主題:培養基

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細胞培養基的基本知識

  培養細胞的完全培養基由基礎培養基(如MEM)和添加劑(如血清或無血清培養用的某些確定的激素及生長因子)組成,培養基的配方一直在改進,其中包括抗生素和抗有絲分裂劑等等。

一、基礎培養基

絕大多數培養基是建立在平衡鹽溶液(BSS)基礎上,添加了氨基酸、維生素和其它與血清中濃度相似的營養物質。最廣泛應用的培養基是Eearle`s MEM 的混合物,其中含有13種必須氨基酸、8種維生素。而Ham`s F12 也包括非必須氨基酸,維生素的范圍亦很廣,另外常規含有無機鹽和代謝添加劑(例如核苷酸)。MEM/F12 這兩種培養基各取1/2,形成神經生物學最通用的培養基。Dulbecco`s改良培養基——DMEM,現應用于快速生長的細胞,同MEM含有相同的營養成分,但濃度高出2~4倍。選擇某種培養基,應仔細了解成分表,應知道大多數情形下培養基都有不足。例如,有些培養基在氨基酸中包括有谷氨酸,而這種培養基雖廣泛用于神經生物學領域,但它對某些對谷氨酸敏感的可能有細胞外毒性損傷的神經元而言,則并非最佳選擇,特別是如果神經元生長在缺乏膠質的環境中時。F12中含有硫酸亞鐵,據報道也有神經毒效應。 在所有這些培養基中,谷氨酸比其他氨基酸有更高的濃度,這是因為它具有不穩定性以及在許多細胞培養中它常用作碳源。對于神經元的培養常常在基礎培養基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸(若培養基中這兩種物質缺乏時)。MEM與F12均要用5%的CO2來平衡,DMEM含更高濃度的NaCO3,要用10%的CO2來平衡,當然也可以在較低CO2濃度下使用。這些基礎培養基的組成成分是建立在對不同細胞系生長的研究之上的,但通常在原代培養中使用也能有比較令人滿意的結果。 原則上,HEPES作為緩沖劑可用來代替碳酸氫鹽,以解除需要高濃度CO2培養環境的限制。實際操作中并非如此簡單。顯然,溶解的CO2與碳酸氫鹽對良好的細胞生長是重要的。Leiboviz`s L15培養基可用來在大氣環境中令神經細胞生長,該培養基采用了與眾不同的BSS作基礎,它含有高濃度的氨基酸來提高緩沖能力,培養基中使用半乳糖作碳源,以阻止培養基中乳酸形成,少量溶解的CO2由丙酮酸代謝產生。這一培養基的優點是明顯的,特別是在保持較高CO2有困難時,例如在長時間的顯微操作及生理學研究中。L15培養基已用來成功的培養了外周神經元,但尚未在CNS神經元的發育研究中全面檢測過。

二、血清

細胞在單純的基礎培養基中不能存活,在特殊類型的細胞培養中必須提供某些痕量營養物質及生長因子才能使細胞得以生長并維持生長狀態。基礎培養基常常要添加血清,血清終濃度多為5~20%。特殊用途的血清來源須用經驗確定,廣泛應用的血清種類有馬血清與胎牛血清。胎牛血清中富含有絲分裂因子,常選其作增殖細胞用的血清,也用于細胞系和原代培養。而馬血清常常用來作有絲分裂后的神經元培養。然而,很多人也將胎牛血清用于神經元培養,也有人用馬血清來培養膠質細胞。用大鼠進行神經元培養的某些研究者喜歡使用同型血清;人類的胎盤血清,亦曾用于神經組織的器官類型的培養,也用在一些特殊培養種類中。 血清的不同批號含有不同的成分,所以許多人發現,應該在使用前對血清進行測試。大多數試劑商提供樣品,所滿意的批號即可選用,這樣可以一次得到足夠一年用量的血清,血清在使用前通常在56℃加熱30分鐘,這一過程稱為滅活。

