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我國H7N9 HA和NA蛋白研發成功

2013年3月31日,官方通報稱在上海和安徽兩地率先發現3例人感染H7N9禽流感病例。截止4月17日17時,全國共報告人感染H7N9禽流感確診病例82例,死亡16人。

血凝素(HA)是流感病毒的外殼蛋白,是流感疫苗的關鍵成份,也是研發H7N9特異性中和抗體的關鍵。神經氨酸酶蛋白(NA)是抗病毒藥物的靶點,是抗病毒藥物篩選和評價的重要科研工具。

4月17日,北京義翹神州成功研發出H7N9禽流感病毒(A/Shanghai/1/2013; A/Anhui/1/2013)的血凝素(HA)蛋白和神經氨酸酶蛋白(NA),并實現規模化生產。HA和NA蛋白,可幫助科學家研究病毒結構和毒性,進而有助于實現對流感的預防與治療。

據悉,12天內,義翹神州的科學家們從H7N9病毒序列分析、HA基因合成、重組蛋白表達純化、質量控制分析,以及凍干制劑全部完成。此次H7N9的多種突變血凝素蛋白(HA),神經氨酸酶蛋白(NA),其他蛋白(NP,M1)等相關的抗體和試劑盒等將在4月內集中上市。

日期:2013年4月24日 - 來自[藥學研究]欄目
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甲型H1N1流感病毒重要蛋白研究獲突破

經過近一年的攻關,中國科學院微生物研究所高福研究組對2009甲型H1N1流感病毒表面的兩個重要蛋白——血凝素(HA)和神經氨酸苷酶(NA)的研究取得重要突破。
基于結構生物學信息,研究者發現2009甲型H1N1流感病毒與季節性流感病毒的HA和NA有很大的差別,這解釋了2009年甲型H1N1流感病毒引發大流行的部分原因。該發現對于甲型H1N1流感相關藥物的設計和開發具有重要的指導意義。
有關HA的研究成果發表在今年5月的《蛋白質與細胞》(Protein  &  Cell)雜志上;NA的研究成果則于9月19日在線發表在《自然—結構和分子生物學》(Nature  Structural  &  Molecular  Biology)雜志上。
流感病毒是引起季節性、流行性流感和偶發的流感大流行的致病因子,病毒表面有兩類重要的囊膜蛋白:HA和NA。從結構上講,HA有1~16型,NA有1~9型,兩者排列組合成多種病毒亞型,2009甲型H1N1流感病毒即為HA第1型與NA第1型的組合。
兩種蛋白的功能各不相同。HA負責識別宿主細胞表面的唾液酸受體,協助病毒囊膜與宿主細胞膜的融合,在病毒導入宿主細胞的過程中發揮重要作用。HA還是一個重要的表面抗原,抗HA的抗體可以中和流感病毒。
NA則負責移去細胞受體末端與HA結合的唾液酸,有助于新生病毒粒子的釋放和遷移,防止病毒聚集。目前,臨床上廣泛使用的抗流感病藥物扎那米韋(Zanamivir,瑞樂沙)、奧塞米韋(Oseltamivi,達菲)就是針對NA酶活性中心設計的。因此,研究這兩類蛋白對于揭示特定病毒株的致病性、疫苗與藥物研發等具有重要意義。
2009年3月在墨西哥暴發的甲型H1N1流感病毒,迄今仍在世界范圍內廣泛傳播,造成了巨大的經濟和社會損失。2009甲型H1N1病毒基因片段由禽源、人源及豬源流感病毒基因重排而成,它與1918大流行流感病毒在許多方面有很高的相似性。
該研究組選取2009甲型H1N1流感病毒典型毒株A/California/04/2009(H1N1)的HA和NA作為研究對象,表達純化了這兩種蛋白并通過X-射線衍射的方法解析了它們的晶體結構,分辨率分別達到了2.9?魡和1.9?魡。
對2009HA結構的分析發現,它與1918年大流行HA的整體結構以及抗原位點(包括5個確定的抗體識別表位:Sa,Sb,Ca1,Ca2和Cb)高度相似,但與季節性流感差別很大。研究者推測,2009HA可被1918流感患者或病毒攜帶者的血清中和,該觀點解釋了年輕人對2009甲型H1N1流感易感,而老年人則具備更強的抵抗力這一現象。
研究組還發現,2009HA有增強的堿性區,可提高病毒侵染力。但2009HA堿性區附近第N279位與季節性流感及1918HA相比,多了一個糖基化位點,這個糖基化位點可以阻礙堿性區作用,并可能干擾抗體識別,可導致病毒毒力減弱,對宿主細胞的致死性減弱,病毒毒力達到動態平衡,從而有利于自己在宿主體內的大量擴增與侵染。
A型流感病毒的NA共有9個亞型,按照其一級序列可被分為兩組:N1、N4、N5和N8被分為第1組,而N2、N3、N6、N7和N9被歸類為第2組。第1組NA的主要結構特點在于它的催化位點中有一額外的空洞,稱為“150-洞”,根據這個特殊空洞可設計合成一些新型NA抑制劑。
從系統發生角度上看,2009NA屬于典型的第1組成員N1。但研究者解析其晶體結構后發現,與其他典型的第1組N1相比,2009NA并沒有“150-洞”,由此推測針對“150-洞”的藥物對于2009甲型H1N1流感病毒作用效率減弱,甚至無效。
對此,研究者建議,在設計合成新型抗2009甲型H1N1流感病毒NA藥物的時候,須避免針對“150-洞”的設計方法,而應將目光集中在更小的酶活區域。在設計其他NA亞型流感病毒藥物的時候,也應充分考慮第1組和第2組NA的區別,來設計特異性的藥物。
該項研究的牽頭人高福2004年從牛津大學回國,組建了病原微生物與免疫學實驗室,研究重點是基于結構的病原與免疫相關蛋白的功能研究。該項研究得到了中國科學院“流感大流行應急啟動項目”和科技部“流感大流行‘973’項目”的共同支持。
日期:2010年9月20日 - 來自[科研進展]欄目

