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Nature推薦中山大學腫瘤學PI新成果

2007年自然出版集團宣布《Nature》出版集團的新出版物、名為Nature  China的網站(www.naturechina.com.cn)正式啟動。這一網站致力于聚焦中國大陸地區和香港的優秀科學成果,每周都會針對最新發表的論文,在此網站撰寫摘要和評述。
來自中山大學腫瘤防治中心,中國南方國家重點腫瘤實驗室的研究人員發現Bmi-1在促進鼻咽癌侵入中的重要機制。這對于研究鼻咽癌作用機制具有重要的意義。這一研究成果公布在《JCI》雜志上。
領導這一研究的是國家重點實驗室PI曾木圣博士,其早年畢業于江西醫學院撫州分院,1998年獲得中山大學博士學位,曾美國田納西州立大學,美國波士頓塔夫茨大學—新英格蘭醫學中心腫瘤生物學實驗室從事乳腺癌發病機理、診斷及預后指標的研究。
Polycomb  Group  (PcG)蛋白家族是一類進化上極為保守的轉錄抑制因子,它們通過形成三種不同的蛋白復合物調控眾多重要生命活動。之前的研究表明PcG蛋白Bmi-1表達水平升高,會導致鼻咽癌的侵入,但是其中的機制至今科學家們還是不清楚。
在這篇文章中,曾木圣博士領導的研究小組解開了這個謎團,他們發現了Bmi-1在促進鼻咽癌侵入中的重要機制。
研究人員通過人類鼻咽上皮細胞NPECs對Bmi-1進行研究分析,他們發現Bmi-1的過表達會啟動上皮間質轉化(mesenchymal  transition  ,EMT),增加NPECs的移動性,而前者正是癌癥侵入的一個關鍵性細胞過程,因此敲除內源性Bmi-1能逆轉EMT,降低NPECs的移動性。
進一步的研究還發現,Bmi-1增多會提高Snail因子的穩定性——這是與EMT有關的轉錄抑制因子,并且還會引起腫瘤抑制因子PTEN的減少。這些研究結果解釋了為什么在Bmi-1表達和Bmi-1所在處鼻咽癌侵入之間存在密切的相關性。
有趣的是,研究人員發現PTEN的敲除會部分抑制鼻咽癌的侵入,這說明PTEN也許是Bmi-1誘導EMT過程中的一個重要介導因子。
曾木圣博士回國后組建腫瘤病毒學和腫瘤分子標志研究組,首次完成NPC相關EBV全序列分析,發現NPC相關的EBV序列特征;研究結果對于鑒定鼻咽癌相關的EB病毒亞型,闡明EB病毒的致癌機制,提供鼻咽癌診斷和治療的新靶點具有重要意義。發現EBV-LMP2A通過誘導上皮間質轉化和腫瘤啟動細胞群體參與NPC發生發展的新機制;發現EBV可以誘導原癌基因Bmi-1的表達,闡明Bmi-1在鼻咽上皮細胞早期轉化和NPC侵襲和轉移中的作用,揭示PTEN/PI3K/Akt/Snail通路介導Bmi-1誘導上皮間質轉化和腫瘤轉移的新機制;并建立首個單一原癌基因誘導的鼻咽上皮細胞永生化模型和EBV高效感染上皮細胞的體外模型。
(生物通:萬紋)
日期:2009年12月13日 - 來自[腫瘤相關]欄目

AnnexinV/PI、TdT和PI法檢測細胞凋亡的比較

AnnexinV/PI、TdT和PI法檢測細胞凋亡的比較

中華微生物學和免疫學雜志 2000年第4期第20卷 檢測技術

作者:黃健 沈永生 周宏平 鄭俊年 王秀英

單位:江蘇,徐州醫學院附屬醫院中心實驗室

  檢測細胞凋亡(APO)常用的有PI(碘化丙啶, propidium iodide)染色DNA的測定法和TdT(末端脫氧核苷轉移酶, terminal deoxynucleotidyl transferase)法。AV(磷酯酰絲氨酸結合蛋白, Annexin)法是近年來提出的一種新方法。我們采用AV聯合應用PI雙參數法檢測由地塞米松誘導小鼠胸腺產生凋亡細胞的百分率,并與上述二種方法作比較,以探討其應用價值。

    表1 3種方法檢測凋亡細胞比率的結果(%,

  例數 PI法 TdT法 AV法
凋亡 壞死 死亡
對照組  2 0

1.24± 0.74

13.12±1.53

1.45±0.58

15.03±0.72

凋亡組 10 27.19±7.10* 50.10±13.20** 32.28±7.02*** 13.25±5.53 45.62±10.38****

  注:1. 死亡=凋亡+壞死; 2. 均為配對t檢驗; 3. *與**相比較:P<0.01; **與***相比較: P<0.01; *與***相比較:P<0.01 ; **與****相比較:P>0.05

