提到的出峰順序(+/-)均為圓二色最大吸收波長240 nm下的CD信號。

  3.2  方法的有效性驗證

  3.2.1線性  配制一系列濃度苯霜靈標準溶液,重復進樣,考察方法的有效性。準確稱取苯霜靈樣品,用異丙醇溶解,配制成259.2、129.6、64.8、5.2和0.52 mg/L(單一對映體濃度)5個濃度的標準溶液,在正己烷∶異丙醇85∶15流動相條件下分別進樣20 μL,每個濃度平行3次(n=3),檢測波長206 nm,按照濃度峰面積繪制標準曲線。結果顯示,在單一對映體濃度為0.52~259.2 mg/L范圍內具有較好的線性關系,(+)對映體(先流出)的線性回歸方程分別為y=65.53x+119.44,相關系數R為1;(-)對映體(后流出)的線性回歸方程分別為y=61.57x+240.41,相關系數R為0.9994。圖3為兩對映體的線性回歸曲線。

  圖2  苯霜靈對映體的圓二色光譜圖(略)

  Fig.2  Circular dichroism (CD) spectra for the two enantiomers of benalaxyl

  實線為先流出對映體,虛線為后流出對映體(continuous line and imaginal line represent the first and second eluted enantiomers respectively)。

  圖3  苯霜靈兩對映體的線性回歸曲線(略)

  1. 對映體(+)(enantiomer (+)); 2. 對映體(-)(enantiomer (-))。

  3.2.2  靈敏度和精密度  苯霜靈的檢出限為0.26 mg/L,表2列出了兩對映體相關參數的精密度數據。如表2所示,保留時間、容量因子、分離因子都具有非常好的精密度(相對標準偏差RSD<0.7%),而峰面積和分離度的相對標準偏差在低濃度時相對偏大(RSD<4.0%),精密度數據顯示,實驗方法具有較好的穩定性。

  表2  分析方法的精密度(略)

  上標1和2分別表示先、后流出的對映體(the marks 1, 2 denote the 1st and 2nd elute of enantiomer, respectively)。

  3.3  環境樣本中苯霜靈的殘留分析

  土壤樣品回收率和精密度實驗設了0.025、0.25和2.50 mg/kg 3個濃度,重復3次,結果列于表3。由表3可以看出,3個濃度兩對映體的回收率在93.67%~108.95%之間;相對標準偏差RSD<6%。低濃度0.025的回收率偏高。以丙酮進行提取時,土壤中的色素也被提取出來,在提取過程中加入少量活性碳可有效吸附色素。

  表3  土壤中苯霜靈的添加回收實驗(略)

  對水樣品使用SPE法進行苯霜靈的富集凈化,共設0.005、0.05、0.125和0.5 mg/L 4個濃度。由表4可以看出,使用C18固相萃取填料可有效提取水中的苯霜靈,雜質干擾少,4個濃度的回收率均在8513%~100.79%之間;相對標準偏差RSD<5%。

  表4  水中苯霜靈的添加回收實驗(略)

  由于葡萄樣品中的干擾雜質較多,對多種提取溶劑進行了比較,最終選擇乙腈進行提取。乙腈可有效提取樣本中的苯霜靈,但提取的色素及其它雜質成分少,不需凈化。表5顯示,0.04、0.2和1 mg/kg 3個濃度的回收率在83.22%~106.62%之間;相對標準偏差RSD<6%。圖4為土壤、水、葡萄樣本中最小添加濃度的苯霜靈色譜圖。

  表5  葡萄中苯霜靈的添加回收實驗(略)

  圖4  苯霜靈在樣本中的殘留色譜圖(略)

  a. 土壤(soil): 0.025 mg/kg; b. 水(water): 0.005 mg/L; c. 葡萄(grape) 0.04 mg/kg。

  4  結論

  在對映體水平上建立了苯霜靈的常量及殘留分析方法,可有效檢測苯霜靈的光學純度及環境樣本中的殘留,方法相對簡單。所使用的殘留提取方法可得到較好的回收率,在提取水樣本時使用了SPE法,避免了大量有機溶劑的使用。乙腈提取葡萄樣本的雜質少,減少了檢測過程中的干擾。本實驗可為研究苯霜靈單一異構體的毒性毒理、代謝、殘留、降解等奠定基礎。

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  5  Wang Peng(王  鵬), Jiang Shuren(江樹人), Zhang Hongjun(張宏軍), Zhou Zhiqiang(周志強). Chinese J. Anal. Chem. (分析化學), 2004, 32(5): 625~627

  本文系國家自然科學基金資助項目(No.20377052)

  (中國農業大學應用化學系,北京 100094)

  (農業部農藥檢定所,北京 100026)

 