三、無血清培養基

1979年神經細胞培養出現了一個重要進展,用化學添加劑即可維持神經細胞存活與生長而不需要在培養基中添加血清。其工作基礎是用合適的激素、營養物和促貼壁的物質的組合置換培養基中的成分,最后找到了適合大多數細胞培養的試劑配方,該配方稱為N2,專門用于神經細胞培養,最早是用在B104大鼠神經母細胞瘤細胞系的培養。它的基礎培養基是1:1的DMEM與H12的混合液,添加了胰島素、轉鐵蛋白、黃體酮、腐胺和硒。胰島素和胰島素樣生長因子對于大多數類型細胞的存活和生長有重要作用,硒是谷胱甘肽產生的合作因子,可能有助于過氧化物和超氧化物的水解,有報道說還能防止細胞的光照損傷。隨后的其他配方如N1N3則含有較低濃度的轉鐵蛋白。 未料到的是上述配方構成的培養基可以支持神經母細胞瘤細胞系快速增殖,隨后又發展了能支持原代培養的各種神經元生長的培養基,這種培養基在許多實驗室里已取代了有血清培養。在某些培養方案中,細胞直接進入無血清培養,這樣的培養基可以消除來自血清的不均一性。更為重要的是,它們可用來檢測生長因子以及其他促進神經元存活或生長的因子,或者用來檢測那些可保護神經元免遭環境毒物損傷的制劑。專用于神經元的培養基在某些培養環境中還可以減低非神經元細胞的增殖,故可使神經元純化。 血清中含有的組分,例如血清蛋白,可作為代謝毒物清除劑使用并能聚集于培養基中。當缺乏這些成分時,如神經元在無血清培養基中生長時,特別容易為過氧化物及自由基傷害,這已被許多研究者注意到了。過氧化物酶以及超氧化物歧化酶可阻止培養基中過氧化物和超氧化物的累積,有報道講可以促進低密度培養細胞的存活。有學者發現細胞存活可為氧分壓的下降而促進。因而,無血清培養基的配方常含有抗氧化劑的試劑。例如,維生素E和丙酮酸,可作為過氧化物清除劑使用。上述這些影響在高密度培養時變小,特別是神經元與膠質共培養時,它們可以吸收和代謝神經元毒性物質如谷氨酸。 應該注意,盡管無血清培養基是有化學限定性的,但在培養過程中它仍有變動,培養起始時可能有些物質缺乏,而后細胞的產物可能積累,從而使培養基的成分改變。這其實是有另一方面的好處,即條件培養基(已培養過細胞的培養基)的形成,條件培養基常常用來增加神經元和膠質細胞的發育。 生長因子絕大多數哺乳類胚胎神經元有嚴格的營養要求,若不能提供適宜的生長因子或合適的因子組分,將會使絕大多數神經元在體外培養的數天中死亡。解決這一問題有兩條思路,一是讓培養細胞提供自己的營養因子,二是在培養基中加入純的生長因子。如果細胞混合物能在高密度時生長,所需的生長因子便會積累到可觀的數值,尤其當培養基很少變化時。若某種細胞混合物生長時有很少的營養需求,可保持培養基在一段時間里不作任何變動,以使營養(生長)因子積累,而最后促使所需要的細胞類型能夠生長。但是,這種對營養(生長)因子自身倚賴性亦有弊端,因為通常在混合細胞群體中細胞很難有同比例增殖,某些細胞會因生長條件的貧乏而受限制。另外,這種方法只能進行相當高密度的細胞培養。因為培養基的條件在細胞的較低密度時變的不夠有效。不過某些時候純化神經元群體的低密度培養可用條件培養基(經過了高密度培養)進行,或在膠質上生長的神經元所用過的培養基來支持。 滿足神經元營養需求的第二條途徑是向培養基中加入生長因子。通常用于組培的通用適宜因子是神經生長因子NGF。不過,只有少數對這種蛋白質有反應的細胞類型的細胞才能生長。 許多PNS類型的神經元在離體狀態時表現出簡單的營養需求,只需提供單一的營養因子就足以使其在低密度時增殖。例如,大鼠交感神經元僅需NGF即能存活,在其生存期間,這些神經元可在嚴格局限條件下生長好幾個月(即在無血清培養基中、或缺乏膠質細胞、或在化學限定基質上)。有證據表明NGF是活體中交感神經元存活的生理調節因子。然而,交感神經元也對來自膠質細胞的神經營養因子(GDNF)有反應,還有NT3、LIF與CNTF也對其有作用。在不產生GDNF或NT3的動物中,交感神經元會有損傷。在離體與活體營養需求之間的差別或許可以用在不同環境中NGF含量和分布的不同來解釋,培養中的NGF彌散在整個環境中,而在活體內,大部分區域的含量是有限的。因此,NGF的重要性在于其合適的濃度。盡管在大多數實驗中已經習慣了營養因子的最大效應使用量,其他營養因子的協同效應在亞優劑量下更容易觀察到。此外,高濃度的營養因子可使細胞更能抵抗毒劑以及其他壓力。相應的,低濃度的營養因子可能用來檢查表現型,例如對自由基或氨基酸的毒性刺激劑量的反應。有許多其他的PNS培養系統只需單一營養因子就可使有實用價值的細胞保持在一定比例,廣為人知的有雛雞睫狀自主神經節神經元和大鼠背根神經節感覺神經元。不過,這些模型也有局限性。例如,培養中的睫狀神經節的神經元加入CNTF時,超過90%的神經元能存活一個很長時期,但并未有跡象表明它屬于內源的靶細胞來源的營養因子,而是有爭論的相關分子,GPA,扮演了這一角色。大鼠背根神經節含有好幾種細胞群體,其中小細胞群、包括nocioceptive cell,對NGF有反應,但其他神經元,例如大細胞群中的proprioception 卻對不同的神經營養因子有反應。因此,在大多條件下培養物的生長并不能忠實反映親代群體的所有特性,這一問題在CNS的細胞培養中特別突出,因為已有的經驗表明,沒有一種培養基能適合于所有類型及亞類的神經細胞的生長。 現有的證據已表明,CNS神經元的營養需求比PNS的更復雜。對脊髓運動神經元與視網膜節細胞神經元的研究表明,這些神經元與外周神經元相比能對更為廣泛的營養因子起反應。例如,至少發現了15種不同的分子可在離體條件下增加神經元的存活。而且,已觀察到運動神經元與視網膜對任何單獨的營養因子的存活反應,與PNS中所觀察到的典型反應相比,都要小得多。因此,大多數影響運動神經元及視網膜節細胞的營養因子僅僅只能支持神經元的亞群,而神經元的最佳存活要求諸多因子的結合。在視網膜節細胞的培養中,因子的最佳組合(如BDNF、CNTF、IGF、bFGF)包括了來自不同生長因子家族的代表。這一結果的普遍性尚待進一步的證實,但敲除單一的營養因子基因之后,沒有表現出對CNS大多類群的神經元的存活產生太大影響,這一觀察與上述的事實是一致的。現已知少突膠質細胞的長期存活也需要眾多營養因子的相互作用。

四、抗生素

在細胞培養中最常用的抗生素是青霉素(常用濃度是25~100ui/ml)與鏈霉素(25~100μg/ml)。這兩種抗生素常混合使用。在一些實驗室里,它們常規加入所有的培養基中。慶大霉素(10~100μg/ml)通常有廣譜抗菌效應,并具有溶液穩定性,故也被一些實驗室使用,特別是當有低水平的污染存在時更是這樣。以上這些試劑對霉菌與酵母菌的污染均無效。 盡管很多實驗室在細胞系的培養基中常規加入抗生素作繼代培養,但仍建議不要在原代培養中加入抗生素,其理由之一是獲得的細胞是無菌的,原代培養時的細菌污染很少發生。其次,盡管認為抗生素對細胞代謝的影響可忽略,但最好避免使用它們,以免細胞生長環境的不穩定。最重要的是要意識到培養中主要污染物的類型,它們通常暗示了問題的來源。

五、抗有絲分裂劑

某些DNA合成抑制劑對分裂細胞有毒,但對沒有DNA合成的細胞僅有輕微影響。由于神經元通常缺乏DNA合成能力,因此對抗有絲分裂劑沒有多大反應。這樣的試劑常常用于神經元的培養,以消除或減少非神經元群體。若要殺死所有的非神經元細胞,可以先加入血清或生長因子來保證有高比例的非神經元細胞進行DNA合成,此時再加入抗有絲分裂劑。但是,某些細胞在它的細胞周期的某些時相時對抗有絲分裂劑是不敏感的。不過,可以重復的將抗有絲分裂劑使用于增殖的細胞群體。在CNS神經元的培養中抗有絲分裂劑常常在星形細胞形成單層后加入,此時,星形細胞由于接觸抑制而終止了DNA的合成(即細胞停止增殖),它們不會因抗有絲分裂劑的加入而死亡。原代培養中用這種方法阻止成纖維細胞的過度增殖是十分必要的。有兩種抗有絲分裂劑常用于神經元的培養:Fluorodexyuridine,是胸苷合成酶抑制劑,一般使用濃度為~10μM。尿苷(10μM)也常使用,可阻止不分裂細胞的RNA合成。另外,阿糖胞苷也常被使用,其使用濃度為5~50μM。使用任何一種抗有絲分裂劑,都必須考慮它的神經原毒性,應該確定最低效應的使用濃度。阿糖胞苷在很低的濃度下,也會對某些種類的神經元有毒性,可以造成特定神經原的死亡。其他的抗有絲分裂劑尚未表現出這種毒性。

六、培養的保持

培養物是應該保持在孵箱中的。孵箱可以自動將O2與CO2混合很快達到培養基的設計要求,空氣中的氧濃度比血液和腦脊液中要高得多。對于某些細胞的生長,包括神經原,應使氧含量處在一個較低的水平。可以用孵箱達到這個標準,但這樣的孵箱并未廣泛使用。 高濕度可避免培養皿中培養基的蒸發,保持孵箱中的濕度通常是在箱底部放上一大盆水,這水應該經常換,乘水容器應經常消毒以防霉菌生長。若孵箱曾被霉菌孢子嚴重污染過,那么要想完全去除污染則會非常困難。當培養物必須要長期保持在孵箱中時,應采用較少培養基的瓶、皿,且將蓋子蓋緊以避免蒸發,或采用相應的按比例供空氣的孵箱。 溫度的精確調節應定期檢查,孵箱溫度常設置為37℃或較低溫度。細胞在低溫時可有較長時間的忍耐限度,但當溫度升至39℃時,幾小時內即死亡。 維持培養物的最佳方案常常改變。例如培養膠質細胞時,要經常換液以使其增殖達到最大。而在培養某些神經原時,則要求盡可能少的換液,神經原在兩次換液之間的條件下長的最好。大腦皮質的培養要求在不換液的情形下維持一個月以上。另一方面,象海馬神經原那樣的細胞,倚賴于條件培養基,若換液太頻繁細胞就會衰退,此時,可采用1/3或1/2換液的方式。
日期:2007年9月25日 - 來自[細胞學技術]欄目

細胞培養常見問題及其解決

  1. 如何選用特殊細胞系培養基?

