主題:過敏原

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特異性IgE(過敏原)抗體檢測的臨床意義

  【摘要】 目的  了解本地區過敏原患者的過敏原分布。 方法  用速率散射法定量檢測血清IgE,用斑點酶免疫法檢測總IgE和特異性IgE。 結果  過敏性特異性IgE陽性病例以蕁麻疹患者為最高(72%),其次是哮喘患者(69.47%)、過敏性鼻炎(57.65%)。而過敏原的種類中以塵螨、粉螨陽性率最高為(74.58%),其余依次為蟑螂、風揚、梧桐,十字花,禾本,點青霉,交鏈孢霉。 結論  特異性IgE檢測具有較高的臨床價值,但在平時的檢測中對于過敏性患者,應該IgE定量與特異性IgE同時檢測,這樣才能提高過敏原檢出率。      

  【關鍵詞】  特異性IgE;過敏原;過敏反應      

  特應性疾病(atopic disorder)是人群中一些個體對環境中存在的某些抗原(反應原)如室內塵螨、植物花粉、動物皮毛等出現變態反應,導致哮喘、過敏性鼻炎、濕疹等臨床疾病的發生。隨著社會進步和環境變化,特應性疾病的流行趨勢增加,據估計,40%以上的世界人口處于特應性超敏性狀態。世界衛生組織(WHO)已明確規定,將變化(過敏)反應病列為全球性重點防治的疾病,但目前還沒有發現令人滿意的治療方法,以改變該類疾病的自然過程。本文采用斑點酶免疫分析法,對臨床上有過敏性炎癥患者進行了吸入性過敏原測定,以了解本地區過敏原患者的過敏原分布。

  1 材料與方法    

  1.1 檢測標本 295份血清取自我院門診兒科、皮膚科及耳鼻喉科和住院兒科病人。男172例,女123例。年齡6個月~65歲,平均年齡31歲。其中哮喘患者131例;過敏性鼻炎85例;肺炎、支氣管炎30例;蕁麻疹等過敏癥25例及其它疾病24例。   

  1.2 血清總IgE定量測定 采用速率散射比濁法。檢測試劑購自美國DADE BEHRING公司,檢測儀器為BNProSpec(DADE BEHRING)。正常參考范圍:IgE<150KU/L。 1.3 過敏原特異性IgE檢測 采用斑點酶免疫分析法。檢測試劑IVT購自北京海奧公司。試劑組合如下:總IgE,D1塵螨、D2粉螨,M1點青霉、M6交鏈孢霉,十字花,16蟑螂,F9禾木,T14楊樹、T11梧桐。

  2 結果    

  2.1 兩種測定結果比較 295例患者血清IgE定量測定結果與斑點酶免疫法檢測的總IgE和特異性IgE結果比較顯示:血清IgE定量>150KU/L時,總IgE和過敏原抗體同時陽性的為142例,陽性率為48.14%。總IgE陽性,過敏原抗體陰性的18例,陽性率為6.1%。而總IgE陰性,過敏原陽性的有1例,陽性率為0.003%。血清IgE定量<150KU/L時,總IgE和過敏原抗體同時陽性為35例,陽性率為11.8%。總IgE陽性,過敏原抗體陰性的有52例,陽性率為17.6%。而總IgE和過敏原抗體均陰性的47例,陽性率為15.3%,見表1。    

  表1 295例患者血清IgE定量測定結果與斑點酶免疫法檢測的總IgE和特異性IgE結果比較(略)   

  2.2 特異性IgE檢測陽性病例的疾病譜分布 見表2,在過敏原特異性IgE陽性的病例中,蕁麻疹等過敏癥的陽性率最高,25例中有18例陽性,陽性率為72%。其余依次為哮喘69.47%(91/131)、過敏性鼻炎57.65%(49/85)、肺炎、支氣管炎36.67%(11/30)、其它疾病33.33%(8/24)。    

  表2 特異性IgE檢測陽性病例的疾病譜分布(略)   

  2.3 各種過敏原的陽性率 見表3。在我院的臨床檢測中,過敏原的陽性率為塵螨、粉螨最高,其余依次為蟑螂、風揚、梧桐,十字花,禾本,點青霉,交鏈孢霉,見表3。    

  表3 各種過敏原的陽性率(略)    

  2.4 過敏原抗體的表現模式 見表4。過敏原抗體的表現模式以單個過敏原陽性和兩個過敏原陽性為主,單獨陽性的過敏原占51.98%,兩個過敏原抗體同時陽性占34.46%,三個過敏原同時陽性的占9.6%。   

  表4 過敏原特異性IgE陽性的表現模式(略)    