Ke$ha出街 惡女鋒芒不可擋

  被譽為是麥當娜與野獸男孩絕妙混搭的23歲女歌手Ke$ha,終于讓Lady Gaga遇上了對手。她的橫空出世,一掃美國Billboard單曲榜,輕松刷新了Gaga姐創造的下載次數紀錄,并再次掀起全球舞曲熱潮,繼Lady Gaga、Beyonce、Amy Winehouse和Rihanna后,晉身新一代Fierce女歌手之林。

  Ke$ha在音樂上一路過關斬將,力壓群雄。在時尚界,她也是來勢洶洶,一上來就準備奪取半壁江山。而且,這位新晉惡女的彪悍作風也屬于不驚人死不休的那種,頗有Gaga姐出道時的風采。比如,在為Sounds Like Paper活動獻唱時,Ke$ha就頭戴插著羽毛的坦克帽和豹紋手套,抱著一個沖鋒槍形狀的吉他登臺,儼然一副嗜血女戰士的造型,而她使用的麥克風底座是用骷髏和中國娃娃組成,調節處則是一只瘦骨嶙峋的手,看得人脊柱一陣一陣冒冷汗。

  沒有顯赫的背景,Ke$ha只是來自一個普通的單親家庭,媽媽是一位歌手兼作曲人,一邊辛苦工作一邊養育她和哥哥,因此,決定了她不可能擁有像前輩“雷帝”一樣雄厚的財力,逛奢侈品店就像逛超市般,也不會有一個團隊來專門為她做造型設計,但Ke$ha也有自己的時尚經,標志性的撕破蕾絲絲襪、光面Legging 、夸張的哥特妝等。在穿衣打扮上,她是十分有主見的,即便是Gaga姐玩剩下的,也能被她玩出自己的時尚風格來。

  Ke$ha這幾日在紐約的短暫停留,可忙壞了狗仔隊。她離開著名的Tracie Martyn沙龍中心時,戴著不知從哪里弄來的老虎面具,挎著保鏢的手臂走出來,讓人不禁產生疑問她到底是做了什么療程非要戴個面具,如此見不得人?后來從下榻的曼哈頓酒店出來去音樂工作室開工,趕上揮汗如雨的天,她又穿了件皮草,還在胸前掛了個大牛角,后來還被多事者踢爆那件皮草是人造的。

  真是長江后浪推前浪,前浪拍死在沙灘上,可Ke$ha的風光能維持多久?誰管她,反正人家現在紅了,還紅得一發不可收拾。

日期:2010年9月3日 - 來自[時尚明星秀]欄目
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介入治療對胰腺癌患者血清bFGF、ColⅣ、HA的影響

【摘要】  目的 探討胰腺癌患者介入治療前后血清堿性纖維母細胞生長因子(bFGF)、Ⅳ型膠原(ColⅣ)和透明質酸(HA)的變化及其臨床意義。 方法 分別采用雙抗體夾心酶聯免疫法(ELISA)和放射免疫法測定55例中晚期胰腺癌患者行動脈栓塞化療術治療前后血清bFGF、ColⅣ和HA的含量,并與健康對照組比較分析。 結果 胰腺癌組介入治療前bFGF、ColⅣ和HA均增高,與對照組比較有顯著性差異(P<0.05);行化療栓塞術后,患者血清bFGF、ColⅣ和HA的含量均降低(P<0.05);應用免疫調節劑組較未用組血清bFGF、ColⅣ和HA的含量下降更顯著。 結論 檢測胰腺癌患者血清bFGF、ColⅣ和HA的含量的水平,有助于了解腫瘤的浸潤轉移和病程,介入治療能抑制腫瘤的浸潤轉移,輔以合理的過繼免疫治療能增強這種作用。

【關鍵詞】  胰腺癌;介入治療; sTNFR-1;T淋巴細胞;rDNA轉錄活性

胰腺癌是嚴重危害人類健康的常見惡性腫瘤之一,由于其發病隱匿,臨床上得以診斷時常常失去了手術治療的機會。現代腫瘤學認為腫瘤新生血管的形成和浸潤轉移是惡性腫瘤病人致死的主要原因,研究發現堿性纖維母細胞生長因子(Fibroblast Growth Factor-basic,bFGF)與腫瘤血管的形成有關[1],而癌細胞在浸潤轉移時必須穿破基底膜,作為基底膜的主要成分的Ⅳ型膠原(ColⅣ)和透明質酸(HA)也有研究表明在腫瘤患者血清中有升高[2,3]。目前動脈化療栓塞術(介入治療)已成為治療中晚期胰腺癌患者的首選方法[4],它能夠有效地殺滅腫瘤細胞,在一定時間內控制腫瘤的生長,延長患者的生命。我們檢測55例中晚期胰腺癌患者行介入治療前后血清bFGF、ColⅣ和HA的含量,并結合臨床資料探討其意義。

  1  材料與方法

  1.1  臨床材料  55例胰腺癌患者為我院2005年11月~2007年8月收住的患者,術前未進行放、化療,男40例,女15例,年齡40~65歲,平均(50.8±4.9)歲。其中胰頭癌28例 ,胰體癌12例,胰尾癌15例。按國際抗癌聯盟胰腺癌TNM分期:Ⅲ期35例,Ⅳ期20例,介入治療前均作肝、膽、胰、脾腎、腹腔淋巴結等的B超、CT或MRI等影像學檢查,以了解病變大小、范圍、侵犯鄰近器官情況和毗鄰關系。另取健康查體人員30例作為對照組。

  1.2  方法

  1.2.1  治療方法  采用Seldinger技術股動脈穿刺插管,腹腔干動脈或腸系膜上動脈造影后超選擇插管,對胰頭部腫瘤選用肝動脈化療栓塞;對胰體部腫瘤選用腹腔動脈化療栓塞;對胰尾部腫瘤選用脾動脈化療栓塞。常規用藥為表阿霉素20~40mg、絲裂霉素10~20mg、卡鉑100~200mg、5-氟脲嘧啶1 000mg。經導管灌注化療后約30min后用超液化碘油10~20ml與適量化療藥物混懸成乳劑,行供血動脈栓塞,一般以透視下腫瘤區碘油沉積滿意為止。每4~6wk為1個療程,55例患者共行介入治療146次,平均2.65次,其中39例在行介入治療前后應用人重組白細胞介素-2(r-IL-2)和人重組干擾素(r-IF)等免疫調節因子。一般r-IL-2為5~10萬單位,隔日1次肌注;r-IF50萬單位,每周2次皮下注射。兩種免疫制劑均應用4周,另外16例未用。