  培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞,很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之,首選MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養是一個好的開始。

  

  2. 何時須更換培養基?

  視細胞生長密度而定,或遵照細胞株基本數據上之更換時間,按時更換培養基即可。

  

  3. 可否使用與原先培養條件不同之培養基?

  不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養基,若驟然使用和原先提供之培養條件不同之培養基,細胞大都無法立即適應,造成細胞無法存活。

  

  4 可否使用與原先培養條件不同之血清種類?

  不能。血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源,所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清,在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同,血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。

  

  5 何謂FBS, FCS, CS, HS ?

  FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思,兩者都是指胎牛血清,FCS 乃錯誤的使用字眼,請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。

  

  6 培養細胞時應使用5% 或10% CO2?或根本沒有影響?

  一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統,而培養基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養時應使用的CO2 濃度。當培養基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時,細胞培養時應使用10% CO2;當培養基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時,則應使用5% CO2 培養細胞。

  

  7.Hank's 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用,不需要CO2培養箱。原因是什么?Hank's 平衡鹽溶液(HBS)和Earle's平衡鹽溶液(EBS)有什么本質的功能差別?

  HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡,以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中,溶液會變堿,Hanks液在CO2培養箱中會變酸。如果希望在CO2培養箱中保存組織,需要用Eagles液,。如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織,用Hanks液就可以了。

  

  8. 細胞之接種密度為何?

  依照細胞株基本數據上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。

  

  9. 懸浮性細胞應如何繼代處理?

  一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中,稀釋細胞濃度即可,若培養液太多時,可將培養角瓶口端稍微抬高,直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶,加入新鮮培養基稀釋至適當濃度,重復前述步驟即可。

  

  10.冷凍管應如何解凍?

  取出冷凍管后,須立即放入37℃水槽中快速解凍,輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化,并注意水面不可超過冷凍管蓋沿,否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時,必須注意安全,預防冷凍管之爆裂。

  

  11. 細胞冷凍管解凍培養時,是否應馬上去除DMSO?

  除少數特別注明對DMSO 敏感之細胞外,絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞),在解凍之后,應直接放入含有10-15ml新鮮培養基之培養角瓶中,待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO 即可,如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。

  

  12. 附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度?應如何處理?

  一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中,保存于–20 °C,避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低,并可減少污染之機會。

  

  13.欲將一般動物細胞離心下來,其離心速率應為多少轉速?

  欲回收動物細胞,其離心速率一般為300xg (約1,000rpm),5 - 10 分鐘,過高之轉速,將造成細胞死亡。

  

  14. 細胞冷凍培養基之成份為何?

  動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養基是含5 - 10%DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95% 原來細胞生長用之新鮮培養基均勻混合之。注意:由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能,故不可將DMSO 直接加入細胞液中,必須使用前先行配制完成。

  

  15.DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何?

  冷凍保存使用之DMSO 等級,必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650),其本身即為無菌狀況,第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中,保存于4°C,避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質,并可減少污染之機會。若要過濾DMSO,則須使用耐DMSO 之Nylon 材質濾膜。

  

  16.冷凍保存細胞之方法?

  冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80℃16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。

  冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3℃至–80℃以下,再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20℃不可超過1 小時,以防止冰晶過大,造成細胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中,惟存活率稍微 降低一些。

  

  17. 細胞欲冷凍保存時,細胞冷凍管內應有多少細胞濃度?

  冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml vial,融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。

  

  18.培養基中是否須添加抗生素?

  除于特殊篩選系統中外,一般正常培養狀態下,培養基中不應添加任何抗生素。

  

  19.應如何避免細胞污染?

  細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好之細胞來源和培養基配制是減低污染之最好方法。

  

  20.如果細胞發生微生物污染時,應如何處理?

  原則上:直接滅菌后丟棄之。

  當重要的培養污染時,研究者可能試圖消除或控制污染。首先,確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母,把污染細胞與其它細胞系隔離開,用實驗室消毒劑消毒培養器皿和超凈臺,檢查HEPA過濾器。

  高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性,因而,做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養污染的實驗步驟。

  1.在無抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞,稀釋到常規細胞傳代的濃度。

  2.分散細胞懸液到多孔培養板中,或幾個小培養瓶中。在一個濃度梯度范圍內,把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如,兩性霉素B推薦下列濃度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。

  3.每天觀測細胞毒性指標,如脫落,出現空泡,匯合度下降和變圓。

  4.確定抗生素毒性水平后,使用低于毒性濃度2~3倍濃度的抗生素的培養液培養細胞2~3代。

  5.在無抗生素的培養基中培養細胞一代。

  6.重復步驟4。

  7.在無抗生素的培養基中培養4~6代,確定污染是否以已被消除。

  

  21.支原體(mycoplasma) 污染的細胞,是否能以肉眼觀察出異狀?

  不能。除極有經驗之專家外,大多數遭受支原體污染的細胞株,無法以其外觀分辨之。

  

  22.支原體污染會對細胞培養有何影響?

  支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數,代謝及研究之任一數據。故進行實驗前,必須確認細胞為mycoplasma-free,實驗結果之數據方有意義。

  

  23. 偵測出細胞株有支原體污染時,該如何處理?

  直接滅菌后丟棄,以避免污染其它細胞株。

  

  24. CO2 培養箱之水盤如何保持清潔?

  定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。

  

  25.為何培養基保存于4℃冰箱中,顏色會偏暗紅色,且pH值會越來越偏堿性?

  培養基保存于4℃冰箱中,培養基內之CO2 會逐漸溢出,造成培養基越來越偏堿性。而培養基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養基偏堿之結果,將造成細胞生長停滯或死亡。若培養基偏堿時,可以通入無菌過濾之CO2,以調整pH 值。

  

  26. 各種細胞培養用的dish,flask是否均相同?

  不同廠牌的dish 或flask,其所coating 的polymer 不同,制造程序亦不同,雖對大部分細胞沒有太大之影響,惟少數細胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異。

  

  27. 購買之細胞冷凍管經解凍后,為何會發生細胞數目太少之情形?

  研究人員在冷凍細胞之培養時出現細胞數目太少,大都是因為離心過程操作上的失誤,造成細胞的物理性損傷,以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心,應待細胞生長隔夜后再更換培養基即可。

  

  28.購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因?

  研究人員在細胞培養時出現存活率不佳,常見原因可歸納為:培養基使用錯誤或培養基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后,加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養溫度使用錯誤。細胞置于–80℃太久。

  

  29. 收到之冷凍管瓶身破裂,瓶蓋有裂紋,或瓶蓋脫落之原因?