  材料和方法

  試劑:AV試劑盒,法國國際免疫公司產品,內含PI染液(250μg/ml)。TdT試劑盒,德國Boehringer Mannheim公司產品。自配檢測DNA含量的PI(50μg/ml)染料。

  流式細胞儀:FACS Calibur(美國BD公司)。

  標本處理:取10只小鼠,分別于腹腔注射地塞米松25mg/kg,另取2只注射等量生理鹽水作對照。10h后處死小鼠,開胸取胸腺,常規制備細胞懸液,調整細胞濃度為106/ml備用。

  實驗方法

  AV法測定:取106個上述細胞用PBS洗滌、離心(2000r/5min)、去上清后按試劑說明操作。

  DNA含量測定:取106個細胞加入PI染液1ml放冰箱30min待測。

  TdT測定法:取106個細胞用1%的多聚甲醛冰浴固定15min,離心去上清,70%冷乙醇固定24h,然后按試劑說明書操作。

  FCM檢測:3種方法染色的標本分別上機檢測,每次獲取30000個細胞,保存數據后用Cell Quest軟件進行分析。

  結果與討論

  本實驗3種方法檢測小鼠胸腺細胞凋亡的結果見表1。流式細胞術檢測細胞凋亡最早使用的是PI法,其結果是在正常的G0/G1峰之前有一亞二倍體峰。凡DNA含量小于二倍體的細胞均被認為是凋亡細胞。但Cohen等在實驗中發現典型的凋亡形態并不一定伴有核小體間DNA降解及斷裂〔1,2〕。此外,鄭澤銑等利用雙激光雙染色法證實了亞二倍體并不一定是凋亡細胞。因此利用PI法檢測凋亡可能有很大的錯檢或漏檢。本文結果也證實,PI法敏感性低、特異性差,故不適宜定量檢測細胞凋亡。

  TdT法是利用其介導熒光素標記的dUTP摻入到降解后DNA片段的3′羥基末端,根據摻入的熒光強度可定量細胞的凋亡率。據Mundle等報道,早期凋亡細胞易被TdT介導的dUTP標記,但是壞死期的細胞由于內源性核酸內切酶和蛋白酶的作用,DNA被切割為大小不等的片段,此時也會出現TdT法假陽性〔3〕。本文TdT法的陽性率顯著高于其它2組,表明其敏感性較高。它與AV法中死亡(凋亡+壞死)率之間差異無顯著性,進一步提示TdT法的凋亡陽性率實際反映了細胞凋亡與壞死的總和,顯示其特異性較差。王振義、陳竺等也證實DNA裂解并非凋亡所特有,因此,TdT法對凋亡的檢測只能是選擇性的,而不是特異性的。

  對APO的進一步研究表明,各種細胞受到誘導后產生凋亡的初期,均會出現膜內外層面磷酯酰絲氨酸(PS)重新分布,即膜內表面的PS發生不可逆轉的外露,其明顯地早于核內DNA固縮、變性、裂解〔4〕,檢測外表面的PS,可了解凋亡的早期狀況。Annexin-V與PS有較強的親和力,具有鈣依賴性。由于壞死細胞的PS也有外露現象,因此單純利用熒光素標記的Annexin-V無法區分凋亡和壞死。必須聯合應用可以進入破損細胞膜內與降解DNA結合的PI法,才能區分凋亡與壞死。本法根據膜的完整與否及PS的分布情況,可將待測細胞分為3群。AnnexinV-/PI-區活細胞、AnnexinV+/PI+區的繼發性壞死細胞,AV和PI均高染、AnnexinV+/PI-區的凋亡細胞群,AV的熒光強度高但PI強度低。其次,已有研究表明,小鼠胸腺細胞可自發產生凋亡。本實驗顯示PI結果為0,TdT法僅為1.24%,而AV法為13.12%。因此可說明AV法較其它方法敏感。此外,本法不需對細胞進行固定,從而可以去除其它方法因對細胞進行固定而造成的碎片增多或DNA片段丟失的不良影響。AV法試劑的價格適中,較宜進行大批量科研標本檢測。

  綜上所述,不同方法定量APO的結果存在顯著差異。AV法能檢測早期的凋亡,可正確區分凋亡和壞死,實驗中不需固定細胞,影響因素較少。因此,利用流式細胞術檢測APO時,宜首選AnnexinV/PI雙參數法。

參考文獻

  1,Oberhammer F, Wilson JW, Dive C, et al. Apoptosis death in epithelial cell: cleavage of the absence of internucleosomal fragmentation. Embo J, 1993, 12:3679-3684.

  2,Cohen GM, Sun XM, Snowden RT, et al. Key morphologocal features of apoptosis may occur in the absence of internucleosomal DNA fragmentation. Biochem J, 1992, 286:331-334.