  1.2.2  觀察指標  分別在介入治療術前3d和術后2wk凌晨抽取患者靜脈血5ml,離心取血清置-20℃冰箱保存待測。采用雙抗體夾心ELISA檢測法測定bFGF,所用抗bFGF免疫酶標試劑盒為美國R & D公司產品、ColⅣ、HA放射免疫試劑盒購于上海海軍醫學研究所,所有檢測均嚴格按試劑盒說明書操作。

  1.2.3  統計學處理  計量資料用“x±SD”表示,采用兩樣本均數的t檢驗或介入治療前后配對設計t檢驗分析處理。

  2  結果

  2.1  胰腺癌患者介入治療前后血清bFGF、ColⅣ和HA的觀察,由表1可見患者介入治療術前血清bFGF、ColⅣ和HA水平均明顯高于正常對照組(P<0.05),經介入治療后bFGF、ColⅣ和HA水平均明顯低于治療前(P<0.05)。

  表1  胰腺癌介入治療前后血清bFGF、ColⅣ和HA水平比較(略)

  注:與對照組比較,P<0.05;與治療前比較,#P<0.05。

  2.2  使用免疫調節劑組與未使用組介入治療前后血清bFGF、ColⅣ和HA水平比較  由表2可見,使用免疫調節劑組較未使用組血清bFGF、ColⅣ和HA降低更明顯(P<0.05)。

  表2  用與不用免疫調節劑對血清bFGF、ColⅣ和HA水平的影響(略)

  注:與治療前比較,P<0.05;與使用免疫調節劑組比較,#P<0.05。

  3  討論
   
  實體瘤生長和轉移依賴于新生血管的生成,而血管的形成受到多種促進因子和抑制因子的調節,bFGF與血管內皮生長因子(Vascular endothelia growth factor, VEGF)是兩個重要的促進血管長成的因子,與腫瘤尤其是實體瘤的關系尤為密切。bFGF是由146個氨基酸組成分子量為18KD的堿性蛋白質,它具有促進源自中胚層和神經內胚層細胞有絲分裂的活性,可促進內皮細胞,與許多腫瘤的血管生成有關,研究已發現包括乳腺癌.肺癌及胃腸道腫瘤患者血清中bFGF增高,且與腫瘤的惡性程度.浸潤轉移及預后密切相關[1,5]。對于腫瘤患者血清中bFGF水平增高的原因,目前認為一方面是由于腫瘤生長到一定時間和程度時,腫瘤細胞壞死或死亡,bFGF從腫瘤細胞中釋放到血清中;另一方面則是腫瘤細胞的旁分泌因子的作用[6]。
   
  浸潤和轉移是惡性腫瘤病人死亡的主要原因之一,癌細胞在向外周轉移時必須穿破基底膜,ColⅣ和HA是基底膜的主要成分,對ColⅣ和HA破壞是腫瘤細胞浸潤轉移的基礎。腫瘤細胞幾乎不產生ColⅣ,癌基質細胞產生的ColⅣ比正常基質細胞產生也明顯減少,腫瘤細胞通過分泌大量ColⅣ酶,協同尿激酶型纖溶酶原激活物(Urokinase-type plasminogen activator uPA)等共同作用,從而破壞基底膜的結構[7,8]。HA系N-酰糖胺與D-葡萄糖醛酸組成的粘多糖,主要分布于結締組織,并與膠原結構蛋白、蛋白聚糖等構成基底膜的主要成分,在許多發育和調控過程如細胞粘附、創傷愈合、腫瘤發生及血管形成中起重要作用。導致腫瘤患者血清中HA增高的原因目前認為有腫瘤細胞的直接產生、腫瘤細胞浸潤周圍結締組織、HA酶抑制物的大量堆積等。已有的研究報告顯示,腫瘤患者特別是實體瘤患者血清中ColⅣ和HA均升高,且與腫瘤的惡性程度、浸潤轉移、治療效果及患者的預后存在明確的相關性[9,10]。
   
  本文檢測了45例中晚期胰腺癌患者接受介入治療前后血清bFGF、ColⅣ和HA水平變化,結果顯示,胰腺癌組治療前血清bFGF、ColⅣ和HA水平均增高,與對照組比較有顯著性差異(P<0.05);行介入治療后,患者血清血清bFGF、ColⅣ和HA水平降低,治療前后有明顯的差異(P<0.05)。說明介入治療作為有效的治療手段降低了腫瘤患者的腫瘤負荷,部分解除了腫瘤對機體的浸潤及血管生成影響,不失為一種有效的胰腺癌治療措施。
   
  研究還觀察到,對39例應用免疫調節因子患者較16例未用患者接受介入治療后血清bFGF、ColⅣ和HA水平降低更顯著(P<0.05),提示應用免疫調節因子除了對改善腫瘤患者的免疫功能有重要作用外,對于抑制腫瘤對機體的浸潤及血管生成也有重要的影響。因此,在腫瘤治療中有必要盡早選擇適當的過繼免疫療法,以提高和改善患者免疫功能,并調動機體自身抗腫瘤浸潤和轉移作用,以進一步提高胰腺癌患者介入治療的療效。
                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                             

【參考文獻】
  1] 張晶晶,王波,劉增娟.腹膜間皮細胞對卵巢細胞血管生成因子表達及分泌的影響[J]. 中華腫瘤雜志,2006,28(10):737~740.

  [2] 施磊,馬金萍,任重,等. Ⅳ型膠原、層粘連蛋白、纖維連接蛋白在喉鱗癌中的表達[J]. 中國醫科大學學報, 2005,34(4):339~341.