  冷凍管瓶蓋裂紋,或瓶身破裂,可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當,造成冷凍管裂損,建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫,乃因熱脹冷縮之物理現象,冷凍管有可能因此而造成細胞污染,故冷凍管于放入和取出液氮桶時,均應立刻將冷凍管再一次扭緊。

  30.L-谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎?它在溶液中不穩定嗎?

  L-谷氨酰胺在細胞培養時是重要的。脫掉氨基后,L-谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解,但是確切的降解率一直沒有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成,而氨對于一些細胞具有毒性。

  31.GlutaMAX-I是什么?培養細胞如何利用GlutaMAX-I?這個二肽有多穩定?

  GlutaMAX-I 二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物,其不穩定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽,釋放L-谷氨酰胺供利用。

  GlutaMAX-I二肽非常穩定,即使在121磅滅菌20分鐘,GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,如果在相同條件下,L-谷氨酰胺幾乎完全降解。

  32.什么培養基中可以省去加酚紅?

  酚紅在培養基中用作PH值的指示劑:中性時為紅色,酸性時為黃色,堿性時為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用,(特別是雌激素)。為避免固醇類反應,培養細胞,尤其是哺乳類細胞時,用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測,一些研究人員在做流式細胞檢測時,不使用加有酚紅的培養基。

  33.如何用臺盼蘭計數活細胞?

  用無血清培養基把細胞懸液稀釋到200~2000個/毫升,在0.1毫升細胞懸液中加0.1毫升0.4%的臺盼蘭溶液。輕輕混勻,數分鐘后,用血球計數板計數細胞。活細胞排斥臺盼蘭,因而染成藍色細胞是死細胞。

  34.培養基中丙酮酸鈉的作用是什么?

  丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源,盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,但是,如果沒有葡萄糖的話,細胞也可以代謝丙酮酸鈉。

  35.二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎?使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么?

  二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前,用EDTA清洗細胞,以消除來自培養基中所有的二價離子。

  36.室溫下配制的Tris-HCl溶液,在37℃使用時PH值是多少?

  緩沖液PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃,25℃,37℃時,不同PH值。 50mM Tris-HC 溶液在4℃,25℃,37℃時,不同PH值

  

4°C

25°C

37°C

8.1

  8.2

  8.3

  8.4

  8.5

  8.6

  8.7

  8.8

  8.9

  9.0

  9.1

  9.2

  9.3

  9.4

8.5

  7.6

  7.7

  7.8

  7.9

  8.0

  8.1

  8.2

  8.3

  8.4

  8.5

  8.6

  8.7

  8.8

7.2

  7.3

  7.4

  7.5

  7.6

  7.7

  7.8

  7.9

  8.0

  8.1

  8.2

  8.3

  8.4

  8.5

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  37.如何從T25瓶中轉移sf9細胞?能用胰蛋白酶消化嗎?

  我們推薦使用脫落細胞的方法,此技術破壞性最小,生活力最高。通過使用巴斯德吸液管,讓細胞上培養基流動。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養瓶。只有在絕對必要的情況下,才使用胰酶消化細胞。

  38.胰酶消化一個T25瓶的sf9細胞:

  1. 去除培養基。

  2. 用2ml 1xPBS(足以覆蓋細胞表面)洗滌細胞,去除PBS。

  3. 加入2ml 1x胰酶EDTA(恰好覆蓋細胞表面)。

  4. 37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測看到5分鐘后它們正在向上移動。

  5. 向細胞中加入2ml 細胞培養液,移入錐形管,用2ml培養液洗瓶壁,移入同一錐形管中。(培養基中的FBS終止了胰酶的活性。)

  6. 離心(1100rpm)沉淀細胞。去除培養基。

  7. 用新的培養基重新懸浮細胞。傳代。

  39.在Sf9, Sf21, 和high Five細胞懸浮培養時,肝素的使用量是多少?

  為了防止懸浮培養細胞聚集的形成,使用肝素濃度為10單位/毫升細胞懸液。

  40.在重新凍存sf9細胞前,它可以傳多少代?隨著傳代的次數的增加,它的感染能力會降低嗎?

  通常情況當細胞經過30次傳代后,應該返回凍存。無論什么時候計數時,都應該檢查細胞活力。如果超過95%的細胞保持有活力和在大約30小時左右加倍,細胞仍然可以使用。如果活力和加倍時間下降,它們的感染力將不在是有效的。

  41.貯存在冰箱中的瓶口已開的培養基,在放置幾天后顏色變紫?

  這主要是由于在暴露到周圍的CO2水平時,碳酸氫納導致了pH值的上升。您可以在使用前松開瓶口,在CO2培養箱孵育培養基10-15分鐘,來校正溶液的pH值(確定松開瓶口以保證氣體交換)。

  42. 細胞培養基偶然被凍,可否繼續使用?

  如果細胞培養基偶然被凍,您應該熔化培養基并觀察是否有沉淀產生。如果沒有沉淀產生,培養基可以正常使用,如果出現沉淀,只能丟棄這些培養基。

  43. 無血清培養與有血清培養使用的抗生素量一樣嗎?

  當在無血清培養基中添加抗生素時,降低至少在有血清培養基中所使用濃度的50%。血清蛋白會結合和滅活一些抗生素。在無血清培養條件下,抗生素不被滅活,可能對于細胞達到毒性水平。

  44. 培養基中添加了血清和抗生素后,可長期保存嗎?

  一旦您在新鮮培養基中添加了血清和抗生素時,您應該在兩到三周內使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。

  45.培養基及其它添加物和試劑可反復凍融嗎?

  大部分添加物和試劑最多可以凍融3次,如果次數更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,將會影響它的性能。

  46.為什么要在溶解的一周內使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液?

  胰蛋白酶在4℃就可能開始降解,如果在室溫下放置超過30分鐘,就會變得不穩定。

  47.保存血清最好的方法?

  我們建議血清應保存在-5℃至-2O℃。若存放于4℃時,請勿超過一個月。若一次無法用完一瓶,建議無菌分裝血清至恰當的滅菌容器內,再放回冷凍。

  48. 如何解凍血清才不會使產品質量受損?

  將血清從冷凍箱取出后,先置于2~8℃冰箱使之融解,然后在室溫下使之全融。但必須注意的是,融解過程中必須規則地搖晃均勻。

  49. 血清解凍后發現有絮狀沉淀物出現,該如何處理?

  血清中沉淀物的出現有許多種原因,但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成,而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后,也會存在于血清中,亦是造成沉淀物的原因之一。但這些絮狀沉淀物,并不影響血清本身的質量。

  若欲去除這些絮狀沉淀物,可以將血清分裝至無菌離心管內,以400g稍微離心,上清液即可接著加入培養基內一起過濾。最好不使用過濾的方法去除這些絮狀沉淀物,因為它可能會阻塞過濾膜。

  50. 為什么要熱滅活血清?

  加熱可以滅活補體系統。激活的補體參與溶解細胞事件,刺激平滑肌收縮,細胞和血小板釋放組胺,激活淋巴細胞和巨噬細胞。在免疫學研究,培養ES細胞、平滑肌細胞時,推薦使用熱滅活血清。

  51. 有必要做熱滅活嗎?