日期:2009年7月24日 - 來自[色譜分析實例]欄目

手性藥物活性研究進展

【摘要】   目的  闡明藥物手性的概念及其藥理活性。方法  綜述手性分子的研究歷史和藥物手性對藥理作用的影響。結果  手性藥物有著不同的藥理活性,對人體產生各種生理效應,對其進行合理的分離純化可以減小藥物毒副作用,增強藥效,同時能夠帶來巨大的經濟效益。結論  通過對手性藥物藥理活性的研究能更深入地理解或積極地預期一些藥物相互作用,為臨床合理用藥提供依據。

【關鍵詞】    手性藥物; 藥理活性

     近年來,藥物手性的臨床意義已引起了人們的注意,手性藥物的開發已成為國際熱點。目前,世界正在開發的1200種新藥中有3/3是手性藥物。手性藥物有的以消旋體(racemate)形式上市,有些以單一對映體(enantiomer)上市。手性藥物發展的潛勢是十分巨大的。手性藥物帶來了巨大的經濟效益,其市場范圍包括手性藥物制劑,手性原料藥和手性中間體。2000年全世界的手性藥物銷售額突破了1200億美元,其中制劑就有900億美元[1]。因此,研究手性藥物為臨床合理使用手性藥物及研制開發優對映體新藥,具有重要的意義。

    1  手性藥物相關問題簡述  

    分子結構基團在空間排列不同的化合物稱為立體異構體,其中在空間上不能重疊,互為鏡像關系的立體異構體稱為對映體,這一對化合物就像人的左右手一樣,稱為具有手性;當藥物分子中碳原子上連接有4個不同的基團時,該碳原子被稱為手性中心(也稱不對稱中心),相應的藥物被稱作手性藥物(chiral drug)。對映體之間,除了使偏振光偏轉(旋光性)的程度相同而方向相反外,其他理化性質相同。因此,對映體又稱光學異構體[2]。

    分子手性在自然界生命活動中起著極為重要的作用,即手性是生命過程的基本特征。作為生命活動重要基礎的大分子如核酸、蛋白質、多糖等均具有手性。因此說,人類的生命本身就依賴于手性識別。如人們對 L - 氨基酸和D - 糖類能夠消化吸收,而其對映體對人類沒有營養價值,或有副作用。

    手性的研究可以追溯到 1874 年第一位化學諾貝爾獎獲得者 JHVan’t Hoff。當時他就提出了具有革命性的理論化學分子為三維結構,一些化合物存在兩種構像-兩者互為鏡像[3]。1956年Pfeiffer根據對映體之間藥理活性的差異,總結出一條規則:一個藥物的有效劑量越低,光學異構體之間藥理活性的差異就越大。即在光學構體中,活性高的異構體(eutomer)與活性低的異構體(distomer)之間活性比例(eudismicratio)越大,作用于某一受體或酶的專一性越高,作為一個藥物它的有效劑量就越低。20世紀 50 年代中期,反應停 (沙利度胺,Thalidomide)作為鎮靜劑,有減輕孕婦清晨嘔吐的作用而被廣泛應用,結果在歐洲導致1.2萬例胎兒致殘,即海豹肢,于是1961年該藥從市場上撤消。后來發現沙利度胺 R 型具有鎮靜作用,而S型卻是致畸的罪魁禍首。研究人員進一步研究發現沙利度胺任一異構體在體內都能轉變為相應對映體,所以無論是S型還是R型,作為藥物都有致畸作用。因此對不同對映體藥理活性的研究已經顯得刻不容緩。

    2  手性藥物的活性

    手性藥物進人體內后,其藥理作用是通過與體內靶分子之間的嚴格手性匹配和分子識別能力而實現的[4]。即通過與體內酶、核酸等大分子中固有的結合位產生誘導契合,抑制 (或激活)該大分子的生理活性,從而達到治療目的。目前,手性藥物的活性大致有以下幾個類別。

    2.1  對映體之間有相同或相近的某一活性  如普萘洛爾左旋體和右旋體具有殺滅精子的作用,其對映體均可作為避孕藥[5]。抗凝血藥華法林 (warfarin) 以外消旋體供藥,研究發現其S-( - )異構體的抗凝血作用比R-( + )體強 2 ~ 6倍,但 S- ( - )異構體在體內消除率亦比R-( + )體大 2 ~ 5倍,所以,實際抗凝血效力相似[6]。屬于這類藥物已見報道的有抗組織按藥異丙嗪(promethazine),降眼壓藥噻嗎洛爾(timolol),局麻藥丙胺卡因 (priocaine)、英卡胺 (encainide),抗腫藥呋氟啶 (ftorafur),平喘藥丙羥茶堿 (proxyphylline),抗心律失常藥氟卡尼 (flecainide)等。