  3,Mundle SD, Raza A. The two in situ techniques do not differentiate between apoptosis and necrosis but rather reveal distinct patterns of DNA fragmentation in apoptosis. Lab Invest, 1995, 72:611-613.

  4,Vermes I, Haanen C, Reutelingsperger CPM. A novel assay for apoptosis: Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptoic cells using fluorescein labelled annexin V. J Immunol Methods, 1995, 180:39-51

(收稿日期:1999-07-12)


日期:2009年2月21日 - 來自[檢驗醫學]欄目

同種異體腎移植患者腎臟動脈阻力指數和搏動指數對移植腎功能的預測作用

【摘要】  目的 運用彩色多普勒超聲早期測量腎動脈和葉間動脈的阻力指數(RI)和搏動指數(PI),觀察兩者能否預測無明顯并發癥同種異體腎移植患者術后1年的腎功能。方法 在100例無并發癥腎移植患者中,應用彩色多普勒超聲,于腎移植術后1周內,測量移植腎腎動脈和葉間動脈的阻力指數和搏動指數,并與術后1年的移植腎腎小球濾過率(GFR)進行相關分析。結果 術后1周測得的腎動脈的RI和PI與術后1年的GFR無明顯的相關關系;葉間動脈的RI和PI與術后1年的GFR呈明顯的負相關,葉間動脈RI和(或)PI升高,移植后1年腎功能下降,如果葉間動脈RI≥0.7或者PI≥1.2,移植后1年腎功能有明顯的下降。結論 早期多普勒彩超測量葉間動脈的RI和PI能夠預測無明顯并發癥的移植腎的長期存活率。

【關鍵詞】  超聲檢查


    Prediction of renal function for renal allograft recipients with early renal artery resistance index and pulsatile index

    WANG Li,WANG Hua-wei.PLA 456 Hospital,Jinan 250031,China

    [Abstract]  Objective  We measured resistance index (RI) and pulsatile index (PI) of main renal artery and interlobar artery to detect whether they can predict 1 year allograft function in noncomplicated renal transplantation recipients.Methods  RI and PI of main renal artery and interlobar artery were obtained by color Doppler ultrasonography within the first week of transplantation.Then they were correlated with allograft glumerular filtration rate (GFR) at 1 year.Results  There was no correlation between RI and PI of main renal artery and GFR at 1 year;There was a negative correlation between RI and PI of interlobar artery and GFR at 1 year.Patients with impaired allograft function had higher RI and PI values.There was a significant decline in allograft function among cases with either RI≥0.7 or PI≥1.2.Conclusion  RI and PI of interlobar artery measured by Doppler ultrasonography can be used to predict the long term outcome of noncomplicated renal transplantation.

    [Key words]  ultrasonography,color,Doppler;kidney transplantation;resistance index;pulstile index;renal function

    對于終末期腎病患者,腎移植是首選的治療方法,影響移植腎存活的因素有很多,如受者的年齡、種族、有無糖尿病、HLA不匹配、急性排異等[1]。腎移植術后一年的腎功能也是預示移植腎長期存活的一個重要因素[2],但目前尚無簡便可信的方法早期預測腎移植術后一年的腎功能。彩色多普勒超聲對移植腎的隨訪非常重要,能夠診斷移植腎血管樹的疾病或并發癥。移植術后1周內葉間動脈阻力指數(RI)和搏動指數(PI)與移植腎的病理改變密切相關,結合臨床資料對于移植術后處理有很大幫助[3]。本研究設想早期測量移植腎腎動脈和葉間動脈的RI及PI,觀察其與移植術后1年的腎功能的相關關系,討論能否用移植腎腎動脈或葉間動脈的RI或PI來預測移植術后1年的腎功能。

    1  資料與方法

    1.1  一般資料  對我院2001~2003年首次行腎移植的患者進行了回顧性研究,除外有急性腎小管壞死、急性排異、環孢素A中毒、全身性感染、尿蛋白>1 g/24 h、移植腎動脈狹窄等移植腎并發癥的患者,有高血壓、糖尿病史或吸煙的患者也排除在外。所選的100例患者均滿足以下條件:(1)術后1年進行了肌酐清除率的測定;(2)術后1周對移植腎進行了彩色多普勒彩超檢查;(3)沒有以上提及的并發癥。患者的年齡、性別、身高、體重、原發腎臟病、收縮/舒張壓以及用藥情況等資料均由病歷中獲取。

    1.2  腎小球濾過率的計算  統計患者血壓、血常規、尿常規、24 h尿蛋白定量、肝功能、腎功能各指標數值,根據MDRD公式計算腎小球濾過率(GFR)。GFR(ml/min)=170×血肌酐(mg/dl)-0.999×(年齡/0.357)-0.176×血尿素氮(mg/dl)-0.170×血白蛋白(g/dl)-0.318×0.762(女性)[4]。術后1年GFR較術后1周下降>10%為GFR明顯下降。