  實驗顯示,經過正確處理的熱滅活血清,對大多數的細胞而言是不需要的。經此處理過的血清對細胞的生長只有微小的促進,或完全沒有任何作用,甚至通常因為高溫處理影響了血清的質量,而造成細胞生長速率的降低。而經過熱處理的血清,沉淀物的形成會顯著的增多,這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察,像是“小黑點”,常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染,而把血清放在37℃環境中,又會使此沉淀物更增多,使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。

  若非必須,可以不需要做熱處理這一步。不但節省時間,更確保血清的質量!

  52. 為什么儲存在冰箱中的胎牛血清會出現沉淀?

  有些胎牛血清產品沒有預老化,儲存在2-8℃時,血清中的各種蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應該不會影響血清的質量。推薦在-20℃儲存胎牛血清,避免反復凍融。

  53. 如何避免沉淀物的產生?

  我們建議您在使用血清的時候,注意下列的操作:

  (1)解凍血清時,請按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫),若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃至37℃),非常容易產生沉淀物。

  (2)解凍血清時,請隨時將之搖晃均勻,使溫度及成分均一,減少沉淀的發生。

  (3)請勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久,血清會變得混濁,同時血清中許多較不穩定的成分也會因此受到損害,而影響血清的質量。

  (4)血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多,若非必要,可以無須做此步驟。

  (5)若必須做血清的熱滅活,請遵守56℃,30分鐘的原則,并且隨時搖晃均勻。溫度過高,時間過久或搖晃不均勻,都會造成沉淀物的增多。

  

日期:2007年9月25日 - 來自[細胞學技術]欄目

細胞培養FAQ

  1 冷凍管應如何解凍?

  取出冷凍管后,須立即放入37℃水槽中快速解凍,輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化,并注意水面不可超過冷凍管蓋沿,否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時,必須注意安全,預防冷凍管之爆裂。

  2 細胞冷凍管解凍培養時,是否應馬上去除DMSO?

  除少數特別注明對DMSO 敏感之細胞外,絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞),在解凍之后,應直接放入含有10-15ml新鮮培養基之培養角瓶中,待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO 即可,如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。

  3 可否使用與原先培養條件不同之培養基?

  不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養基,若驟然使用和原先提供之培養條件不同之培養基,細胞大都無法立即適應,造成細胞無法存活。

  4 可否使用與原先培養條件不同之血清種類?

  不能。血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源,所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清,在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同,血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。

  5 何謂FBS, FCS, CS, HS ?

  FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思,兩者都是指胎牛血清,FCS 乃錯誤的使用字眼,請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。

  6 培養細胞時應使用5% 或10% CO2?或根本沒有影響?

  一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統,而培養基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養時應使用的CO2 濃度。當培養基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時,細胞培養時應使用10% CO2;當培養基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時,則應使用5% CO2 培養細胞。

  7 何時須更換培養基?

  視細胞生長密度而定,或遵照細胞株基本數據上之更換時間,按時更換培養基即可。

  8 培養基中是否須添加抗生素?

  除于特殊篩選系統中外,一般正常培養狀態下,培養基中不應添加任何抗生素。

  9 附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度?應如何處理?

  一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中,保存于–20 °C,避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低,并可減少污染之機會。

  10 懸浮性細胞應如何繼代處理?

  一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中,稀釋細胞濃度即可,若培養液太多時,可將培養角瓶口端稍微抬高,直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶,加入新鮮培養基稀釋至適當濃度,重復前述步驟即可。

  11 欲將一般動物細胞離心下來,其離心速率應為多少轉速?

  欲回收動物細胞,其離心速率一般為300xg (約1,000rpm),5 - 10 分鐘,過高之轉速,將造成細胞死亡。

  12 細胞之接種密度為何?

  依照細胞株基本數據上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。

  13 細胞冷凍培養基之成份為何?

  動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養基是含5 - 10%DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95% 原來細胞生長用之新鮮培養基均勻混合之。注意:由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能,故不可將DMSO 直接加入細胞液中,必須使用前先行配制完成。

  14 DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何?

  冷凍保存使用之DMSO 等級,必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650),其本身即為無菌狀況,第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中,保存于4°C,避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質,并可減少污染之機會。若要過濾DMSO,則須使用耐DMSO 之Nylon 材質濾膜。

  15 冷凍保存細胞之方法?

  冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80℃16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。

  冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3℃至–80℃以下,再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20℃不可超過1 小時,以防止冰晶過大,造成細胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中,惟存活率稍微降低一些。

  16 細胞欲冷凍保存時,細胞冷凍管內應有多少細胞濃度?

  冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml vial,融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。

  17 應如何避免細胞污染?

  細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好之細胞來源和培養基配制是減低污染之最好方法。

  18 如果細胞發生微生物污染時,應如何處理?

  直接滅菌后丟棄之。

  19 支原體(mycoplasma) 污染的細胞,是否能以肉眼觀察出異狀?

  不能。除極有經驗之專家外,大多數遭受支原體污染的細胞株,

  無法以其外觀分辨之。

  20 支原體污染會對細胞培養有何影響?

  支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數,代謝及研究之任一數據。故進行實驗前,必須確認細胞為mycoplasma-free,實驗結果之數據方有意義。

  21 偵測出細胞株有支原體污染時,該如何處理?

  直接滅菌后丟棄,以避免污染其它細胞株。

  22 CO2 培養箱之水盤如何保持清潔?

  定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。

  23 為何培養基保存于4℃冰箱中,顏色會偏暗紅色,且pH值會越來越偏堿性?

  培養基保存于4℃冰箱中,培養基內之CO2 會逐漸溢出,造成培養基越來越偏堿性。而培養基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養基偏堿之結果,將造成細胞生長停滯或死亡。若培養基偏堿時,可以通入無菌過濾之CO2,以調整pH 值。

  24 各種細胞培養用的dish,flask是否均相同?

  不同廠牌的dish 或flask,其所coating 的polymer 不同,制造程序亦不同,雖對大部分細胞沒有太大之影響,惟少數細胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異。

  25 購買之細胞冷凍管經解凍后,為何會發生細胞數目太少之情形?

  研究人員在冷凍細胞之培養時出現細胞數目太少,大都是因為離心過程操作上的失誤,造成細胞的物理性損傷,以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心,應待細胞生長隔夜后再更換培養基即可。

  26 購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因?

  研究人員在細胞培養時出現存活率不佳,常見原因可歸納為:培養基使用錯誤或培養基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后,加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養溫度使用錯誤。細胞置于–80℃太久。

  27 收到之冷凍管瓶身破裂,瓶蓋有裂紋,或瓶蓋脫落之原因?