    2.2  一個對映體具有顯著的活性但其對映體活性很低或無此活性  一般認為若某一對映體只有外消旋的1%的藥理活性,則可以認為其無活性。因為這微小的活性可能來源于摻雜于該單一對映體中微量的活性單一對映體。例如氯苯吡胺(撲爾敏,chlorpheniramine) 右旋體的抗組胺作用比左旋體強 100 倍。吡酮酸等抗菌藥氧氟沙星(氟嗪酸 Ofloxacin)[7]的S-( - )-異構體是抗菌活性體,而R-( + )-異構體則無活性。屬于這一類的主要藥物是非甾體抗炎藥(NSAID)的α-芳基丙酸類化合物,如萘普生[8](naproxen)、布洛芬 (ibuprofen)等。

    2.3  對映體有相同、但強弱程度有差異的某一活性  抗癌藥環磷酰胺 (cy - clophosphamide),其手性中心不是在通常的碳原子,而在磷原子。其(S)-異構體活性是(R)-異構體的 2倍,然而,對映體毒性幾乎相同。有時一個異構體具有較強的副作用,也應予考慮。如氯胺酮(ketamine)是以消旋體上市的麻醉鎮痛劑,但具有致幻等副作用,進一步的藥理研究證實(S)-異構體活性是(R)-異構體的1/3,卻伴隨著較強的副作用。

    2.4  對映體具有不同性質的藥理活性,可以分幾種情況來討論。

    2.4.1  對映體的不同活性,可起到“取長補短、相輔相成”的作用。一個突出的例子是利尿藥茚達立酮(indacrinone)[9]。其(R)-異構體具有利尿作用,但有增加血中尿酸的副作用;而(S)-異構體有促進尿酸排泄的作用。進一步的研究表明對映體達到一定比例能取得最佳療效。又如,多巴酚丁胺,其左旋體為α受體激動劑,對β受體激動作用較輕微;而右旋體為β受體激動劑,對α受體激動作用較輕微。因此消旋體給藥能增加心肌收縮力,但不加快心率和升高血壓。

    2.4.2  對映體存在不同性質的活性,可開發成2個藥物。丙氧芬(propoxyphene)[10]的右旋體 (2S、3R) 為鎮痛藥,但左旋體(2R、3S) 具有鎮咳作用,現在兩者已分別作為鎮痛藥和鎮咳藥應用于臨床。柳胺芐心定(labetalol)是一種心血管藥,具有α1阻滯活性的β阻滯劑,產生β阻滯作用的主要RR體,而α1阻滯活性則歸因于SR體,用于治療高血壓的是RR體。

    2.4.3  一個對映體具有療效,而其對映體產生副作用或毒性。青霉胺 (Penicillamine) 的 D -型體是代謝性疾病和鉛、汞等重金屬中毒的良好治療劑,但它的 L -型體會導致骨髓損傷,嗅覺和視覺衰退以及過敏反應等。臨床上只能用 D -青霉胺。L-多巴有抗震顫麻痹癥作用,而D-多巴有使粒細胞減少等副作用[11]。四咪唑的(S)-(-)-異構體具有廣譜、高效的驅蟲性,而(R)-(+)-異構體不但藥效較低,而且會引起嘔吐等副作用。過敏反應等:芬氟拉明(fenfluramine)是食欲抑制藥,作為減肥藥物,它的藥理活性主要由R-(+)異構體產生,而S-(-)異構體無活性,且會導致頭暈、嗜睡的不良反應。

    2.4.4  對映體具有相反的活性。巴比妥類藥物的對映體對中樞神經系統發生相反的作用,如 1-甲基-5-苯基-5-丙基巴比土酸,其 (R)-異構體有鎮靜、催眠活性,而(S)-異構體引起驚厥[12]。R-扎考必利對5-HT3具有拮抗作用,而S-構體對其產生激動作用[13]。

    3  手性藥物的不良反應及影響

        手性藥物對映體與人體內的酶、受體、離子通道等生物大分子作用,表現出錯綜復雜的對映體選擇性,它們的藥代動力學、藥效學特征將對臨床應用手性藥物帶來極大的挑戰,往往會產生意想不到的毒性反應和不良作用。由于人體內的細胞色素P450酶譜系的遺傳多樣性,表現出對手性藥物代謝特征的不同造成毒副作用的原因是比較復雜的,此外肝、腎功能有缺陷會促使手性藥物的肝代謝和腎排泄過程發生改變,以及手性藥物不同對映體間的相互作用等等是引起不良反應的因素。例如,非洛地平(felodipine)是一手性藥物,由于左旋體和右旋體藥代動力學的不同,其不良反應也不同,具體表現為頭痛和面部潮紅,右旋體與左旋體和消旋體比較,不良反應的發生率更高[14]。

    4  結論

    目前以單一對映體上市的藥物為數不多,尤其是合成藥物,但隨著人民對健康要求的不斷提高,獲得療效好,毒副作用低的單一對映體是藥學工作者必須重視的問題。深入研究手性藥物臨床合理應用并開展對映體特異性的治療藥物監測對提高合理用藥水平,避免毒副作用和不良反應具有深遠意義。

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12  蔣兆艱,吳笑春.手性藥物的對映體選擇性與臨床應用. 中國藥房,2001, 12(3):162.