    1.3  移植腎彩色多普勒彩超檢查  應用HDL-5000彩色多普勒超聲診斷儀,3.5 MHz探頭,患者仰臥位,分別顯示移植腎腎動脈和葉間動脈頻譜,并自動計算RI和PI(圖1)。所有檢查由同一醫師操作,儀器的設置對所有受試者保持不變。

    1.4  統計學方法  相關分析采用線性回歸分析,計量資料的比較采用t檢驗,計數資料的比較采用方差分析。以P<0.05為差異具有統計學意義。

    2  結果

    2.1  腎移植術后1周腎動脈和葉間動脈的RI及PI與術后1年的GFR的相關關系  移植腎術后1周腎動脈的RI和PI分別為0.78±0.12和1.55±0.48,葉間動脈的RI和PI分別為0.67±0.15和1.32±0.48,術后1周的GFR均在正常范圍,平均為(105±28)ml/min,術后1年的GFR為(98±25)ml/min,術后1周的血肌酐值為(103±18)μmol/L,1年后的血肌酐值為(106±22)μmol/L,腎動脈的RI和PI與1年后的GFR無明顯的相關關系,葉間動脈的RI和PI與一年后的GFR呈明顯的負相關(RI:r=-0.502,P<0.01;PI:r=-0.456,P<0.01)。血肌酐與腎動脈和葉間動脈的RI及PI均無明顯的相關關系,見圖2、圖3。

    2.2  1年后腎功能明顯下降與未明顯下降患者的結果比較  100例患者中,31例患者的GFR較術后1周有明顯的下降,其葉間動脈的RI和PI值也較高,尤以RI≥0.7或者PI≥1.2為多,分別占腎功能明顯下降者的71%和64.5%,與腎功能未明顯下降患者比較,其所占比例明顯升高。見表1。圖2  葉間動脈RI與術后1年GFR的關系  表1  一年后腎功能明顯下降與未明顯下降患者的結果比較

    2.3  RI=0.7、PI=1.2為界分組后各組的腎功能比較  以RI=0.7為界,將患者分為兩組,RI≥0.7者術后1年的GFR較RI<0.7者為低,雖然術后1周內兩組的GFR相似。以PI=1.2為界,將患者分為兩組,PI≥1.2者術后1年的GFR較PI<1.2者為低,見表2。RI≥0.7或PI≥1.2的患者其1年后的GFR有明顯的下降。表2  根據RI、PI分組后各組的腎功能比較注:術后1年的GFR與術后1周的GFR相差顯著(*P<0.05);RI<0.7組術后1年的GFR與RI≥0.7組相差顯著(**P<0.05);PI<1.2組術后1年的GFR與PI≥1.2組相差顯著(△P<0.05)

    3  討論

    近來的研究提示腎移植術后6個月和1年的腎功能與移植腎的長期存活相關[5],進而有學者對大量的腎移植患者進行分析發現,術后1年的腎功能差(血肌酐>1.5 mg/dl)與移植腎長期存活率低有關[2]。因此,腎移植術后1年的腎功能是預示移植腎長期存活的重要因素之一。

    目前還沒有用于預測腎移植術后1年的腎功能的早期指標,移植腎內葉間動脈的RI與移植腎的病理改變有關[3],可以用來判斷移植腎的腎功能。以往有學者研究移植腎葉間動脈RI和PI與移植腎功能的關系,并且發現移植腎葉間動脈RI和PI與移植腎功能沒有明顯的相關關系,不能用來預測移植腎的腎功能[6]。本研究通過觀察腎移植術后早期測量的腎動脈和葉間動脈的RI及PI與術后1年的腎功能的相關關系,討論能否用移植腎腎動脈或葉間動脈的RI或PI來預測移植術后1年的腎功能。結果發現:移植腎腎動脈的RI和PI與1年后的GFR無明顯的相關關系,葉間動脈的RI和PI與1年后的GFR呈明顯的負相關;葉間動脈RI≥0.7或 PI≥1.2的患者所占的比例在1年后腎功能明顯下降患者中明顯高于腎功能未明顯下降者;以RI=0.7和PI=1.2為界,將患者進行分組,RI≥0.7者術后1年的GFR較RI<0.7者為低, PI≥1.2者術后1年的GFR較PI<1.2者為低。說明術后1周葉間動脈RI和PI是預測術后1年移植腎功能的一個有用指標。移植腎腎動脈RI和PI的測量可能由于受髂血管血流的影響較大,故不能用于預測術后1年移植腎功能。

    本研究的結果與以往研究的結果不同,可能的原因是以往研究選擇的病例中有些病例伴有急性腎小管壞死、急性腎排異及環孢素中毒等并發癥[6],而這些并發癥均可以引起腎功能的下降,對實驗結果產生影響。本研究排除了以上并發癥,并且將可能影響腎功能的高血壓、糖尿病等因素也排除在外。保證了實驗不受以上因素的影響,得出的結果更為可信。

    運用彩色多普勒超聲早期測量移植腎葉間動脈的RI和PI,可以預測移植腎的長期存活率,為臨床治療提供幫助。

 

【參考文獻】
  1 Cardinal H, Hebert MJ, Rahme E, et al. Modifiable factors predicting patient survival in elderly kidney transplant recipients. Kidney Int,2005,68(1):345-351.

