主題:PI

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醫科院召開PI年中匯報評估會

    上海交通大學醫學科學研究院PI年中匯報評估會于6月30日上午在西院圖書館底樓演講廳召開,此次評估會采取了PI口頭匯報、PI互評的方式進行考核,同時邀請了“985”創新工程監理湯雪明教授、周光炎教授作為專家進行點評,醫科院資助培養的青年教師也參加了評估會。醫科院通過此次PI年中匯報評估會旨在對前一階段醫科院各課題組的工作進行全面的考核評估并由此評價醫科院成立及PI制實施以來對醫學院整體科研氛圍、科研水平的影響和實效。
    14位PI依次就所在課題組研究進展、近期取得的成果、青年教師及研究生培養情況、存在的問題和困難等方面進行了詳盡的總結匯報。通過近一年的建設,醫科院各課題組的運作已逐步成熟健全并初顯成效。部分課題組通過近期的努力工作已在具有較高影響力的國際雜志上發表論文,培養的青年教師科研能力也得到了很大提升,開始獨立承擔國家級及部委級項目;同時也有PI反映目前儀器設備欠完善、科研人員不足的問題,需要醫科院乃至學校層面上更大的支持與幫助。由此可以看出,醫科院確實營造出了一種前所未有的良好科研氛圍和環境,激發了廣大教師的科研熱情,創造了一個有利于科研產出、人才培養的良性循環機制。           

日期:2008年7月2日 - 來自[上海交通大學醫學院]欄目

流式細胞儀檢測細胞凋亡——Annexin V/PI雙染色法

  基本原理

  細胞凋亡早期改變發生在細胞膜表面,目前早期識別仍有困難。這些細胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸(PS)從細胞膜內轉移到細胞膜外,使PS暴露在細胞膜外表面。PS是一種帶負電荷的磷脂,正常主要存在于細胞膜的內面,在細胞發生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細胞膜外。Annexin V是一種Ca+依賴的磷脂結合蛋白,最初發現是一種具有很強的抗凝血特性的血管蛋白,Annexin V具有易于結合到磷脂類如PS的特性。對PS有高度的親和性。因此,該蛋白可充當一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的PS。PS轉移到細胞膜外不是凋亡所獨特的,也可發生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的,而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就破壞了。因此,可以建立一種用Annexin V結合在細胞膜表面作為凋亡的指示并結合一種染料排除試驗以檢測細胞膜的完整性的檢測方法。

  試劑與儀器

   孵育緩沖液:10mmol/L HEPES/NaOH,PH 7.4,140mmol/L NaCl,5mmol/L CaCl2

   標記液:將FITC- Annexin V(寶靈曼公司產品)和PI加入到孵育緩沖液中,終濃度均為1ug/ml

   流式細胞儀

  實驗步驟

  1. 細胞收集:懸浮細胞直接收集到10ml的離心管中,每樣本細胞數為(1~5)×106,/mL 500~1000r/min離心5min,棄去培養液。

  2. 用孵育緩沖液洗滌1次,500~1000r/min離心5min。

  3. 用100ul的標記溶液重懸細胞,室溫下避光孵育10~15min。

  4. 500~1000r/min離心5min沉淀細胞孵育緩沖液洗1次。

  5. 加入熒光(SA-FLOUS)溶液4℃下孵育20min,避光并不時振動。

  6. 流式細胞儀分析:流式細胞儀激發光波長用488nm,用一波長為515nm的通帶濾器檢測FITC熒光,另一波長大于560nm的濾器檢測PI。

  7. 結果判斷:凋亡細胞對所有用于細胞活性鑒定的染料如PI有抗染性,壞死細胞則不能。細胞膜有損傷的細胞的DNA可被PI著染產生紅色熒光,而細胞膜保持完好的細胞則不會有紅色熒光產生。因此,在細胞凋亡的早期PI不會著染而沒有紅色熒光信號。正常活細胞與此相似。在雙變量流式細胞儀的散點圖上,左下象限顯示活細胞,為(FITC-/PI-);右上象限是非活細胞,即壞死細胞,為(FITC+/PI+);而右下象限為凋亡細胞,顯現(FITC+/PI-)。