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14  Aberg J,Edgar B,Grind M,et al.Vsodilating properties and pharmnacokinetic of S-and R-elodipine in man. Clin Pharmacol Ther,1995,57(2):67.


作者單位:137400 內蒙古烏蘭浩特,烏蘭浩特市人民醫院藥劑科

日期:2008年12月27日 - 來自[2008年第8卷第9期]欄目

手性分離色譜

    是采用色譜技術(TLC、GC和HPLC)分離測定光學異構體藥物的有效方法。由于許多藥物的對映體(Enantiomer)之間在藥理、毒理乃至臨床性質方面存在著較大差異,有必要對某些手性藥物進行對映體的純度檢查。
(一)原理和方法:對映體化合物之間除了對偏振光的偏轉方向恰好相反外,其理化性質是完全相同的,因而難以分離。傳統方法(分步結晶法、酶消化法等)有很大局限性,特別是難以進行微量分離和測定。60年代前后,TLC、GC法逐漸用于對映體化合物的拆分。但這兩種方法只能拆分不多的化合物,且需要較復雜的樣品處理步驟,制備分離也難以進行。80年代初HPLC法迅速成為藥物對映體分離和測定最為廣泛應用的方法。
     HPLC用于手性分離概括起來可分為兩大途徑:間接(CDR)和直接(CMPA、CSP)方法。
     間接方法主要基于外消旋體混合物經柱前衍生化形成一對非對映異構體(Diastereoisomers)。此法又稱為非對映體拆分法或柱前手性衍生化法。由于d-型和l-型對映體的物理性質完全相同,只能在手性固定相上才能獲得拆分;如果利用對映體分子中的反應基團與某一光學純試劑反應形成了非對映光學異構體混合物,其物理性質就有較大的差異,因而可在普通固定相(非手性固定相)上實現分離。本法需高光學純度的手性衍生化試劑(Chiral Derivatization Reagent,CDR),衍生化反應往往比較繁瑣費時;各對映體衍生化反應的速率有時也不相同。由于可采用價格便宜、柱效較高的非手性柱和通過適當的衍生化反應可提高檢測的靈敏度,以及衍生化過程中可伴隨樣品的純化等優點,柱前手性衍生化的方法仍然是當前手性藥物拆分、尤其是生物樣品中藥物對映體分離和測定的常用方法。   
     直接方法主要采用手性流動相添加劑(Chiral Mobile Phase Additives,CMPA)法和手性固定相(CSP)法。CMPA法又可稱為手性流動相(CMP)拆分法或手性洗脫法。它不必事先將樣品制備成衍生物,而只須將手性劑加入流動相中。手性添加劑與樣品所形成的各種手性絡合物雖然不及CDR法所形成的衍生物那樣牢固,但它所依據的手性識別作用和絡合物的非對映異構體性質卻基本相同。常用的CMPA有:環糊精(Cyclodextrins)類(主要是α-、β-和γ-環糊精及其衍生物);手性離子對配合劑(Chiral Ion Pair Complex,CIPC),如(+)-10-樟腦磺酸、奎寧和奎尼丁等;以及配位體交換型手性流動相添加劑(Chiral Ligand-exchange Complexes,CLEC),其中手性配位體多為光活性氨基酸或其衍生物,再與二價金屬離子形成螯合的配位化合物,以適當的濃度分布于流動相中,遇有藥物消旋體時即可形成相應的非對映體配位化合物對,然后在正相柱或反相柱上完成拆分。近年來CSP法發展迅猛,應用日益廣泛。它是不經轉變成非對映體而直接拆分的方法,優點是:適用于不含活潑反應基團的化合物;除非必須衍生化,否則無需高光學純度試劑;樣品處理步驟簡單。但迄今為止,CSP柱商品已有40多種,價格大多昂貴,尚未有一種具有類似ODS柱的普遍適用性。根據分子結構選擇合適的CSP柱是非常重要的。常用的CSP有:手性電荷遷移配位體固定相,如 Pirkle型HPLC-CSP;蛋白親和配體固定相,如 Enantiopac(LKB);內部配位化合固定相,如環糊精(Cydobond)和纖維素酯(Chiracel)等;以及配基交換固定相,如L-脯氨酸-Cu2+共價鍵合于聚苯乙烯等基質上。
     CSP拆分對映體的理論概念:在HPLC的CSP柱上拆分對映體是利用藥物對映體和特制的、在硅膠上鍵合的對映體固定相(CSP)之間所形成的非對映體復合物。由于非對映體復合物穩定性差異,可使兩個對映體的保留時間不一致,與CSP形成穩定性較差的非對映體的藥物對映體可先洗脫,因之實現了拆分。CSP設計是基于Dalgliesh在1952年提出的“三點手性識別模式”(Three-point chiral recognition model),認為要實現手性識別,在手性化合物分子與CSP之間至少同時要有三個相互作用部位,其中之一必受空間影響,或是相互吸引或是相互排斥。生成的非對映體的相對強度,決定了兩個對映體的分離度和洗脫次序。
(二)三類手性分離方法的比較:CDR法的優點是應用條件相對簡易,只需采用普通HPLC的固定相和流動相即可而且通過衍生化有利于增加檢測(紫外或熒光)靈敏度;缺點是樣品中相關化合物須預先分離、衍生化手性試劑的光學純度的高要求以及異體對的衍生化反應速率不一。
     CMPA法的優點是不必作柱前手性衍生化;對固定相也無特殊要求;樣品的非對映異構化絡合具有可逆性而且利于制備。主要缺點是可拆分的化合物范圍有限;某些添加劑不夠穩定而且往往會干擾檢測。
CSP法的優點較多,能廣泛適用于各類化合物,適于常規及生物樣品的分析測定,制備分離方便,定量分析的可靠性較高,采用此法研究考察的化合物已達數千種之多。缺點是樣品有時也須作柱前衍生(但不一定是手性衍生化試劑),對樣品結構有一定限制,其適用性尚不及普通HPLC固定相(包括正相和反相)那樣廣泛。