2 Hariharan S, McBride MA, Cherikh WS, et al. Post-transplant renal function in the first year predicts long-term kidney transplant survival.Kidney Int,2002 ,62(1):311-318.

3 Jakobsen JA, Brabrand K, Egge TS,et al.Doppler examination of the allografted kidney. Acta Radiol,2003 ,44(1):3-12.

4 Fick-Brosnahan GM, Belz MM, McFann KK, et al. Relationship between renal volume growth and renal function in autosomal dominant polycystic kidney disease: a longitudinal study. Am J Kidney Dis, 2002,39:1127-1134.

5 International Neoral Renal Transplantation Study Group. Cyclosporine microemulsion (Neoral) absorption profiling and sparse-sample predictors during the first 3 months after renal transplantation. Am J Transplant,2002,2(2):148-156.

6 Chiang YJ, Chu SH, Chuang CK, et al. Resistive index cannot predict transplant kidney function.Transplant Proc,2003,35(1):94-95.


作者單位:250031 山東濟南,解放軍第456醫院特檢科

日期:2008年12月27日 - 來自[2008年第5卷第5期]欄目

楊福愉院士:單一的PI制有局限性

“目前國家對科學界提出了兩大目標:面向國家需求、面向世界前沿,而PI制這種小分隊的形式,在規模上難以滿足這兩個‘面向’的重大目標。”
  
在不久前召開的兩院院士大會上,不少院士提出,隨著我國科學技術的迅速發展,一些前階段采取的科研形式,特別是目前在國內廣泛實施的PI(課題組長,Principal  Investigator)制,在面對國家對科學界提出的更高要求時,開始顯示出了一定的局限性。他們表示,這種相對分散的科研組織形式,在集中力量組織大項目攻關和重大問題的基礎研究方面存在不利因素。
  
7月18日至19日,中科院生物物理研究所在煙臺召開了生物大分子國家重點實驗室發展戰略研討會,為進一步凝練實驗室研究方向、探索更符合我國科技發展要求的科研形式,進行了深入的研討和積極的籌劃。
  
生物物理所所長、生物大分子國家重點實驗室主任徐濤在接受記者采訪時,對國內目前的科研形式作出了這樣的評價——PI制的實施是當時的時代要求,在這些年里很好地調動了科研人員的積極性,使得我國科研水平和國際影響力在較短時間內得到迅速提升。可以說,PI制在我國科技發展史上功不可沒,而且在相當一段時期是一種重要的科研組織模式。但是隨著科技水平的發展,科學界面臨著更高的要求和目標,這種“包產到戶”式的科研形式也亟須作出相應的調整。
  
中國科學院院士楊福愉說,“目前國家對科學界提出了兩大目標:面向國家需求、面向世界前沿,而PI制這種小分隊的形式,在規模上難以滿足這兩個‘面向’的重大目標。”
  
因此,如何把課題組凝聚在一起、發揮團隊作用,是未來科技界在科研形式上進行探索與嘗試的一個重要方向。
  
2008年3月,科技部、財政部設立國家重點實驗室專項經費,先期下達開放運行和自主選題研究經費14億元。專項經費的主要支持原則是突出投入重點、穩定長效支持。徐濤說,以這種投入為支撐,科研人員下一步要認真探討、解決的是兩方面問題:一個是做什么,也就是要確定目標,凝練真正有價值的科研攻關方向;另一個就是以什么形式做的問題。
  
“做什么”和“怎么做”,正是生物大分子國家重點實驗室發展戰略研討會最主要的內容,也是對生物物理所正在籌建的蛋白質科學國家實驗室未來發展的一種探索和思考。
  
7月18日,徐濤在《實驗室發展戰略思考》報告中分析認為,目前人口、健康、能源是全球共同面臨的關鍵問題。未來全球老齡化問題將更加突出,我國人口老齡化的數量與速度均高居世界榜首。在健康方面,慢性病的問題表現得尤為突出,到2015年,我國因慢性病造成的經濟損失將達到5500億美元,此外未來社會還將越來越多地面對心理疾病、新生疾病和傳染病的威脅。在能源問題上,我國將面臨越來越嚴重的能源缺口和減排壓力。
  