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  [6] Sasamura H, Takahashi A, Miyao N, et al.Inhibitory effect on expression of angiogenic factors by antiangiogenic agents in renal cell carcinoma[J]. Br J Cancer, 2002,86:768~773.

  [7] 曹銳,李天星,楊玲.肺癌患者血清VEGF、ColⅣ、LN檢測及其臨床意義[J]. 第三軍醫大學學報, 2002,24(2):212~213.

  [8] 崔青,劉玉芳,王文雙.卵巢癌患者血清與腹水HA含量檢測的臨床意義[J].中華腫瘤防治雜志,2006,13(22):1728~1729.

  [9] 蒲小勇,胡禮泉,王志平, 等. 尿膀胱癌抗、透明質酸和存活素聯合應用對膀胱癌的診斷價值[J]. 中華泌尿外科雜志, 2006,27(7):475~478.

  [10] 周進茂,白海,王存邦,等.癌癥患者血清透明質酸、Ⅳ型膠原及層粘連蛋白水平變化及其臨床意義[J]. 中國綜合臨床, 2005,21(7):638~639.


作者單位:解放軍第三零三醫院191臨床部放射科,廣西 貴港 537105; 解放軍第421醫院消化科,廣東 廣州 515005.

日期:2010年1月13日 - 來自[2008年第8卷第5期]欄目

豬流感病毒HA基因DNA疫苗的構建

來自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所,獸醫生物技術國家重點實驗室,農業部動物流感中心及國家禽流感參考實驗室的研究人員以A/Swine/Guangdong/LM/2004(H1N1)豬流感病毒HA基因為模板,通過RT-PCR技術擴增出HA基因,并將其克隆到pCI-neo真核表達載體中,成功構建重組表達質粒pCI-HA,并通過免疫過氧化物酶單層細胞試驗等對Balb/c小鼠的免疫效果評價。

H1亞型豬流感是由隸屬于正黏病毒科A型流感病毒屬的豬流感病毒引起的豬呼吸道、生殖道以及免疫抑制疾病,是目前危害全世界養豬業的重要呼吸道疾病之一。H1亞型流感在1918年就已經發生,然而第一株H1N1亞型SIVA/Swine/lowa/15/31(H1N1)于1931年才被分離并鑒定出來。回顧人類流感史,20世紀每次人類流感大流行的前后都有SI的發生和流行。近來報道1918年“西班牙流感”大流行的H1N1毒株與古典型H1N1SIV在基因和抗原方面極為相似。

對于豬流感并沒有真正的治療方法,但是及時進行免疫接種能夠提供有效保護。目前,SI的防制多采用滅活疫苗進行預防接種,并在控制SI的發生和蔓延中發揮了重要作用。H1N1亞型SI滅活疫苗主要依靠產生抗HA抗體而提供保護,然而HA基因變異頻繁,使得疫苗株不能夠對流行株產生有效的保護,另外由于滅活疫苗存在免疫劑量大、免疫期短及毒副作用大等諸多問題導致免疫失敗常有發生。研究發現類型不同的疫苗在預防流感時有相互補充的免疫加強作用。鑒于滅活疫苗本身存在有缺點,而所以通過研究各種疫苗的優缺點,取長補短,可實現免疫效果的最佳化。核酸疫苗由于其既能夠誘導體液免疫反應又能誘導細胞免疫反應,因此得到了廣泛的研究。

在這篇文章中中,研究人員以A/Swine/Guangdong/LM/2004(H1N1)豬流感病毒HA基因為模板,通過RT-PCR技術擴增出HA基因,并將其克隆到pCI-neo真核表達載體中,成功構建重組表達質粒pCI-HA,瞬時轉染vero E6和293T細胞,通過免疫過氧化物酶單層細胞試驗(Immunoperoxidase monolayer assay ,IPMA)、間接免疫熒光試驗(indirect immunofluorescence assay, iIFA)和蛋白免疫印跡(Western blot,WB)實驗證明,HA基因能夠在哺乳動物細胞中有效表達并具有良好的生物學活性。將重組質粒三次免疫8w雌性Balb/c小鼠后,ELISA試驗和中和試驗結果表明該重組質粒能夠誘導小鼠產生較高的抗體滴度,并具有良好的中和活性。因此為H1亞型豬流感DNA疫苗的研究奠定了理論基礎。

HA蛋白是流感病毒感染宿主細胞的主要致病因子,也是流感病毒的重要抗原,可以刺激機體產生中和保護抗體,也可以誘導機體產生細胞免疫反應.但是常規SI滅活疫苗和弱毒疫苗免疫后,利用血清學方法不能區分出免疫動物和自然感染動物,干擾病毒流行病學監測。DNA疫苗是利用病原的保護性抗原構建真核表達質粒,再將質粒DNA導入機體細胞,使外源基因借助于機體內源性表達系統表達并提呈給宿主免疫系統,誘導產生特異性的免疫應答反應,從而達到免疫目地的新型基因工程疫苗。DNA免疫還具有高度安全穩定,不受宿主種屬特性及免疫狀態限制和不干擾血清學調查的特點,而且DNA接種還被認為有可能是消滅大流行性流感病毒的一種快速有效方法。

日期:2009年12月10日 - 來自[科研進展]欄目
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臺“中研院”疫苗研究獲突破