  冷凍管瓶蓋裂紋,或瓶身破裂,可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當,造成冷凍管裂損,建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫,乃因熱脹冷縮之物理現象,冷凍管有可能因此而造成細胞污染,故冷凍管于放入和取出液氮桶時,均應立刻將冷凍管再一次扭緊。

日期:2007年9月25日 - 來自[細胞學技術]欄目

國家生命科技人才培養基地落戶深圳

        昨日,中山大學國家生命科學與技術人才培養基地,在位于深圳高新區的華生元基因工程發展有限公司揭牌,以期共建一個高水平的生物醫藥研究基地,通過產學研結合推進自主創新。
  國家生命科學與技術人才培養基地,是經教育部批準的,在深圳還是第一個。華生元成立于1997年,是國內基因生物工程產業的引導者,是國家高技術產業化示范工程項目基地,也是全球最大的重組人表面生長因子(rhEGF)藥品產業化基地。rhEGF在治療體表創傷、燒(燙)傷和潰瘍、眼角膜損傷等方面,具有巨大臨床應用價值。中山大學生命科學學院副院長王金發表示,企業和高校的發展需要互相支持,產學研結合是深圳自主創新體系的重要組成部分,希望與華生元攜手共建一個具有較高水平的生物醫藥研究基地。
日期:2007年5月18日 - 來自[科教新聞]欄目

兩種培養基對嗜血桿菌屬分離鑒定的比較

     嗜血桿菌屬與臨床有關的種有9個,而流感嗜血桿菌是一種只侵犯人的兼性厭氧的革蘭陰性桿菌,主要寄生在上呼吸道,與許多感染性疾病有關。為了選擇檢測效果好、成本低的培養基對嗜血桿菌屬進行鑒定與分型,本實驗利用進口原料配制的培養基(H1)和國產原料配制的培養基(H2)對住院病人呼吸道感染者痰液及咽拭子標本200份,其中成人152份、兒科住院患者48份的嗜血桿菌細菌進行了分離培養及鑒定并做血清學分型。

    1  材料與方法

    1.1  培養基  (1)用進口原料配制的培養基(H1),Oxid公司的胰蛋白大豆瓊脂作基礎,加入10%無菌羊血,15μg/NAD及300μg/ml 桿菌肽制成巧克力平板。(2)用國產原料配制的培養基(H2):浙江天和微生物試劑公司的淋病奈瑟氏菌培養基作基礎,加1%酵母粉,10%無菌羊血,50mg/L萬古霉素制成巧克力平板。(3)血瓊脂平板及普通瓊脂平板:常規法制備。(4)浙江產心腦瓊脂加馬血培養基。

    1.2  方法   (1)分離培養:將痰液或咽拭子劃線接種于H1和H2培養基上,置燭缸中(3%~5%CO2),35℃培養24h,選可疑菌做革蘭染色衛星試驗,糖發酵試驗。(2)流感嗜血桿菌b型乳膠凝集試驗:用于血清分型,區分b型和非b型菌株。(3)將臨床分離的嗜血桿菌屬細菌接種于浙江產心腦瓊脂加馬血培養基置燭缸35℃、24h培養,與H1和H2培養基進行比較。

    2  結果

    2.1  H1和H2培養基的比較  (1)嗜血桿菌屬細菌在兩種培養基上生長良好雜菌被抑制,H2對草綠色鏈球菌抑制作用明顯。(2)嗜血桿菌分離情況見表1。經χ2檢驗,兩種培養基對嗜血桿菌分離率差異無顯著性(P>0.05)。

    2.2  H1培養基對成人與兒童呼吸道標本中嗜血桿菌屬細菌的分離情況  見表2。成人與兒童嗜血桿菌的細菌分別為13株和17株,分離率分別為8.6%和35.4%,其中流感、副流感、副溶血、嗜沫嗜血桿菌的菌株數(分離率)為兩種培養基對200份臨床樣本。表1  嗜血桿菌分離情況表2  成人與兒童臨床標本嗜血桿菌屬分離情況(略)

    2.3  血清分型  臨床分離到的9株流感嗜血桿菌,b型1株,非b型8株。

    2.4  臨床分離的嗜血桿菌屬細菌在國產心腦瓊脂加馬血培養基上均生長。

    3  討論

    (1)雖然H2培養檢測結果好,但需要進口,成本高,H2培養基利用國產做基礎,降低了成本。該培養基中的萬古霉素有效地抑制雜菌生長,增加了培養基的選擇性且具有嗜血桿菌菌落易識別的特點。表1顯示H1和H2兩種培養基對嗜血桿菌的分離率差異無顯著性,H1和H2及國產心腦瓊脂加馬血培養基的分離效果相似。

    (2)兒童嗜血桿菌屬流感嗜血桿菌分離率(35.4%,12.5%)高于成人(8.6%,0.52%),呼吸道標本中副流感嗜血桿菌分離率高于流感嗜血桿菌。

   作者單位: 161005 黑龍江齊齊哈爾,齊齊哈爾市第一機床廠職工醫院

   (編輯:鄧  鋒)

日期:2007年4月26日 - 來自[2006年第6卷第21期]欄目

改良皮膚癬菌試驗培養基的實驗研究

2006年12月26日 中華皮膚科雜志 2006 Vol.39 No.8 P.433-435 12 (南京)為了對皮膚癬菌試驗培養基(DTM)作適當改進,篩選出最佳配方。研究者 ①采用正交設計法和單因素分組試驗對培養基的主要影響因子進行量和質的優化組合,篩選出改良培養基。②將紅色毛癬菌標準菌株菌懸液倍比稀釋,接種于DTM和改良培養基上,測定檢出靈敏度。③將3屬18種皮膚癬菌和11屬14種非皮膚癬菌的絲狀真菌接種于DTM和改良培養基上,比較特異性。結果 培養基的氮源、碳源、pH值和指示劑的調整對變色時間的影響差異無統計學意義(P>0.05),從經濟和早期判斷顏色是否改變的難易程度考慮,確定改良培養基主要配方:0.5%大豆蛋白胨,0.5%葡萄糖,指示劑為溴百里酚藍。DTM和改良培養基的檢出靈敏度均為103 cfu/mL(10 cfu/培養基)。所有受試的皮膚癬菌均能使兩種培養基變色,相對變色時間(開始變色時間-開始生長時間)DTM為-2~0 d,改良培養基為-4~0 d;絕大多數受試的霉菌也能使兩種培養基變色,相對變色時間DTM為1~5 d,改良培養基為1~6 d。可見 改良培養基的配方比DTM經濟,較DTM更易觀察到早期顏色的改變。
日期:2006年12月27日 - 來自[皮膚病與性病]欄目

無血清培養基培養人毛乳頭細胞的研究

2006年11月14日 中華皮膚科雜志 2006 Vol.39 No.6 P.335-337 3 (重慶)為了探討無血清培養液培養人頭皮毛乳頭細胞(dermal papillae cells,DPC)的可行性,并研究其生長特性。研究者預先應用纖維連接蛋白處理細胞培養瓶(板),采用Williams E無血清培養液并補充ITS(牛胰島素、轉鐵蛋白和亞硒酸鹽)培養第2代DPC,倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長狀態,采用MTT評價其增殖狀態并繪制其生長曲線。結果在無血清培養條件下,DPC在2~4 h內貼壁,2~3 d后細胞可相互融合,未見細胞明顯增殖;培養4 d后細胞連接開始中斷,形成孤立的細胞或細胞團,并可見細胞的脫落;培養1~2周后,細胞大多脫落。給予含4%小牛血清的DMEM培養10 h后,在殘余的細胞團周圍長出放射狀排列的細胞;生長曲線顯示DPC的生長呈現停滯期和緩慢生長期,未見指數生長期。可見采用無血清培養基可以培養DPC,但其培養條件有待優化。
日期:2006年11月20日 - 來自[藥理學]欄目