針對上述社會經濟發展的需求,結合生物大分子國家重點實驗室的科研優勢和蛋白質科學國家實驗室的建設目標,為期兩天的研討會對生物能源、慢性病防治、傳染病防治、認知與精神健康、創新藥物、再生醫學等領域進行了深入研討,并具體提出了其中包含的諸多科學問題。而這些問題的解決,不是單個PI可以完成的,要求集中力量進行長期攻關。近10位PI圍繞這些方向和問題,結合已有的研究和合作基礎,進行了實驗室重要研究方向性項目的申請報告。這些申請報告與以往不同的是,PI們在報告項目的研究方向、目標、難題、方案的過程中,著重突出了其他學科領域的共同參與以完成更有影響力的目標的需求和意義,以及團隊攻關可能產生的更好的預期效果。
  
生物大分子國家重點實驗室名譽主任梁棟材院士、楊福愉院士,實驗室學術委員會主任王志珍院士等13位海內外專家對申報項目進行了認真評議。
  
評審專家們著重評議了項目是否具有團隊攻關的重要價值、必要性和可操作性,并針對一些項目如何實現多領域的交叉、協作提出了建議。經過項目評審,實驗室的研究方向更加明確了。
  
多個PI  協作團隊攻關的科研形式是一種即將開始的探索與嘗試。目前的科研體制、考評方式、支撐體系都是為適應PI  制而建立起來的,科研形式的調整意味著這些體制機制也面臨相應的調整。在研討會例行的圓桌會議上,十多位PI  根據目前的平臺建設、科研設施與資源共享等問題上存在的不利于團隊協作的缺陷,提出了改進的建議。
  
同時,很多PI  長時間以來也習慣了“單兵作戰”的方式,觀念和習慣的改變也不是一朝一夕可以完成的。正如楊福愉院士說的,團隊攻關對PI  們團隊精神、心胸氣度等品格方面的素養也提出了更高的要求。
  
徐濤說,PI  制從嘗試到成功推向全國經歷了一個相當長的時間,對它進行調整與變革也將是一個相當長的探索與完善的過程。這種戰略研討會是一個良好的開始,不僅僅要解決“做什么”和“怎么做”的問題,通過這種形式的交流,還可以發現目前存在的不足,并在今后的工作中逐步加以解決。(原題《從單一PI到團隊攻關:我們準備好了嗎?》,載于《科學時報》2008年7月23日)
日期:2008年7月25日 - 來自[技術要聞]欄目

醫科院召開PI年中匯報評估會

    上海交通大學醫學科學研究院PI年中匯報評估會于6月30日上午在西院圖書館底樓演講廳召開,此次評估會采取了PI口頭匯報、PI互評的方式進行考核,同時邀請了“985”創新工程監理湯雪明教授、周光炎教授作為專家進行點評,醫科院資助培養的青年教師也參加了評估會。醫科院通過此次PI年中匯報評估會旨在對前一階段醫科院各課題組的工作進行全面的考核評估并由此評價醫科院成立及PI制實施以來對醫學院整體科研氛圍、科研水平的影響和實效。
    14位PI依次就所在課題組研究進展、近期取得的成果、青年教師及研究生培養情況、存在的問題和困難等方面進行了詳盡的總結匯報。通過近一年的建設,醫科院各課題組的運作已逐步成熟健全并初顯成效。部分課題組通過近期的努力工作已在具有較高影響力的國際雜志上發表論文,培養的青年教師科研能力也得到了很大提升,開始獨立承擔國家級及部委級項目;同時也有PI反映目前儀器設備欠完善、科研人員不足的問題,需要醫科院乃至學校層面上更大的支持與幫助。由此可以看出,醫科院確實營造出了一種前所未有的良好科研氛圍和環境,激發了廣大教師的科研熱情,創造了一個有利于科研產出、人才培養的良性循環機制。           

日期:2008年7月2日 - 來自[上海交通大學醫學院]欄目

流式細胞儀檢測細胞凋亡——Annexin V/PI雙染色法

  基本原理

  細胞凋亡早期改變發生在細胞膜表面,目前早期識別仍有困難。這些細胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸(PS)從細胞膜內轉移到細胞膜外,使PS暴露在細胞膜外表面。PS是一種帶負電荷的磷脂,正常主要存在于細胞膜的內面,在細胞發生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細胞膜外。Annexin V是一種Ca+依賴的磷脂結合蛋白,最初發現是一種具有很強的抗凝血特性的血管蛋白,Annexin V具有易于結合到磷脂類如PS的特性。對PS有高度的親和性。因此,該蛋白可充當一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的PS。PS轉移到細胞膜外不是凋亡所獨特的,也可發生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的,而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就破壞了。因此,可以建立一種用Annexin V結合在細胞膜表面作為凋亡的指示并結合一種染料排除試驗以檢測細胞膜的完整性的檢測方法。