        據臺灣《聯合晚報》報道,臺灣“中央研究院”又有重大突破,院長翁啟惠領軍的研究團隊成功找出禽流感病毒與宿主細胞最初結合過程中醣分子的關鍵性功能,未來可望研發出更有效的分子疫苗,對抗甲型H1N1流感、禽流感,甚至可預防艾滋病、癌癥及丙型肝炎等重大疾病,延長人類壽命。
  “這是個跳躍式的突破”“中研院”基因體研究中心助研究員馬徹強調,包括即將全面開打的甲型流感疫苗,所有傳統疫苗都采未經修飾的病毒為載體,效果有限;未來若能改采修飾過病毒制造的分子疫苗,將可誘發體內更強的免疫反應,產生更好的保護效果。
  馬徹表示,翁啟惠領軍的研究團隊,多年來鉆研醣分子在病毒及病毒與細胞結合所扮演的角色,如今終有突破性發展。論文今天刊登在全球頂尖的《美國國家科學院期刊》,該期刊并專文介紹,可見其重要性。
  馬徹表示,包括禽流感、甲型流感在內的流感病毒,表面由“血球凝集素”(HA)與“神經胺酸酶”(NA)這兩個醣蛋白所構成。其中,HA表面布滿醣分子,專門負責附著到宿主細胞的任務。研究團隊設計出4種HA,再合成出24種人類宿主細胞表面的糖芯片,交叉進行96種檢測。
  結果發現HA表面上的醣分子越少、越短時,HA結合細胞的能力越強,但專一性越差。反之,HA表面上的醣分子越多及越長時,HA結合細胞的能力越弱,專一性則越好。研究團隊接著進行小白鼠的動物實驗,發現HA表面上醣分子越少、越短的分子疫苗,可誘發越強的反疫反應,一旦病毒入侵時,保護力也越好。
  馬徹指出,季節性流感、禽流感及甲型流感等傳統疫苗,HA表面上醣分子都未經修飾,既多且長,多了一層遮蔽,所產生的抗體無法辨識蛋白體全貌,雖對某些宿主細胞的專一性較好,但免疫反應及保護力相對較差。今后,若能制造出HA表面上醣分子修飾得更少、更短的分子疫苗,應可明顯增加保護力。
  翁啟惠透露,這項研究成果已申請專利,并技術移轉給美國邁阿密OPKO  Health公司,臺灣子公司將在臺灣繼續疫苗研發的工作,未來可望研發出新一代禽流感、甲型流感等疫苗。
日期:2009年10月15日 - 來自[流行病與傳染病]欄目

銀屑病患者血清TNF-α、HA、LN濃度變化與細胞粘附分子的關系

銀屑病患者血清TNF-α、HA、LN濃度變化與細胞粘附分子的關系

中國免疫學雜志 2000年第4期第16卷 臨床免疫學

作者:羅南萍 孫曉明 楊道理 李冠勇

單位:羅南萍(濟南軍區總醫院免疫科, 濟南 250031);孫曉明(濟南軍區總醫院流式細胞室,濟南 250031);楊道理(濟南軍區總醫院免疫科, 濟南 250031);李冠勇(濟南軍區總醫院皮膚科,濟南 250031)

關鍵詞:銀屑病;細胞因子;細胞間基質成分;細胞粘附分子

  摘 要 目的:探討細胞因子(TNF-α)、細胞間基質成分(HA、LN )與細胞粘附分子(CD44)在銀屑病時的關系及致病作用。方法:采用放 射免疫分析法及流式細胞術檢測了35例銀屑病和30例健康人血清TNF-α、H A、LN含量及外周血單核細胞CD44陽性細胞數。結果:銀屑病患者血 清TNF-α、HA及LN濃度均明顯高于對照組,差異顯著(P<0.01)。CD44 陽性率亦顯著增高,與對照組比較差異十分顯著(t=17.99;P<0.01 ), 銀屑病患者CD44表達上調與HA濃度增高呈正相關,HA與TNF亦呈正相關。結論: CD44作為透明質酸受體與TNF、LN共同參與了銀屑病發病的病理過程。

  中國圖書分類號 R446.6

Studies on TNF,HA,LN and leukocyte CD44 relativity in the psoriasis vulgaris

LUO Nan-Ping SUN Xiao-Ming YANG Dao-Li

  (Department of Immunology,Gener al Hospital of Jinan Military Region,Jinan 250031)

  Abstract Objective:To explore the correlation between th e tumor necrosis factor-α(TNF-α),Hydluronic aoid(HA),Laninin(LN) and leukoc y te CD44 each other in the psoriasis.Methods:The measure o f radio-immunity analysis and fluorescence activated cell sorting technique we re used to TNF-α,HA,LN and CD44.Results:TNF-α,HA,L N higher in the psorials than that in the normal(P<0.01),CD44 cell rate increased obvious (P<0.01). The upregulation express ion of CD44 and the increase of HA were significantly correlated. HA was positiv ely correlated to TNF.Conclusion:CD44, the receptor of hy dluronic acid with TNF,LN participatedin pothology to psoriasis.

  Key words Psoriasis Cellular factor Extracelluar stromati c component Cellular adhesion molecule

  角朊細胞過度增生和中性粒細胞局限性浸潤是銀屑病的重要病理特征。最新 研究顯示,T淋巴細胞與細胞因子、細胞間基質成分的內在聯系、相互作用是 炎性細胞在皮膚聚集的關鍵[1]。為此,我們觀察了35例銀屑病患者血清腫瘤壞 死因 子α(TNF-α)、透明質酸(HA)、層粘連蛋白(LN)的濃度變化和外周血單核細胞粘附分子(CD44)的表達 特征,以探討銀屑病時細胞因子、細胞間基質成分和細胞粘附分子之間的相互作用及致病 機理。

  1 材料與方法

  1.1 研究對象 銀屑病患者35例,男25例,女10例,年齡7~60歲,平均34 .5歲。病程7~20 d。其中尋常型34例,膿皰型1例,泛發型24例,局限型11例,均為進行期 病人。排除系統性疾患。正常對照組30例為健康獻血員。男17例,女13例,平均32歲。

  1.2 方法

  1.2.1 TNF、HA與LN測定 抽取患者空腹靜脈血

  3 ml,1 500 r/min離心5 m in后,吸取血清置-20℃冰 箱待測。實驗前于室溫復溶后使用。TNF試劑盒由解放軍總醫院東 亞免疫技術研究所提供,HA與LN試劑盒均由上海海軍醫學研究所技術中心提供。采用放射免 疫(RIA)順序加樣法復管檢測。測量儀器為FT-630 G型微機多探頭γ計數儀,測量數據經 計算機處理自動擬合曲線,給出濃度。

  1.2.2 CD44測量

  1.2.2.1 單克隆抗體和對照 異硫氰酸熒光素(FITC) 標記鼠抗人CD44單克隆抗體,由法國國際免疫公司生產。

  1.2.2.2 流式細胞儀 FACSCan型,美國Becton Dickinson公司生產。

  1.2.2.3 PBMC懸液置備 將2 ml EDTA抗凝血重懸于Ficoll-Hypaqut分離 液上,1 500 r/min離心1 5 min,提取單核細胞層,再以PBS 2 ml漂洗1次,離心速度同上,去上清后以70%乙醇固 定,4℃保存備用。