結核桿菌培養基的種類及應用

  自從1882年Koch發現結核桿菌以來,為促進結核桿菌生長,縮短培養時間,達到提前分離、鑒定的目的,人們對結核桿菌的營養、生理代謝及人工培養進行了一系列的研究,經過一個多世紀的不懈努力,已經對結核桿菌的生長規律有了比較深入地了解,并且形成了許多成熟的培養方法。盡管現代分子生物學技術在結核病研究中發揮著越來越重要的作用,但是結核桿菌的培養在結核病的診斷、流行病學指標、結核菌的分型鑒定、藥敏試驗、結核病藥物的研究等方面依然有著不可替代的作用。為了能夠較系統地了解、有針對性地選擇合適、恰當的培養基,本文就國內外較為成熟的培養基種類及應用進行如下綜述。

  1  按培養基的性狀分類

    培養結核桿菌的培養基,從性狀上分主要有固體培養基、液體培養基、半流體培養基、固液雙相培養基等類型,這些培養基各有特點。

  1.1  固體培養基  最常用的是羅氏(Lownstein-Jenson,L-J)培養基,也是最具代表性的一種,其他的還有小川辰次(Tatsujiogawa)雞蛋培養基和Middle brook 7H10、7H11等瓊脂培養基等。在固體培養基中,由于可以直接觀察菌落的形態并可做鑒別用,因此常用于臨床標本的分離培養、鑒別、保存菌種及對抗結核藥物的敏感性測定等方面,缺點是結核菌生長緩慢。

  1.2  液體培養基  常用的有蘇通(Sauton)培養基、Middle brook 7H9等液體培養基。結核桿菌在液體培養基中能夠更廣泛的接觸營養成分,因此在液體中生長相對較快,主要在液體表面生長,攪動時下沉至管底,可獲得大量的結核桿菌。主要缺點是:在對臨床標本的收集、采樣、運輸方面有不利的一面;不能根據肉眼觀察菌落形態;培養基污染機會多,影響結核桿菌的生長,污染時不易與結核桿菌鑒別,需涂片染色鏡檢判斷結核桿菌是否生長。

  1.3  半流體培養基  改良蘇通半流體瓊脂培養基是一種人工綜合培養基,基質透明,呈半流體狀態,生長的結核桿菌形成白色顆粒狀菌落懸浮于培養基中段,便于觀察。

  1.4  固液雙向培養基  Septi-Check AFB雙相培養基是國外應用較早的一種培養基[1],采用BD專利式封閉式固液雙相一體化培養基設計。液相為Middle brook 7H9分枝桿菌專用增菌培養基,可迅速繁殖分枝桿菌,固相為3種固體培養基平面:Middle brook 7H11和改良的L-J培養基用于及時將增菌肉湯內分枝桿菌進行分離純化以獲得單個菌落,巧克力瓊脂用于早期發現污染菌,避免時間浪費。由于有液相作為基礎,因此結核桿菌生長較快,也是一種非常有效的培養基。國內有用平菇制備的平菇雙相培養基[2]是利用平菇浸出液為基礎,加小牛血清、瓊脂等成分而配制的一種培養基,根據瓊脂的量不同制成液相、固相培養基。在國內應用較少,主要特點是成本低,制備簡單,適合于基層使用,有一定的研究價值。

  2  按成分分類

    主要分為以雞卵和瓊脂為基礎的兩種培養基[3]。為了使結核桿菌達到快速生長的目的,可加上血液、椰汁、平菇液等不同營養成分,從而配制出各種不同的培養基。

  2.1  以雞卵為基礎的培養基  有L-J培養基、Ogawa培養基、丙酮酸鈉培養基和丙酮酸鈉細胞色素C培養基等。在雞卵為主的培養基中,雞卵液是關鍵成分,在制備培養基時,要充分考慮雞卵液的新鮮程度以及營養成分是否受到破壞。

  2.1.1  L-J培養基  是一種經典的培養基[4],主要成分有天門冬素、KH2PO4、MgSO4·7H2O、枸櫞酸鎂、甘油、雞卵液等,需要血清凝固器對培養基進行凝固,以保證培養基中有一定的凝固水,以滿足長時間培養的需要。根據成分種類及劑量的不同,又可分為酸性L-J培養基和堿性L-J培養基。將L-J培養基中KH2PO4的量由2.4g增加為14g,就是酸性L-J培養基,而將KH2PO42.4g改為K2HPO43.6g,就是堿性L-J培養基。L-J培養基制備簡單,主要用于分枝桿菌初次分離培養、傳代培養、菌落觀察、保存菌種、藥物敏感性測定及菌種鑒定等,而酸性L-J培養基和堿性L-J培養基用于分枝桿菌分離培養時,標本分別用堿和酸處理。結核桿菌在L-J培養基上生長時,培養時間較長,大約在4~8周,因此不利于臨床快速檢測的需求,但作為其他快速診斷的參照,以及作為結核桿菌診斷的標準有非常重要的意義。

  2.1.2  Ogawa培養基  成分較少,又少了天門冬素,因此是一種比L-J培養基更為經濟的培養基,主要成分有谷氨酸鈉、KH2PO4、甘油、雞卵液等,還可以通過調整KH2PO4的量及谷氨酸鈉的量制備成改良培養基(Modified Ogawa),此培養基的用途與L-J培養基相同,由于價廉,特別適合于發展中國家[5]。

  2.1.3  丙酮酸鈉培養基  是在L-J培養基的基礎上加入丙酮酸鈉,除去甘油制備而成,主要用于從標本中分離牛型分枝桿菌或作為本菌的傳種及保存。而丙酮酸鈉細胞色素C培養基是在Ogawa培養基基礎上,楊樂蔭等用0.1%丙酮酸鈉代替甘油,并加入2.5%葡萄糖液及細胞色素C制成丙酮酸鈉細胞色素C培養基,與丙酮酸鈉培養基、Ogawa培養基對臨床標本比較,其培養的培養陽性率最高,顯示了丙酮酸鈉細胞色素C培養基的優越性。

  2.2  以瓊脂為基礎培養基  包括蘇通(Sauton)培養基Middle brook 7H9、7H10、7H11、7H12,匡氏培養基Proskauer培養基和Beck瓊脂培養基等。這些培養基主要是由無機鹽類及一系列的有機化合物等成分組成。瓊脂的作用主要是賦形劑,通過調整瓊脂的量,一方面可以制備成不同性狀的培養基;另一方面,在液體培養基中的少量瓊脂有利于結核桿菌在中段形成菌落,從而便于觀察。

  2.2.1  Sauton培養基[6]  主要成分有天門冬素、K2HPO4、MgSO4·7H2O、檸檬酸、枸櫞酸鐵銨、甘油等,根據是否加入瓊脂及瓊脂的量,又形成了液體培養基及半固體培養基(也稱改良蘇通半流體培養基)等。在培養基的制備上,也不需要特殊的設備,通過高壓滅菌法既可處理培養基,因此操作簡單,主要用于牛型分枝桿菌的培養,卡介苗的生產及中草藥對結核桿菌的作用的研究中。

  2.2.2  Middle brook系列培養基  是國外最常用于結核桿菌研究和診斷目的的培養基之一,從成分上看,最大的特點是成分多、配制復雜[6],但是培養時間短,因此越來越受到國內外學者的關注,其中7H9、7H12為液體培養基,7H10、7H11為固體培養基。通過在培養基中加入標記14C的棕櫚酸,當有分枝桿菌生長時,就可利用培養基中的標記物而產生有放射性14CO2,然后由BACTE TB 460監測系統檢測其含量,因此非常敏感。Middle brook系列培養基主要用于分枝桿菌培養及藥物敏感性的測定。