  試劑與儀器

   孵育緩沖液:10mmol/L HEPES/NaOH,PH 7.4,140mmol/L NaCl,5mmol/L CaCl2

   標記液:將FITC- Annexin V(寶靈曼公司產品)和PI加入到孵育緩沖液中,終濃度均為1ug/ml

   流式細胞儀

  實驗步驟

  1. 細胞收集:懸浮細胞直接收集到10ml的離心管中,每樣本細胞數為(1~5)×106,/mL 500~1000r/min離心5min,棄去培養液。

  2. 用孵育緩沖液洗滌1次,500~1000r/min離心5min。

  3. 用100ul的標記溶液重懸細胞,室溫下避光孵育10~15min。

  4. 500~1000r/min離心5min沉淀細胞孵育緩沖液洗1次。

  5. 加入熒光(SA-FLOUS)溶液4℃下孵育20min,避光并不時振動。

  6. 流式細胞儀分析:流式細胞儀激發光波長用488nm,用一波長為515nm的通帶濾器檢測FITC熒光,另一波長大于560nm的濾器檢測PI。

  7. 結果判斷:凋亡細胞對所有用于細胞活性鑒定的染料如PI有抗染性,壞死細胞則不能。細胞膜有損傷的細胞的DNA可被PI著染產生紅色熒光,而細胞膜保持完好的細胞則不會有紅色熒光產生。因此,在細胞凋亡的早期PI不會著染而沒有紅色熒光信號。正常活細胞與此相似。在雙變量流式細胞儀的散點圖上,左下象限顯示活細胞,為(FITC-/PI-);右上象限是非活細胞,即壞死細胞,為(FITC+/PI+);而右下象限為凋亡細胞,顯現(FITC+/PI-)。

日期:2007年9月25日 - 來自[細胞學技術]欄目

流式細胞儀檢測細胞凋亡——Heochst 33342/PI雙染色法

  基本原理

  經固定的凋亡細胞其染色體熒光染料的DNA可染性性下降。細胞一經固定就不再是活細胞,而且細胞固定過程對細胞膜的通透性也有影響。因此發展了用“細胞活性”鑒定染料染色的流式細胞儀檢測方法。這些方法細胞不經固定就直接用DNA染料染色,且染料的濃度要比固定細胞所用的濃度要低得多。流式細胞儀通常根據細胞膜完整性將細胞分為“活細胞”和“死細胞”,因此正常細胞和凋亡細胞歸為活細胞。活細胞染料如Hoechst 33342能少許進入正常細胞膜而對細胞沒有太大得細胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡細胞中的熒光強度要比正常細胞中要高,Hoechst 33342在凋亡細胞中的熒光強度增高的機制與凋亡細胞膜通透性發生改變有關,凋亡細胞早期細胞膜的完整性沒有明顯性改變,但細胞膜的通透性已有增強,因此進入凋亡細胞中的Hoechst 33342比正常細胞的多。此外,還與凋亡細胞的染色體DNA的結構發生了改變從而使該染料能更有效地與DNA結合以及凋亡細胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到損傷不能有效地將Hoechst 33342排出到細胞外使之在細胞內積累增加等有關。既然Hoechst 33342進入凋亡細胞中比正常細胞更容易,而EB、PI或7-AAD等染料是不能進入細胞膜完整的活細胞中,即正常細胞和凋亡細胞在不經固定的情況下對這些染料是拒染,壞死細胞由于膜完整性在早期即已破損,可被這些染料染色。根據這些特性,用Hoechst 33342結合PI或EB等染料對凋亡細胞進行雙染色,就可在流式細胞儀上將正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞區別開來。在雙變量流式細胞儀的散點圖上,這三群細胞表現分別為:正常細胞為低藍色/低紅色(Hoechst 33342+/PI+),凋亡細胞為高藍色/低紅色(Hoechst 33342++/PI+),壞死細胞為低藍色/高紅色(Hoechst 33342+/PI++)。

  試劑與儀器

   Heochst 33342 染液:用PBS配成10ug/ml的儲存液濃度,4℃避光保存;

   PI染液 :用PBS配成5ug/ml濃度,4℃避光保存。

   400目的篩網

   流式細胞儀

  實驗步驟

  1. 懸浮生長的細胞在培養的狀態下加入Heochst 33342 ,終濃度為1ug/ml; 37℃孵育7—10min。

  2. 低溫500 ~ 1000r/min離心5min棄去染液。

  3. 加入1.0ml PI染液,4℃避光染色15min。

  4. 400目的篩網過濾1次。

  5. 流式細胞儀分析:Heochst 33342用氪激光激發的紫外線熒光,激發光波波長為352nm,發射光波波長為400 ~ 500nm,產生蘭色熒光;PI用氬離子激光激發熒光,激發光波波長為488nm,發射光波波長大于630nm,產生紅色熒光。分析蘭色熒光對紅色熒光的散點圖或地形圖。