  1.2.2.4 免疫熒光染色 反應前以PBS漂洗離心,以除去固定劑。將PBS懸 液分為4管,每管 500 μl,分別加入FITC標記鼠抗人CD44單克隆抗體,FITC標記羊抗鼠IgG1,單克隆抗體20 μl,室 溫下反應20 min,以PBS漂洗2次,棄上清液。

  1.2.2.5 流式細胞計數 上機后計數2×106個細胞,熒光強度以對數放 大,光散射數據存軟盤, 在Macintosh 650 型計算機上用Cell Qutst Plot軟件(美國Becton-Dickinson公司產) 分析數據。

  1.2.3 統計學處理 檢測結果以

  2 結果

  銀屑病患者血清TNF-α、HA、LN濃度均明顯增高,與對照組比較差異非常顯著(P <0.01)。銀屑病組外周血單核細胞CD44陽性率較對照組明顯增高(t=5.01;[ WTBX P<0.01),其中高于正常均數水平者占65%(21/35),見表1。相關分析顯 示,銀屑病患者血清TNF-α含量增高與HA呈明顯正相關(r=0.625,P<0. 01),與LN亦呈正相關(r=0.45,P<0.05),CD44陽性率上調與HA增高 呈顯正相關(r=0.40,P<0.05)。

表1 銀屑病患者血清TNF-α、HA、LN與外周血CD44的測定結果(

  Tab.1 Serum TNF-α,HA,LA and CD44

  conccrtrations of psoriasis patients(

Group n TNF-α(ng/L) HA(ng/L) LN(ng/L) CD44(s,%)
Control 30 0.99±0.13 40.55±4.80 79.11±14.40 4.75±1.02
Psoriasis 35 1.52±0.891) 75.26±17.121) 94.79±17.501) 5.27±1.741)

  Note:1)Compared with control,P<0.01

  3 討論

  TNF-α是機體炎癥與免疫反應應答的重要調節因子,本組實驗觀察到銀屑病患者血清TNF- α水平明顯增高,提示TNF在銀屑病發病機制中起重要作用,它可誘導角朊細胞和血管內 皮細胞表達細胞間粘附分子,從而提供中性粒細胞與淋巴細胞的粘附位點,還可協助炎性細 胞穿透血管壁,活化中性粒細胞與血管內皮細胞引起機體強烈的炎癥反應,釋放炎性介質, 導致以免疫反應為主的病理過程。

  HA與LN均為細胞間基質的主要成分,廣泛分布于結締組織、皮膚、軟骨的關節滑液 中,與膠 原結構蛋白,硫酸皮膚素等一起構成蛋白基質的主要成分[2]。本組銀屑病患者血 清HA水平顯著增高,其中有2例患者HA>1 000 ng/L以上,提示升高的HA與病變皮損處表皮 細胞增生過度及炎癥性改變有關,LN是多形核白細胞(PMN)表面CD11/CD18的配體之一[ 3],銀屑病時角朊細胞可表達分泌細胞因子,炎癥細胞向表皮游走過程也可刺激角朊細 胞產生LN。

  近幾年分子生物學的進展,證明炎癥性損害的發生需要各種細胞因子的相互作用從白細胞游 走到炎癥部位,再通過內皮外滲到組織形成血管周圍炎性細胞浸潤的過程,都與一些細胞因 子-粘附分子有關[4],CD44是細胞表面的整合膜蛋白,亦是一種多結構 多功能 的表面粘附分子,參與細胞-細胞-基質之間的相互作用,同時,CD44還可作 為透明質酸受體識別透明質酸[5]。本組結果顯示銀屑病患者外周血單核細胞CD44 表 達異常增高,表明粘附分子在皮膚病的發病中起重要作用,它在銀屑病患者體內聚集表明有 選擇 性通路促使細胞向皮膚游走,CD44是一種特殊的細胞粘附分子,被激活后有效地與配體透明 質酸結合,參與淋巴細胞浸潤,細胞因子異常,血管發生等病理過程。

  綜上所述,可看出TNF、HA、LN和CD44與銀屑病發病密切相關,它們以多種多樣活性參與銀 屑病炎癥反應,并構成功能性細胞因子-細胞粘附分子-細胞間基質成分之間的網絡,相互 制約或協作,對機體致炎及免疫功能起重要的作用。

  作者簡介:羅南萍,女,49歲,副主任技師,主要從事臨床免疫檢驗學研究

  4 參考文獻

  1,Batker J N W N. The pathophysiology of psoriasis. Lancet,1991;338:22 7

  2,馬云寶,何啟志.透明質酸的臨床應用及研究進展.國外醫學.放射醫學核醫學分冊,1 995;19(2):66

  3,徐 彤.層粘連蛋白的結構及功能.國外醫學.免疫學分冊,1996;19(2):253

  4,張 煒.血管內皮和粘附分子在銀屑病發病中的作用.國外醫學.皮膚性病學分冊,199 7;23(1):11

  5,程 琳,程天民.CD44的基因結構和生物學功能.國外醫學.分子生物學分冊,1998;2 0(5):201

[收稿1999-03-13]


日期:2009年2月21日 - 來自[檢驗醫學]欄目
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幾種血清學指標對肝纖維化診斷意義的探討

肝纖維化是慢性肝炎向肝硬化發展的可逆階段[1],及時正確地診治,對控制病情有重要的臨床意義。我科自1996年1月~1998年12月,對218例各型肝病患者,采用放免法和比色法,檢測血清透明質酸(HA)、層粘蛋白(LN)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)和脯氨酸肽酶(PLD)五項指標,與45例正常人對照,探討五項指標對各型肝病肝纖維化診斷的實用價值。