  2.2.3  Proskauer培養基和Beck瓊脂培養基  使用簡便,但是菌落不典型,呈扁平狀、露滴狀,多為光滑型[7]。

  3  按目的分類

  在前述的培養基基礎上,根據研究目的不同,加入特定物質后,可以制備成用于快速培養、鑒別、藥敏等不同用途的培養基,主要為了滿足臨床的需要。

  3.1  用于快速培養  主要有Becton Diskinson(BD)公司研制的系列全自動培養系統和Organon Teknika公司研制開發的培養系統。其的還有Difco公司ESP系統、生物梅里埃公司的VITAL系統等。由于與現代先進的儀器設備、技術結合,檢測靈敏度高,時間短,但通常價位較高。
20世紀70年代末,BD公司研制的培養系統主要有早期的BACTEC 460TM TB,成為全球第一臺專業的全自動分枝桿菌培養鑒定儀,該系統培養基以Middle brook7H12為基礎,在培養基中加入標記14C的棕櫚酸,因故也稱為放射同位素液體培養法,由于存在廢棄物放射性環境污染以及探針空刺開放性檢測技術缺陷,公司又推出無放射性污染的BACTEC 9000MB及BACTEC MGIT 960全自動快速分枝桿菌培養鑒定藥敏系統,真正實現了分枝桿菌快速、安全、無放射性檢測。BACTEC MGIT 960培養基以Middle brook 7H9為基礎,配方優良的BBL PANTA TM抗菌劑和OADC營養劑。采用一種熒光物質作為分枝桿菌生長指示劑,因此也稱為分枝桿菌生長指示管法(mycobacteria growth indicator tube,MGIT),是目前全球最快的分枝直菌培養、鑒定、藥敏系統。許多學者[8~10]應用發現,結核分枝桿菌平均檢出時間為14.4天,最快10天。適用于多種標本來源,對各種分枝桿菌檢測都適用。

  MB/BacT分枝桿菌培養系統是由Organon Teknika公司開發的,將血液培養中判斷細菌生長的pH指示劑用于結核桿菌的培養。結核桿菌代謝中產生的CO2變化通過化學感受器監測,利用酸堿度的變化使pH指示劑顏色改變,最后通過發射光度計檢測顏色變化。其平均檢測時間比LJ早2周。該系統依然采用Middle brook 7H9液體培養基,當有陽性信號時,需取培養液進行涂片及鑒定確認。

  Difco公司ESP系統,是一種全自動的血培養系統,可以連續監測細菌的生長。具有無放射性的特點,與BACTEC TB 460比較[11,12],在檢測時間上差異無顯著性,可以替代使用,Williams-Bouyer N等將ESP與BACTEC MGIT 960進行了詳細比較[13],在整體檢測時間上稍長些,對戈登分枝桿菌監測率高。作為一種液體培養基,需要與固體培養基結合使用,而不能作為一種獨立系統。

  我國學者根據國內具體情況,利用血液、椰汁、植物激素、平菇液、豆浸液等不同營養成分,配制成多種不同的快速培養基。如用平菇制備的平菇雙相培養基,在落實培養基基礎上的豆浸液培養基、植物激素培養基等。

  3.2  用于選擇  由于結核桿菌生長緩慢,且營養要求高,因此對于其他的微生物極易生長,通常在培養基中都加有抑菌物質。在羅氏培養基中,微量孔雀綠既可抑制雜菌的生長,又可對結核桿菌的生長有促進作用。Gynft通過把孔雀綠的濃度提高,同時加入青霉素、萘啶酸制備成選擇性的改良羅氏培養基[14]。在Middle brook 7H10、Middle brook 7H11的基礎上,通過加上多黏菌素B、羧芐青霉素C、兩性霉素B和三甲氧氨嘧啶即可制備成結核菌素的選擇培養基,其目的主要是為了減少污染率,提高陽性率。

  3.3  用于鑒別  最主要的有(對硝基苯甲酸)和TCH(噻吩-2-羧酸)鑒別培養基。用溶解稀釋后,在制備L-J培養基的同時,加入二甲基甲酰胺或丙二醇制成PNB培養基,加入噻吩-2-羧酸制成TCH培養基,用于結核分枝桿菌、牛分枝桿菌和非結核性分枝桿菌的初步鑒定[15]。

  3.4  用于藥敏  匡氏培養基是由我國研制的一種在結核桿菌快速藥敏試驗中有很好價值的培養基[16]。雖然BD公司的產品能夠快速的檢測結核桿菌,并且在藥敏方面也有一定的優勢,但早期的培養系統存在放射性,新開發的培養系統又存在污染率較高的問題,而在傳統的含藥羅氏培養基上存在抗結核藥物受熱失活和蛋白質吸附兩個主要問題至今尚未解決,而匡氏培養基的優點在于不存在高蛋白組分對藥物的吸附作用,又無加熱凝固等造成藥物失活問題,因此在藥敏試驗方面有著顯著的優越性。主要由無機鹽、維生素、瓊脂、甘油和小牛血清等成分組成。藥敏試驗報告結果比羅氏培養基平均早29天,多數藥敏結果可在3周內報告,對結核病的臨床治療有重要指導意義。BACTEC系列培養系統、ESP系統等都可用于藥敏試驗,一些液體培養基(蘇通培養基和膽固醇液體培養)可用于中草藥對結核桿菌抑菌試驗。

  3.5  用于L型細菌的培養  結核桿菌L型的營養基本上與原菌相同,但一般需要加入一定量的滲透壓穩定劑和血清,國外主要使用的培養基[17]有巰基醋酸鹽培養基、PPLO瓊脂、VSY肉湯和高橋的胰腺大豆蛋白陳瓊脂培養基(TSA-I)等。國內莊玉輝等[18]已成功地利用改良TSA-L培養基培養L型菌。此外安徽蚌埠醫學院的L型液體培養基(代號92-3TBL),培養15天后可取沉渣鏡檢。

  在結核桿菌的培養研究中出現過很多培養基,以上介紹的是國內外通用的一些培養基,有許多新出現的培養基雖然培養時間縮短,但同時出現問題也很多,因此要慎重選擇。另外,要用一種培養基同時達到多種目的也是很困難的,因此許多實驗室多同時應用幾種培養基,以便于從各個角度來滿足臨床和科研的需要。總之,只要結核病還威脅著人類的健康,對培養基的研究還將繼續下去,但是如何深入、細致地研究現有培養基各成分的相互作用及如何使現代生物技術與傳統培養技術更好的結合等問題還有待于進一步的研究。

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  18  莊玉輝,李國利,張小剛,等.肺結核病人L型分離培養方法的研究.微生物學通報,1991,18(6):348.

  作者單位: 1 832002 新疆石河子,新疆石河子大學醫學院新疆地方與民族高發病實驗室

        2 新疆石河子,石河子大學醫學院病原生物學與免疫學教研室

  (編輯:夏  琳)

日期:2006年8月28日 - 來自[2006年第3卷第4期]欄目
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