  6. 結果判斷:在蘭色熒光對紅色熒光的散點圖上,結果為:正常細胞為低藍光/低紅光,凋亡細胞為高藍光/低紅光,壞死細胞為低藍光/高紅光。

  注意事項

  1. 在紅色熒光對蘭色熒光散點圖上,還可見到細胞凋亡區向細胞壞死區遷移的軌跡,可能是凋亡細胞的DNA進一步降解的緣故。

  2. 用Heochst 33342染料與細胞孵育的時間不宜過長,一般控制在20min之內為宜。如果太長可引起Heochst 33342的發射光譜由藍光向紅光的遷移,導致紅色熒光與蘭色熒光的比例改變,從而影響結果的判斷。

日期:2007年9月25日 - 來自[細胞學技術]欄目

流式細胞儀檢測細胞凋亡——PI單染色法

  基本原理

  其原理主要是根據細胞凋亡時在細胞、亞細胞和分子水平上所發生的特征性改變。這些改變包括細胞核的改變、細胞器的改變、細胞膜成分的改變和細胞形態的改變等,其中細胞核的改變最具特征性,主要包括以下幾個方面:

  1. 細胞核的改變:由于凋亡細胞核的改變,造成各種染色體熒光染料對凋亡細胞DNA可染性發生改變。研究表明,用各種染色體熒光染料對經固定的凋亡細胞進行染色,其DNA可染性降低。許多學者把這種DNA可染性的降低認為是凋亡細胞的標志之一。

  2. 光散射特性:凋亡細胞形態上的改變影響它們的光散射特性。在流式細胞儀上,前散射光與細胞的大小有關,而側散射光反映的是光在細胞內的折射作用,與細胞內的顆粒多少有關。在細胞凋亡時,細胞固縮,體積變小,故前散射光降低,這一特性往往被認為是凋亡細胞的特點之一。此外細胞凋亡時由于染色體降解,核破裂形成,細胞內顆粒往往增多,故凋亡細胞側散射光常增加。細胞壞死時,由于細胞腫脹,其前散射光增大;側散射光在細胞壞死時也增大,因此可根據前散射光和側散射光區別凋亡細胞和壞死細胞。但需要注意的是,根據前散射光和側散射光判斷凋亡細胞的可靠性受被檢測細胞形態上的均一性和核胞漿比率影響很大。因此在某些淋巴細胞凋亡中,用光散射特性檢測凋亡的可靠性較好,而在腫瘤細胞凋亡中,其可靠性就較差。根據光散射特性檢測凋亡細胞最主要的優點是可以將光散射特性與細胞的表面免疫熒光分析結合起來,用以區別經這些特殊處理發生選擇性凋亡的淋巴細胞亞型。也可用于活細胞的分類。

  試劑與儀器

   PBS溶液;

   PI染液:將PI溶于PBS(pH7.4)中,終濃度為100ug/ml。用棕色瓶4℃避光保存。

   70%乙醇

   400目篩網

   流式細胞儀

  實驗步驟

  1. 收集細胞{數目約(1~ 5)×106個/mL},500 ~ 1000 r/min離心5min,棄去培養液。

  2. 3ml PBS洗滌1次。

  3. 離心去PBS,加入冰預冷的70%的乙醇固定,4℃,1—2小時。

  4. 離心棄去固定液,3mlPBS重懸5min。

  5. 400目的篩網過濾1次,500—1000r/min離心5min,棄去PBS。

  6. 用1ml PI染液染色,4℃避光30min。

  7. 流式細胞儀檢測:PI用氬離子激發熒光,激光光波波長為488nm,發射光波波長大于630nm,產生紅色熒光分析PI熒光強度的直方圖也可分析前散射光對側散射光的散點圖。

  8. 結果判斷:在前散射光對側散射光的散點圖或地形圖上,凋亡細胞與正常細胞相比,前散射光降低,而側散射光可高可低,與細胞的類型有關;在分析PI熒光的直方圖時,先用門技術排除成雙或聚集的細胞以及發微弱熒光的細胞碎片,在PI熒光的直方圖上,凋亡細胞在G1/G0期前出現一亞二倍體峰。如以G1/G0期所在位置的熒光強度為1.0,則一個典型的凋亡細胞樣本其亞二倍體峰的熒光強度為0.45,可用雞和鮭魚的紅細胞的PI熒光強度做參照標準,兩者分別為0.35和0.7,可以確保在兩者之間的不是細胞碎片而是完整的細胞。

  注意事項

  細胞凋亡時,其DNA可染性降低被認為是凋亡細胞的標志之一,但這種DNA可染性降低也可能是因為DNA含量的降低,或者是因為DNA結構的改變使其與染料結合的能力發生改變所致。在分析結果時應該注意。

日期:2007年9月25日 - 來自[細胞學技術]欄目
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