  1 材料和方法

  1.1 病例來原 218例均系住院患者,男122例,女96例,平均年齡43歲,按1995年北京第五次全國傳染病與寄生蟲病會議修訂的標準診斷,病毒性肝炎(急性)(以下簡稱急性肝炎)42例,病毒性肝炎(慢性)輕型38例,中型34例,重型48例(分別簡稱慢肝輕、中、重型),肝炎肝硬化(簡稱肝硬化)56例。對照組45例,為健康獻血員,平均年齡38歲。

  1.2 檢測方法 HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ采用放免法,PLD采用比色法,試劑盒由重慶市腫瘤研究所提供。

  2 結果

  2.1 五項指標在各肝病組的檢測結果 見表1。

  由表1可知,與對照組相比:急性肝組除LN外,余指標均升高,以PLD為明顯(P<0.05);慢肝中,重型及肝硬化組五項指標均明顯升高(P<0.01)。與慢性輕型肝炎相比:急肝組無差異,慢肝中型組,除Ⅳ-C外,差異均有顯著性(P<0.05);慢肝重型及肝硬化組五項指標差異均有顯著性(P<0.01)。肝硬化組HA、Ⅳ-C、PLD明顯高于慢肝重型組(P<0.05),PCⅢ則較之略低。

  2.2 五項指標在各肝病組的陽性檢出情況 見表2。

  由表2看出,各肝病組五項指標陽性平均檢出率依急肝組、慢肝輕、中、重型組、肝硬化組逐漸升高,分別為5.8%、30.9%、76.9%、84.9%和87.5%。單項指標檢出率,在急肝組Ⅳ-C>PCⅢ>HA>PLD=LN,慢肝輕型PCⅢ>Ⅳ-C>HA>PLD>LN,慢肝中型Ⅳ-C>HA>=PLD>PCⅢ>LN,慢肝重型PLD>Ⅳ-C>HA=LN>PCⅢ,肝硬化PLD>HA>Ⅳ-C>LN>PCⅢ。五項指標的檢出率在組間比較:與急肝組相比,除慢肝輕型組LN外,余差異均有顯著性(P<0.05);與慢肝輕型組比較;慢肝中,重型及肝硬化組差異均有顯著性(P<0.05)。

  2.3 不同指標組合在各肝病組的陽性檢出情況 通過五項指標聯合檢測,發現三項指標以上的不同組合在慢性肝病組的陽性檢出率明顯高于單項或兩項指標組合,從中篩選出具優勢的四種不同組合,與五項指標組合的檢測結果進行對比分析,見表3。

  表3說明,急肝組及慢肝輕型組,各指標聯合的陽性檢出率都非常低,組間無差異;慢肝中、重型及肝硬化組陽性檢出率明顯升高,以五項指標聯合最優,平均達95.43%,HA+Ⅳ-C+PLD與HA+LN+Ⅳ-C+PCⅢ次之,分別為92%和91.3%,二組間無統計學差異。HA+Ⅳ-C+LN和HA+LN+PCⅢ組合的陽性率分別為70.38%和65.74%,經統計學處理與五項聯合組相比差異有顯著性(P<0.05)。

  3 討論

  研究血清肝纖維化指標用于肝纖維化的診斷,是近年醫學界頗為關注的熱門課題之一。目前,國內外文獻報道較多的有價值的指標是PCⅢ、Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原、HA、LN[2~5],上述有些指標因并非肝纖維化所特有[7],尤其是單項指標的升高,很難作出慢性肝病肝纖維化的準確診斷[4]。有些學者主張2~3項指標聯合檢測,有提高診斷的可靠性[4,5]。但因研究的指標不統一,缺乏可比性。我們通過檢測具有代表性的HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ及與之代謝相關的PLD五項指標在各項肝病組的血清水平,以期找出對肝纖維化診斷更有價值的單項指標和組合指標。研究結果表明,急肝組因無肝纖維化,各指標除PLD外與對照組無差異。慢肝輕型組HA、Ⅳ-C、PCⅢ明顯升高,慢肝中、重型組及肝硬化組五項指標均顯著升高,與對照組差異有顯著性(P<0.05或P<0.01)。組間比較,除PLD在慢肝中、重型組,PCⅢ在慢肝重型及肝硬化組間無差異外,余差異均有顯著性(P<0.05)。提示多項指標大幅度升高,對慢性肝病的分型及肝纖維化的診斷有較高價值。

  各肝病組五項指標的不同升高,其診斷意義有別。Ⅳ-C、PCⅢ、HA在慢肝輕型即顯著升高,與文獻報道類同,是肝纖維化早期診斷指標[5]。LN至慢肝中期后始升高明顯,對中晚期肝纖維化診斷有幫助。PLD因其在急性肝炎時與ALT同步升高,胡大榮等認為此酶具有反映肝損傷和肝纖維程度的雙重性[6],但本組試驗發現PLD在肝硬化升高,明顯優于其他肝病組(P<0.05或P<0.01),故認為是判斷肝硬化的良好指標,但需作動態觀察。

  五項指標在各肝病組的陽性檢出率依病情進展而升高,以慢肝中重型及肝硬化為著(P<0.05),其中HA、PLD在肝硬化組的檢出率更為突出,與上述結果判斷相吻合。各指標單項檢出率在慢肝輕、中、重型組及肝硬化組的順序依次是PCⅢ>Ⅳ-C>HA>PLD>LN, Ⅳ-C>HA=PLD>PCⅢ>LN, PLD>Ⅳ-C>HA=LN>PCⅢ, PLD>HA>Ⅳ-C>LN>PCⅢ, 此現象可能與肝纖維化形成的機理有關。

表1 五項指標在各肝病組的檢測結果(

  Tab.1 Detection of five indexes in hepatitis patients

病人

  Patient

病例數

  Case no.