日期:2008年6月3日 - 來自[色譜入門]欄目

高效毛細管電泳法分析D苯丙氨酸與DN乙酰苯丙氨酸的對映體雜質含量

【摘要】  目的:建立高效毛細管電泳法 (HPCE) 測定不對稱合成D苯丙氨酸和DN乙酰苯丙氨酸對映體雜質含量的新方法. 方法:采用HPCE法對苯丙氨酸和N乙酰苯丙氨酸對映體的分離條件進行優化,并將該HPCE方法用于樣品測定. 結果:在40 mmol/L TrisH3PO4 (pH=2.5),60 g/L SβCD,-15 kV分離電壓,20℃柱溫的優化條件下,苯丙氨酸和N乙酰苯丙氨酸對映體得到基線分離. 在藥物濃度為0.01~0.20 g/L的考察范圍內,濃度和峰面積呈良好線性,L苯丙氨酸和LN乙酰苯丙氨酸的回歸方程分別為:Y=1065.42X+31.02(R2=0.9989)和Y=996.02X+34.44(R2=0.9984),其中,Y為校正峰面積A/t,X為濃度(g/L). 結論:該HPCE方法簡單、準確,可用于苯丙氨酸和N乙酰苯丙氨酸對映體的手性拆分和對映體雜質含量的測定.

【關鍵詞】  高效毛細管電泳;苯丙氨酸;N乙酰苯丙氨酸;手性分離;對映體雜質

  0引言

  近年來,D苯丙氨酸(Dphenylalanin)作為藥物或藥物中間體已得到了廣泛的應用[1]. 進一步建立D苯丙氨酸及其重要手性中間體DN乙酰苯丙氨酸對映體雜質含量的測定方法對D苯丙氨酸生產質量控制具有重要的意義[2-3]. 我們利用高效毛細管電泳(HPCE)手性拆分具有簡單、高效、低消耗和符合綠色化學要求的基本特性[4-5],采用自制磺化β環糊精為手性選擇劑分別建立同時適合于苯丙氨酸和N乙酰苯丙氨酸對映體的最佳分離條件,并測定這兩類物質的一系列不同比旋光度樣品的對映體雜質含量,以期發展一種簡便分離該對映體及其對映體雜質含量測定的毛細管電泳新方法.

  1材料和方法

  1.1材料

  P/ACETM MDQ型毛細管電泳儀系統(Beckman,USA),配有二極管陣列檢測器,Beckman System Gold軟件;320S pH計(Mettler Toledo Co.);旋光儀(PerkinElmer 343, USA).   

  自制磺化β環糊精(sulfatedβcyclodextrin,SβCD)由陜西師范大學化學系李保林教授惠贈;其它試劑均為分析純. 對照品:光學純的D苯丙氨酸、外消旋苯丙氨酸(上海化學試劑二廠);光學純的DN乙酰苯丙氨酸、外消旋N乙酰苯丙氨酸由本實驗室合成(>99.8%  HPLC).

  1.2方法

  1.2.1對照品和樣品溶液的制備

  L苯丙氨酸對照品溶液:精密配制1 g/L的D苯丙氨酸對照品溶液. 精密配置0.8 g/L的外消旋苯丙氨酸溶液(含L苯丙氨酸0.4 g/L). 從中分別準確吸取0.125, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 5.0, 6.0 mL置于10 mL容量瓶中,分別加入上述2.0 mL D苯丙氨酸對照品溶液,用水定容,則得在大量D苯丙氨酸存在下的含L苯丙氨酸0.005~0.24 g/L的一系列對照品溶液;L苯丙氨酸樣品溶液:精密稱取不同光學純度的D苯丙氨酸、DN乙酰苯丙氨酸分別配置成10.0 g/L的樣品母液,測定時根據標準曲線線性范圍適當稀釋. LN乙酰苯丙氨酸溶液的配制同L苯丙氨酸.