日期:2007年9月25日 - 來自[細胞學技術]欄目

流式細胞儀檢測細胞凋亡——Heochst 33342/PI雙染色法

  基本原理

  經固定的凋亡細胞其染色體熒光染料的DNA可染性性下降。細胞一經固定就不再是活細胞,而且細胞固定過程對細胞膜的通透性也有影響。因此發展了用“細胞活性”鑒定染料染色的流式細胞儀檢測方法。這些方法細胞不經固定就直接用DNA染料染色,且染料的濃度要比固定細胞所用的濃度要低得多。流式細胞儀通常根據細胞膜完整性將細胞分為“活細胞”和“死細胞”,因此正常細胞和凋亡細胞歸為活細胞。活細胞染料如Hoechst 33342能少許進入正常細胞膜而對細胞沒有太大得細胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡細胞中的熒光強度要比正常細胞中要高,Hoechst 33342在凋亡細胞中的熒光強度增高的機制與凋亡細胞膜通透性發生改變有關,凋亡細胞早期細胞膜的完整性沒有明顯性改變,但細胞膜的通透性已有增強,因此進入凋亡細胞中的Hoechst 33342比正常細胞的多。此外,還與凋亡細胞的染色體DNA的結構發生了改變從而使該染料能更有效地與DNA結合以及凋亡細胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到損傷不能有效地將Hoechst 33342排出到細胞外使之在細胞內積累增加等有關。既然Hoechst 33342進入凋亡細胞中比正常細胞更容易,而EB、PI或7-AAD等染料是不能進入細胞膜完整的活細胞中,即正常細胞和凋亡細胞在不經固定的情況下對這些染料是拒染,壞死細胞由于膜完整性在早期即已破損,可被這些染料染色。根據這些特性,用Hoechst 33342結合PI或EB等染料對凋亡細胞進行雙染色,就可在流式細胞儀上將正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞區別開來。在雙變量流式細胞儀的散點圖上,這三群細胞表現分別為:正常細胞為低藍色/低紅色(Hoechst 33342+/PI+),凋亡細胞為高藍色/低紅色(Hoechst 33342++/PI+),壞死細胞為低藍色/高紅色(Hoechst 33342+/PI++)。

  試劑與儀器

   Heochst 33342 染液:用PBS配成10ug/ml的儲存液濃度,4℃避光保存;

   PI染液 :用PBS配成5ug/ml濃度,4℃避光保存。

   400目的篩網

   流式細胞儀

  實驗步驟

  1. 懸浮生長的細胞在培養的狀態下加入Heochst 33342 ,終濃度為1ug/ml; 37℃孵育7—10min。

  2. 低溫500 ~ 1000r/min離心5min棄去染液。

  3. 加入1.0ml PI染液,4℃避光染色15min。

  4. 400目的篩網過濾1次。

  5. 流式細胞儀分析:Heochst 33342用氪激光激發的紫外線熒光,激發光波波長為352nm,發射光波波長為400 ~ 500nm,產生蘭色熒光;PI用氬離子激光激發熒光,激發光波波長為488nm,發射光波波長大于630nm,產生紅色熒光。分析蘭色熒光對紅色熒光的散點圖或地形圖。

  6. 結果判斷:在蘭色熒光對紅色熒光的散點圖上,結果為:正常細胞為低藍光/低紅光,凋亡細胞為高藍光/低紅光,壞死細胞為低藍光/高紅光。

  注意事項

  1. 在紅色熒光對蘭色熒光散點圖上,還可見到細胞凋亡區向細胞壞死區遷移的軌跡,可能是凋亡細胞的DNA進一步降解的緣故。

  2. 用Heochst 33342染料與細胞孵育的時間不宜過長,一般控制在20min之內為宜。如果太長可引起Heochst 33342的發射光譜由藍光向紅光的遷移,導致紅色熒光與蘭色熒光的比例改變,從而影響結果的判斷。

日期:2007年9月25日 - 來自[細胞學技術]欄目

流式細胞儀檢測細胞凋亡——PI單染色法

  基本原理

  其原理主要是根據細胞凋亡時在細胞、亞細胞和分子水平上所發生的特征性改變。這些改變包括細胞核的改變、細胞器的改變、細胞膜成分的改變和細胞形態的改變等,其中細胞核的改變最具特征性,主要包括以下幾個方面:

  1. 細胞核的改變:由于凋亡細胞核的改變,造成各種染色體熒光染料對凋亡細胞DNA可染性發生改變。研究表明,用各種染色體熒光染料對經固定的凋亡細胞進行染色,其DNA可染性降低。許多學者把這種DNA可染性的降低認為是凋亡細胞的標志之一。

  2. 光散射特性:凋亡細胞形態上的改變影響它們的光散射特性。在流式細胞儀上,前散射光與細胞的大小有關,而側散射光反映的是光在細胞內的折射作用,與細胞內的顆粒多少有關。在細胞凋亡時,細胞固縮,體積變小,故前散射光降低,這一特性往往被認為是凋亡細胞的特點之一。此外細胞凋亡時由于染色體降解,核破裂形成,細胞內顆粒往往增多,故凋亡細胞側散射光常增加。細胞壞死時,由于細胞腫脹,其前散射光增大;側散射光在細胞壞死時也增大,因此可根據前散射光和側散射光區別凋亡細胞和壞死細胞。但需要注意的是,根據前散射光和側散射光判斷凋亡細胞的可靠性受被檢測細胞形態上的均一性和核胞漿比率影響很大。因此在某些淋巴細胞凋亡中,用光散射特性檢測凋亡的可靠性較好,而在腫瘤細胞凋亡中,其可靠性就較差。根據光散射特性檢測凋亡細胞最主要的優點是可以將光散射特性與細胞的表面免疫熒光分析結合起來,用以區別經這些特殊處理發生選擇性凋亡的淋巴細胞亞型。也可用于活細胞的分類。

  試劑與儀器

   PBS溶液;

   PI染液:將PI溶于PBS(pH7.4)中,終濃度為100ug/ml。用棕色瓶4℃避光保存。

   70%乙醇

   400目篩網

   流式細胞儀

  實驗步驟

  1. 收集細胞{數目約(1~ 5)×106個/mL},500 ~ 1000 r/min離心5min,棄去培養液。

  2. 3ml PBS洗滌1次。

  3. 離心去PBS,加入冰預冷的70%的乙醇固定,4℃,1—2小時。

  4. 離心棄去固定液,3mlPBS重懸5min。

  5. 400目的篩網過濾1次,500—1000r/min離心5min,棄去PBS。

  6. 用1ml PI染液染色,4℃避光30min。

  7. 流式細胞儀檢測:PI用氬離子激發熒光,激光光波波長為488nm,發射光波波長大于630nm,產生紅色熒光分析PI熒光強度的直方圖也可分析前散射光對側散射光的散點圖。

  8. 結果判斷:在前散射光對側散射光的散點圖或地形圖上,凋亡細胞與正常細胞相比,前散射光降低,而側散射光可高可低,與細胞的類型有關;在分析PI熒光的直方圖時,先用門技術排除成雙或聚集的細胞以及發微弱熒光的細胞碎片,在PI熒光的直方圖上,凋亡細胞在G1/G0期前出現一亞二倍體峰。如以G1/G0期所在位置的熒光強度為1.0,則一個典型的凋亡細胞樣本其亞二倍體峰的熒光強度為0.45,可用雞和鮭魚的紅細胞的PI熒光強度做參照標準,兩者分別為0.35和0.7,可以確保在兩者之間的不是細胞碎片而是完整的細胞。

  注意事項

  細胞凋亡時,其DNA可染性降低被認為是凋亡細胞的標志之一,但這種DNA可染性降低也可能是因為DNA含量的降低,或者是因為DNA結構的改變使其與染料結合的能力發生改變所致。在分析結果時應該注意。

日期:2007年9月25日 - 來自[細胞學技術]欄目

流式細胞計PI染色死細胞

  PI能夠插入雙鏈DNA中。它被活細胞排斥但能穿透正在死亡或已經死亡的細胞的細胞膜。

  Ⅰ、材料

  1、PI(e.g.,Cat #537059,Calbiochem,San Diego,CA)

  2、緩沖體系:1×PBS(Ca2+ and Mg2+ free,e.g.,Cat#9240,Irvine Scientific,Santa Ana,CA)+2%新鮮小牛血清+0.1%疊氮鈉