透明質酸

  HA(μg/ml)

層粘蛋白

  LN(μg/ml)

Ⅳ型膠原

  Ⅳ-C(μg/ml)

Ⅲ型前膠原

  PCⅢ(μg/ml)

脯氨酸肽酶

  PLD(μg/ml)

急性肝炎

  Acute hepatitis

42 82.72±30.62 71.18±26.7 93.7±69.8 91.4±18.64 1087±48.2
慢肝輕型

  Chronic hepatitis

  (mild)

38 105.42±68.7 97.49±20.04 177.2±48.2 108.62±26.22 806±149
慢肝中型

  Chronic hepatitis

  (moderate)

34 196.87±98.45 147.55±36.85 197.6±116.2 198.46±69.38 1414±105
慢肝重型

  Chronic hepatitis

  (severe)

48 486.14±212.11 182.56±94.39 291.8±230.8 247.66±20.14 1856±389
肝硬化

  Liver cirrhosis

56 769.26±652.28 264±102.42 528.1±318 227.08±30.25 2108±558
對照組

  Control

45 57±27 115.7±27.3 86.9±23.9 62.26±21.04 890±110

  注:①與對照組比較,P<0.05;②與慢肝輕型比較,P<0.05;③與慢肝中型比較,P<0.05;④與慢肝重型比較,P<0.05;與慢肝輕型比較,P<0.01

  Notes:①Compared with control, P<0.05; ②Compared with mildcbronic hepatitis, p<0.05; ③Compared with moderate chronic hepatitis, P<0.05; ④Compared with severe chronic hepatitis, P<0.05; with mild chronic hepatitis P<0.01

表2 五項指標在各肝病組的陽性檢出情況☆

  Tab.2 Positive detection rates of five indexes in hepatitis patients

指標

  Index

急性肝炎(42例)

  Acute hepatitis

  病例數(%)

  Case no.(%)

慢性肝炎

  Chronic hepatitis

肝硬化(56例)

  Liver cirrhosis

  病例數(%)

  Case no.(%)

輕型(38例)

  Mild type

  病例數(%)

  Case no.(%)

中型(34例)

  Moderate type

  病例數(%)

  Case no.(%)

重型(48例)

  Severe type

  病例數(%)

  Case no.(%)

HA 2(4.80)

12(31.58)

26(76.50) 40(83.33) 52(92.86)
LN 1(2.49) 5(13.20) 25(73.53) 40(83.33) 46(82.14)
Ⅳ-C 4(9.69) 13(34.12) 28(82.35) 41(85.41) 49(87.50)
PCⅢ 3(7.29) 17(44.19) 25(75.53) 35(81.25) 45(80.30)
PLD 2(4.80) 6(15.26) 26(76.50) 44(91.67) 53(96.64)

  注:①與急肝組比較,P<0.05;②與慢肝輕型組比較,P<0.05;③與慢肝中型組比較,P<0.05;☆大于對照組,

  Notes:①Compared with acute hepatitis, P<0.05; ②Compared with mild chromic hepatitis, P<0.05; ③Compared with moderate chromic hepatitis, P<0.05; ☆Greaer than control group,

表3 不同指標組合在各肝病組的檢出情況

  Tab.3 Detection of combined indexes in hepatitis patients

組合指標

  Comlined inderes

急性肝炎(42例)

  Acute hepatitis

  病例數(%)

  Case no.(%)

慢性肝炎

  Chronic hepatitis

肝硬化(56例)

  病例數(%)

  Case no.(%)

輕型(38例)

  Mild type

  病例數(%)

  Case no.(%)

中型(34例)

  Moderate type

  病例數(%)

  Case no.(%)

重型(48例)

  Severe type

  病例數(%)

  Case no.(%)

HA+LN+Ⅳ-C+PCⅢ+PLD 2(4.8)

4(10.53)

32(94.12)

46(95.80)

54(96.43)

HA+LN+Ⅳ-C+PCⅢ 2(4.8) 3(8.33) 31(91.18) 44(91.66) 51(91.07)
HA+Ⅳ-C+LN 1(2.4) 2(5.26) 22(64.71) 36(75.00) 40(71.43)
HA+LN+PCⅢ 2(4.8) 4(10.53) 20(58.82) 33(68.75) 39(69.64)
HA+Ⅳ-C+PLD 1(2.4) 3(7.89) 31(91.18) 45(93.75) 52(92.86)

  ①與LA+LN+Ⅳ-C+PCⅢ+PLD組比較, P<0.05

  Compared with LA+LN+Ⅳ-C+PCⅢ+PLD, P<0.05

  國內李兵順等通過肝組織活檢對照,認為HA+LN+PCⅢ聯合檢測,可以減少臨床對慢性肝病診斷的誤診和漏診率[4],李漫松等也作出HA+Ⅳ-C+LN的聯合檢測報告[5]。我們采用包括上述各項指標在內的五項指標聯合檢測,顯示五項指標聯合檢測對慢性肝纖維化臨床診斷符合率優于任何四項指標以下的不同組合,平均陽性率高達95.43%,與較具優勢的HA+Ⅳ-C+LN和HA+LN+PCⅢ兩組相比,差異有顯著性。其次,HA+LN+Ⅳ-C+PCⅢ和HA+Ⅳ-C+PLD聯合檢測的陽性率較高,分別為92%和91.3%。故認為五項聯合檢測可極大程度的提高慢性肝炎肝纖維化診斷的可靠性和準確性,如條件所限,選用HA+LN+Ⅳ-C+PCⅢ或HA+Ⅳ-C+LN聯合,也能獲得良好效果。

  參考文獻

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  3 葉紅軍,汁秀生,馮雪梅,等.血清Ⅲ型前膠原建立放免法診斷肝纖維化.臨床肝臟病雜志,1993,9:90-92.

  4 李兵順,王健,劉金星,等.聯合檢測血清PCⅢ、HA、LN對肝纖維化的診斷價值.中華傳染病雜志,1998,5:85-87.

  5 李漫松,劉新民,遲寶榮,等.血清Ⅳ型前膠原、透明質酸及板層素對肝纖維化診斷價值.臨床肝膽病雜志,1998,8:171-173.

  6 胡大榮,李夢東,陳國致,等.血漿脯肽酶活性測定在肝病診斷中的意義.臨床肝膽病雜志,1992,8:59.

  7 周國平,葛其童,黃育清,等.病毒性肝炎患者血清Ⅲ型前膠原檢測的臨床意義.臨床薈萃,1995,20:953-954.


日期:2009年2月21日 - 來自[檢驗醫學]欄目
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