  3 討論    

  IgE是過敏性疾病的重要標志,目前研究已充分表明IgE在過敏性疾病的炎癥反應中起著重要的作用。IgE有兩種受體:一種為高親和力受體(FcεRI)存在于肥大細胞和嗜堿性粒細胞及抗原提呈細胞表面,其調節IgE產生的作用小,主要作用是延長IgE的半衰期,在抗原提呈的部位放大IgE的生物效應。另一種受體為低親和力受體(FcεRⅡ),主要存在于B細胞表面,調控IgE的合成,FcεRI與IgE的親和力比FcεRII與IgE的親和力高10~100倍。IgE通過FcεRII直接作用并誘導變應原特異性Th2細胞發育、活化,分泌IL-4、IL-5等細胞因子,進一步促進B細胞產生IgE,而IgE親和到肥大細胞和嗜酸性粒細胞上并與相應的抗原結合,使肥大細胞和嗜酸性細胞釋放化學活性物質而引起一系列的速發型過敏反應。本文的實驗結果過敏性特異性IgE陽性病例以蕁麻疹為最高(72%),其次是哮喘患者(69.47%)、過敏性鼻炎(57.65%)。而過敏原的陽性率為塵螨、粉螨最高,陽性率為(74.58%),這些結果與國內文獻相符 [1~2] ,同時顯示本地區的高流行的過敏原種類與其它地區無差別。   

  我們的結果還顯示,當IgE定量>150KU/L斑點酶免疫法的總IgE陽性和特異性IgE同時陽性占48.14%,陽性率不高,而IgE定量和總IgE同時陽性的為60%。這兩者之間的差異可能還有其它的過敏原特異性IgE存在。而IgE定量<150KU/L時,總IgE有52例(17.63%)陽性,而總IgE和特異性IgE同時陽性的有35例(11.84%),一般來說IgE水平的高低和過敏性疾病的關系密切,高水平者發生過敏性疾病的機會多 [3] ,本組出現的情況可能患者體內有過敏原的存在,但產生的IgE量少,所以對于過敏性患者,應該IgE定量與特異性IgE同時檢測,這樣才能提高過敏原檢出率。 

  【參考文獻】    

  1 林志斌,李添應.Mast過敏原檢測系統在常年性過敏性鼻炎診斷中應用.中華微生物學和免疫學雜志,2001,21(增刊):93.

  2 黨倩麗,陸學東,張小艷.慢性蕁麻疹患者血清IL-4,IFN-r及IgE水平觀察.臨床皮膚科雜志,2000,29(4):208-209.   

  3 Croner S,Kjellman NIM,Eriksson B,et al.IgE screeming in1701new-born infants and the development of atopic disease during infancy.Arch Dis child,1982,57:364-368.      

  作者單位:200433上海,上海長海醫院實驗診斷科

  (編輯:李 弋)

日期:2005年12月26日 - 來自[2005年第6卷第14期]欄目

研究表明室內過敏原可污染哮喘患兒的噴霧器

2005年12月09日 醫業網 10 美國研究者報告,室內過敏原可污染哮喘患兒的噴霧器,使敏感個體產生嚴重后果。
馬里蘭大學醫學院Mary E. Bollinger博士及其同事在11月的《過敏、哮喘和免疫學年鑒》(Ann Allergy Asthma Immunol 2005;95:429-432)上指出,他們曾經報告過2例因使用蟑螂過敏原污染的噴霧器而發生威脅生命的哮喘加重的病例。預防過敏原暴露的最好儲存方法仍然不清楚。為了確定這種和其它常見室內過敏原水平是否可污染家用噴霧器,護士將噴霧器放到參加哮喘研究的城內兒童的20個家庭中。然后檢測噴霧器中的貓、狗、小鼠和蟑螂過敏原。
有17個噴霧器的樣本可用于檢測過敏原,5個含有至少一種可測得水平的過敏原。研究者還將噴霧器儲罐放到有貓或狗的研究參加者的家中。3個有貓的家庭2個噴霧器被貓過敏原污染,2個有狗的家庭1個噴霧器被污染。當研究者將儲罐密封在塑料帶中放到相同家庭中時,則未發現過敏原。
研究者總結說,這個方法似乎有效。但是還不清楚這種儲存技術是否可防止噴霧器污染蟑螂過敏原,以及是否可促使噴霧器暴露于霉菌和其它過敏原。
日期:2005年12月10日 - 來自[呼吸系統相關]欄目

慢性鼻竇炎患者血清特異性IgE的檢測分析

  【摘要】  目的  探討IVT過敏原體外檢測系統在診治慢性鼻竇炎患者中所起的作用。方法  用IVT過敏原體外檢測系統對36例慢性鼻竇炎患者的血清進行特異性IgE及過敏原的檢測。結果  36例慢性鼻竇炎血清特異性IgE檢測陽性率為6108%,過敏原陽性檢出率為80.56%,最常見的吸入性過敏原為屋塵螨、粉塵螨、青霉等;食入性過敏原為41.67%,最常見的過敏原為牛奶、花生、大豆、蟹、蝦等。大部分患者對2種以上的過敏原過敏。結論  慢性鼻竇炎與過敏原尤其是吸入性過敏原有關。血清特異性IgE可能在慢性鼻竇炎患者臨床診療中起著作用,采用IVT過敏原體外檢測系統檢測血清特異性IgE及過敏原對慢性鼻竇炎臨床診斷和治療有一定的參考價值。

  【關鍵詞】  慢性鼻竇炎;過敏原;特異性IgE
   
  Analysis of detection of the serum level particular IgE in patient with chronic sinusitis

  GONG Qi,ZHANG Ru-xin,ZHAO Hai-ying,et al.