  A、PI緩沖液

  用緩沖液將PI溶解至終濃度為1mg/ml中,于4℃下密封避光保存1個月。

  B、PI濃縮液

  用緩沖液將PI溶解至終濃度為500mg/ml,于4℃下密封避光保存。我們已經檢測過將PI濃縮液放置數月后,并無觀察到染色活性的丟失。

  Ⅱ、方法:

  將樣品細胞按程序描述的方法用FITC標記的單克隆抗體進行單色染色。

  A、在最后的洗滌步驟后,將樣品細胞懸浮于PI緩沖液中,于4℃下密封避光保存以備通過流式細胞儀分析;

  B、在最后的洗滌步驟后,如前述將樣品細胞懸浮后備用。如果您想檢測樣品細胞活力,在每一管中加入2μl的PI濃縮液,混勻。將樣品置于4℃下密封避光保存以備流式細胞儀分析。

  注意:此法并不適用于甲醛固定的樣品。在根據Sasaki等人的方法(Cytometry 8:413,1987)用PE標記的抗體對樣品進行染色時可以適用此方法。然而,由于PI和PE的發射光譜的廣泛交迭,因此本方法適于用7-氨基-放線菌素D將死細胞加以區分。

日期:2007年9月25日 - 來自[細胞學技術]欄目

Annexin V/PI雙染色法

  1.細胞收集:懸浮細胞直接收集10ml的離心管中,而帖壁細胞先用滴管輕輕吹打,調亡細胞一經吹打可能脫壁,收集到10ml的離心管中,沒脫壁的細胞用0.02%的EDTA消化使之脫壁,每樣本細胞數為(1~5)×106,500~1000r/min離心5min棄去培養液。

  2.用孵育緩沖液洗1次,500~1000r/min離心5min。

  3.用100μl的標記溶液重懸細胞,室溫下避光孵育10~15min。

  4.500~1000r/min離心5min沉淀細胞,孵育緩沖液洗1次。

  5.加入熒光溶液4℃下孵育20min,避光并不時振動。

日期:2007年9月25日 - 來自[細胞學技術]欄目

Hoechst 33342/PI雙染色法

  1.懸浮生長的細胞在培養狀態下加入Heochst 33342,終濃度為1μg/ml;帖壁生長的細胞用含有0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化成單細胞懸液,離心,棄上清,用1ml全培養液重懸細胞,加入Heochst 33342,終濃度為1μg/ml,37℃孵育7~10min。

  2.4℃ 500~1000r/min離心棄去染液。

  3.加入1.0ml PI染液,4℃避光染色15min。

  4.400目的篩網過濾1次。

  5.流式細胞儀分析。

日期:2007年9月25日 - 來自[細胞學技術]欄目

固定細胞的PI單染色法

  方法一

  1.收集細胞(1~5)×106個,500~1000r/min離心5min,棄去培養液。

  2.3ml PBS洗一次。

  3.離心去PBS,加入冰預冷的70%的乙醇固定,4℃,1h。

  4.離心棄去固定液,3ml PBS重懸5min。

  5.400目的篩網過濾1次,500~1000r/min離心5min,棄去PBS。

  6.用1ml PI染液,4℃避光30min。

  7.流式細胞儀檢測:PI用氬離子激發熒光,激發光波波長為488nm,發射光波波長大于630nm,產生紅色熒光,可分析前散射光對側散射光的散點圖及PI熒光的直方圖。

  方法二

  1.收集細胞(1×106個),500~1000r/min離心5min,棄去培養液。

  2.1ml PBS/FCS洗一次。

  3.500~1000r/min離心5min去PBS/FCS,加入500μl PBS/FCS和500μl的多聚甲醛固定液,輕輕混勻,在4℃下固定4min。

  4.500~1000r/min離心5min棄去固定液,室溫加入含0.2% Tween的PBS 1ml,37℃孵育15min。

  5.1ml PBS/FCS洗3次,每次5min。

  6.400目的篩網過濾1次。

  7.500~1000r/min離心5min去PBS/FCS,用1.0ml PI染液,4℃避光至少30min。染色在24h之內皆可行,流式細胞儀分析。

日期:2007年9月25日 - 來自[細胞學技術]欄目
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