  1.2.2電泳條件和實驗方法

  未涂層石英毛細管柱(48.7 cm×75 μm, id,有效長度38.5 cm,Beckman公司). TrisH3PO4緩沖溶液中加入適量的SβCD作為背景電解質; 工作電壓-5~-25  kV, 柱溫15℃~20℃;0.5 psi壓力進樣5 s;二極管陣列檢測;所用溶液均經0.45 μm纖維素酯膜過濾.

  統計學處理:采用線性回歸模型對濃度與峰面積進行線性關系分析.

  2結果

  2.1手性選擇劑濃度的選擇

  考察在30~80 g/L濃度范圍的SβCD對苯丙氨酸和N乙酰苯丙氨酸對映體分離的影響,結果60 g/L為SβCD的理想濃度(圖1).

  2.2背景緩沖液濃度與pH值對分離效果的影響

  40 mmol/L Tris濃度為同時適合于苯丙氨酸和N乙酰苯丙氨酸兩對對映體的理想分離條件(圖2). 通過對pH 1.5~4.0范圍內苯丙氨酸和N乙酰苯丙氨酸對映體分離度的考察表明,苯丙氨酸對映體在pH 2.0~3.0的范圍內都有良好分離,而只有在pH 2.5時才可使N乙酰苯丙氨酸對映體達到基線分離,所以選擇pH 2.5為分離酸度.

  2.3毛細管溫度對分離的影響

  在15℃~30℃的范圍內, 溫度升高一方面使遷移時間縮短, 但同時也降低了對映體的分離度. 綜合考慮分離度與分析時間, 本實驗選用20℃作為分離溫度, 在此溫度下, 兩對映體均可得到較好的分離結果與相對短的遷移時間.

2.4樣品對映體雜質含量的測定

  ①線性關系考察: 在0.01~0.20 g/L的濃度范圍內, 按優化的電泳條件分別對L苯丙氨酸或LN乙酰苯丙氨酸進行線性關系分析, L苯丙氨酸的回歸方程為: Y=1065.42X+31.02 (R2=0.9989); LN乙酰苯丙氨酸的回歸方程為: Y=996.02X+34.44 (R2=0.9984), 其中, Y為校正峰面積(A/t), X為濃度(g/L). ②回收率與最低檢測限考察:  精密量取L苯丙氨酸或LN乙酰苯丙氨酸0.05, 0.10, 0.15 g/L的對照品溶液各4.0 mL(n=5), 按上述電泳條件分析并計算回收率(%). 結果L苯丙氨酸的回收率在99.1%~102.5% (n=5); LN乙酰苯丙氨酸的回收率在98.1%~102.9%. 同時, 按上述電泳條件電泳, 以信噪比S/N=3測定L苯丙氨酸和LN乙酰苯丙氨酸的最低檢測限(LOD), 得到L苯丙氨酸的LOD為2.5 μg/mL, LN乙酰苯丙氨酸的LOD為3.0 μg/mL. ③樣品測定: 對一系列具有不同比旋光度的D苯丙氨酸與DN乙酰苯丙氨酸合成樣品進行了對映體雜質含量的測定, 結果雜質L苯丙氨酸的含量在0.25%~9.3%之間, 雜質LN乙酰苯丙氨酸的含量在0.20%~8.2%之間(圖3).

  3討論

  隨SβCD手性選擇劑濃度的提高,苯丙氨酸和N乙酰苯丙氨酸對映體的分離度Rs均增大,當手性選擇劑濃度提高到60 g/L時,苯丙氨酸和N乙酰苯丙氨酸兩對對映體的Rs值達到最大. 而進一步提高手性選擇劑的濃度反而導致了分離度的下降,這和Williams等[6]提出的分離模型相一致,即存在一個最佳手性選擇劑濃度,濃度過高或過低,都會導致分離度的下降. 同時,當SβCD濃度超過70 g/L時,電流不穩,基線漂移,這可能是由于SβCD帶負電,濃度較大時,受電場力較大,電泳電流增大過多而導致焦耳熱較大所致. 而在60 g/L時,N乙酰苯丙氨酸和苯丙氨酸對映體的分離度分別達到1.74和3.22,所以選擇60 g/L為SβCD的理想濃度.

  緩沖溶液的濃度影響溶液的粘度系數、溶質的擴散系數等,最終影響分析物的分辨率和遷移時間. 由圖2可見,苯丙氨酸對映體在30~45 mmol/L的Tris濃度范圍內均得到良好的分離(Rs>2),但只有在40 mmol/L才可使N乙酰苯丙氨酸達到基線分離(Rs=1.72). 同時,隨Tris濃度的增加,兩對對映體的遷移時間也均增加,所以本實驗選擇40 mmol/L Tris濃度為同時適合于苯丙氨酸和N乙酰苯丙氨酸兩對對映體的理想分離條件.

  本文建立了同時適合于苯丙氨酸和N乙酰苯丙氨酸對映體的HPCE分離條件,并用于該產品的對映體雜質含量的分析,對于這兩類手性藥物或藥物中間體合成中光學純度控制具有重要意義.
  

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日期:2008年5月14日 - 來自[色譜論文]欄目

中性環糊精毛細管電泳法手性拆分氧氟沙星對映體的對比

【摘要】 目的:比較在毛細管電泳中不同中性環糊精(CD)及其衍生物對氧氟沙星對映體的手性拆分能力,并提出可能的手性識別機制. 方法:分別以αCD,βCD,γCD,HPβCD和DMβCD為手性選擇劑,采用毛細管電泳法研究CD種類及其濃度、分離電壓、溫度對氧氟沙星對映體分離的影響. 結果:在50 mmol/L磷酸緩沖液(pH 3.0),15 kV分離電壓、柱溫25℃的基本優化條件下,分別以25 mmol/L DMβCD或50 mmol/L HPβCD+25 mmol/L γCD為手性選擇劑,氧氟沙星對映體得到基線分離,分離度(Rs)分別達2.0和1.7. 結論:CD空腔大小和空腔邊緣作用對于手性識別有重要選擇性,該毛細管電泳法操作簡單方便,手性分離效果良好,可用于氧氟沙星對映體藥物的分離.

  【關鍵詞】 電泳,毛細管;氧氟沙星;對映體;手性分離

  0引言

  迅速發展的毛細管電泳技術[1-2]以其高效、快速、環境友好和運行成本低等優點成為手性藥物分離中最重要的技術. 目前,已有毛細管電泳分離氧氟沙星對映體的研究報道[3-6],所用的手性選擇劑包括抗生素、牛血清白蛋白、環糊精(cyclodextrin, CD)及其衍生物等,其研究主要集中于建立簡單的分離條件,并用于氧氟沙星對映體的定性定量分析. 雖然氧氟沙星對映體的毛細管電泳分離已取得了一定的研究成果,但尚缺乏對手性分離條件的系統研究和手性識別機制的深入探索. 為此,我們以中性CD及其衍生物為手性選擇劑,系統對比了5種不同的中性CD對氧氟沙星對映體的拆分能力,并較深入地討論了各手性選擇劑的可能識別機制.

  1材料和方法

  1.1材料

  αCD,βCD,γCD,羥丙基β CD(HPβCD),二甲基βCD(DMβCD)為美國Beckman公司產品;外消旋氧氟沙星樣品為東盛集團湖北潛江制藥股份有限公司產品;NaH2PO4,H3PO4(AR)購自西安化學試劑廠;其它試劑均為分析純. P/ACETM MDQ型毛細管電泳儀系統(Beckman,USA),配有二極管陣列檢測器和Beckman System Gold軟件;熔融空心石英毛細管柱(50.0 μm×60.2 cm,有效長度50 cm,Beckman);320S pH計(METTLER TOLEDO公司).

  1.2方法

  毛細管柱溫度25℃,工作電壓15 kV,0.5psi氣壓進樣5 s,二極管陣列檢測. 背景電解質溶液為50 mmol/L,氧氟沙星樣品濃度為50 mg/L. 樣品溶液和緩沖液皆4℃儲存,用前0.45 μm微孔濾膜濾過,且超聲脫氣處理. 每次運行前依次用0.1 mol/L NaOH溶液、MILLIQ去離子水、電泳緩沖液沖洗柱子2 min.

  2結果

  2.1中性CD手性選擇劑分離對比分別采用αCD,βCD,γCD,HPβCD和DMβCD對氧氟沙星對映體進行了拆分研究,其分離度有些差異(表1).表1中性環糊精對氧氟沙星對映體的分離(略)

  2.2電解質濃度、電壓及柱溫對分離的影響緩沖溶液濃度、分離電壓對分離的選擇性和效率均有較大影響,過高的電壓及過高的緩沖液濃度均可能導致焦耳熱增加而影響分離[7]. 以DMβCD為手性選擇劑,在室溫25℃并維持緩沖溶液pH 3.0(磷酸調節)的基本條件下,考察了不同緩沖液NaH2PO4濃度和操作電壓對分離的影響,結果緩沖液NaH2PO4濃度為50 mmol/L,分離電壓為15 kV時可使氧氟沙星對映體遷移時間、峰形理想,分離良好. 此外,本實驗在15 kV電場強度下,溫度在15~30℃范圍內的改變對分離度無顯著影響. 所以選擇室溫25℃為毛細管分離柱溫.

   2.3緩沖液pH對分離的影響緩沖溶液pH值(9.3,6.0,4.3,3.0,2.0)對分離的影響見圖1,2. 在pH 9.3的堿性條件下,氧氟沙星對映體出峰時間過快(8 min),未能分離而呈現一單峰;隨pH降低遷移時間延長,降低到pH 3.0時,HPβCD拆分氧氟沙星對映體的分離度(resolution, Rs)達最大,DMβCD拆分氧氟沙星對映體可達到2.0的理想Rs;而pH進一步降低時,電滲流減小,分析時間延長,且Rs呈下降趨勢,所以選擇pH3.0為分離酸度.

  2.4手性選擇劑濃度對分離的影響Wren等[8]認為在手性分離中總存在一個最佳的手性選擇劑濃度,結合常數愈大,最佳濃度愈低,反之亦然. 本實驗考察DMβCD(其水溶性低)在10~50 mmol/L濃度范圍內,CD濃度對氧氟沙星對映體分離的影響見圖3.

  根據色譜基本理論[9],當Rs大于1.5時,可以認為兩個化合物達到基線分離. 以HPβCD為手性選擇劑,在其和緩沖液濃度皆為50 mmol/L及25℃,15 kV的優化條件下,氧氟沙星對映體接近基線分離,Rs為1.3;進一步在HPβCD體系中加入25 mmol/L的γCD優化分離條件,結果Rs有一定提高,達到1.7(圖4)(略).

  3討論

  氧氟沙星對映體的毛細管電泳手性分離已有不少報道,但關于其手性識別機制的探討較少,本實驗結果證實,在50 mmol/L NaH2PO4緩沖液(pH 3.0)、柱溫25℃和分離電壓15 kV的優化條件下,αCD,βCD和γCD對氧氟沙星對映體沒有拆分能力;單獨使用HPβCD手性選擇劑,氧氟沙星對映體不能達到基線分離,但在HPβCD體系中加入適量γCD卻可使氧氟沙星對映體基線分離;而只有DMβCD表現出理想的拆分效果,這表明CD空腔尺寸、邊緣的特殊相互作用對氧氟沙星對映體的手性識別有密切關系.

  αCD沒有拆分能力可能是因為空腔環太小,不能與待測物形成有效的包合物;而γCD雖然可與氧氟沙星形成有效的包合物,但空腔環太大,將氧氟沙星分子包合的太多,對左右旋體的作用力沒有區別,因此也不具有拆分能力;βCD與HPβCD和DMβCD對氧氟沙星對映體拆分能力的差異可以用βCD及其衍生物結構上的差異而導致與客體分子相互作用的不同來解釋. 從結構上看,βCD及其衍生物都是由7個吡喃葡萄糖單元以α1,4鍵合的環狀產物,但HPβCD是βCD分子大口端C2上的仲羥基被羥丙基取代的產物,而DMβCD是βCD分子大口端C2上的一個仲羥基和小口端C6上的一個伯羥基被甲基取代的產物. 氧氟沙星是由含苯環的三環與另一個六元環通過CN鍵相連的物質,所以當其與βCD相互作用時,分子中較小六元環可能深入βCD空腔,形成疏水包合;而苯環及分子中的F,O等原子可與βCD內腔及邊緣上仲羥基形成靜電、氫鍵和范德華作用,但因C2和C3位的仲羥基太短和空間位阻使它們不足以與手性中心相連的原子相互作用,使得左右旋體與βCD的相互作用差異很小,無法實現分離. 而HPβCD和DMβCD相當于加大了βCD分子的口徑和深度,且衍生化后的CD柔性增加,使主客體分子之間的相互作用點增加,作用力增強,更易與手性中心相連的原子發生相互作用,因此HPβCD和DMβCD比βCD有更好的分離效果. 而HPβCD環上羥丙基比DMβCD環上的甲基鏈更長,CD環大口端更大,對氧氟沙星手性中心相連的原子的氫鍵作用可能更強,所以用HPβCD為手性選擇劑時出峰時間比用DMβCD長;但這種強的氫鍵作用因CD環將氧氟沙星包合的更多,對左右旋體的識別效果不及甲基,所以HPβCD對氧氟沙星的拆分能力不及DMβCD.

  我們的研究表明,在HPβCD體系中加入γCD后對映體的遷移時間較單獨使用HPβCD明顯延長,但這種混合體系的手性選擇性大大高于單獨的HPβCD體系. γCD與氧氟沙星存在作用,減小了對映體的遷移速率,增加了對映體與HPβCD的作用時間和手性識別效果. 有關HPβCD與γCD最合適的濃度之比,有待進一步研究. 關于磺化CD等帶電CD拆分氧氟沙星對映體及其手性識別的機制我們正在進行研究.

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