  Department of Otorhinolaryngology,Jiangwan Hospital,Shanghai 200434,China

  【Abstract】  Objective  To evaluate the value of using IVT allergen out-body detection system to examine the serum level of particular IgE in patient with chronic sinusitis.Methods  To examine the serum level of special IgE in 36 patients with chronic sinusitis by IVT allergen out-body detection system.Results  The positive rate of inspiratory allergen was 61.08% in 36 cases,most of them was room dust mite,powder mite,mildew.The positive rate of edible allergen was 33.3%,most of them was milk,peanut,soja,crab,shrimp,most patients were sensitive to two or more allergens.Conclusion  Chronic sinusitis was relative to allergen,especially inspiratory allergen.The detection of serum level of particular IgE have important reference value to clinical diagnosis and therapy.

  【Key words】  chronic sinusitis;allergen;particular IgE
   
  我科從2001年6月起,采用美國ASI公司的IVT過敏原體外檢測試劑盒對36例慢性鼻竇炎患者的血清進行了特異性IgE(sIgE)檢測(入選前2周未服抗組胺藥及全身應用糖皮質激素治療),現將結果報告如下。

  1  資料與方法

  1.1  一般資料  參照1997年海口標準[1],2001~2004年在我院確診為慢性鼻竇炎患者36例,其中男31例,女5例,年齡7~77歲,平均364歲。病程2~48個月,平均117個月。絕大部分患者無法提供明確的誘因或接觸史。

  1.2  特異性IgE的檢測方法  采用美國ASI公司的IVT過敏原體外檢測試劑盒,抽取患者靜脈血5ml,分離血清,按試劑盒操作說明書檢測,包括血清吸附、清洗、酶標、加底物顯色(紫色為陽性,陰性結果的顏色與其兩邊隔離帶的顏色一樣),判讀總IgE及特異性IgE、過敏原,結果以定性半定量記錄:無過敏反應(總IgE水平低)、中等過敏反應(總IgE水平升高)、高等過敏反應(總IgE水平明顯升高)。

  2  結果

  36例慢性鼻竇炎患者血清特異性IgE的檢測陽性率為61.08%,吸入性過敏原和食入性過敏原的總IgE陽性率分別為80.56%(29/36)和41.67%(15/36)。主要特異性過敏原陽性率詳見表1、表2(36例中10例有明確的食物過敏史,不計入食物組特異性過敏原的檢測統計)。

  表1  吸入組特異性過敏原檢測結果 略

  表2  食入組特異性過敏原檢測結果 略

  3  討論

  慢性鼻竇炎是一種常見的疾病,病因較多,變態反應性因素就是其中一種[2],Emanue等指出:變態反應性鼻炎特別是常年性變態反應性鼻炎可能對慢性鼻竇炎的進程起到促進作用[3]。本實驗結果:有吸入性過敏原(吸入組)陽性的患者36例,占總數的80.6%,其中主要是人們日常接觸的塵螨,最常見的吸入性過敏原為屋塵螨、粉塵螨、草本植物、青霉等;食入性過敏原(食入組)15例,占4167%,最常見的過敏原為牛奶、花生、大豆、蟹、蝦等。大部分患者對2種以上的過敏原過敏。提示慢性鼻竇炎與過敏原有密切的關系,表明吸入物和食物仍是目前誘發慢性鼻竇炎的一個重要病因,尤其是與吸入性過敏原有關。

  特異性IgE抗體存在于具有過敏體質的個體的血清中,患者血清中只要有針對其中一種過敏原的特異性IgE(濃度≥91u/ml)即可呈陽性反應,避免逐個單項檢測所帶來的盲目性,而在體外檢測避免了體內各種因素的干擾,減少了假陰性和假陽性的出現,避免了采用皮膚試驗所引起的局部或全身反應等不良反應。本試驗采用的IVT過敏原體外檢測試劑盒是Phadiatop試驗[4]的改良版,具有安全、快速、方便、可靠、特異性強等優點[5],對患者血清中總IgE水平的定量測定可以為判定機體對過敏原的易感性提供有價值的信息,其IVT過敏原體外檢測系統采用定性檢測血清中不同過敏原的特異IgE,能幫助推測該患者是否為特異性個體,而各過敏原的檢出,能使患者在今后生活中更好地注意避免接觸過敏原,故血清特異性IgE檢測對慢性鼻竇炎的臨床診治和預后具有指導作用。

  【參考文獻】

  1  中華醫學會耳鼻咽喉科分會,中華耳鼻咽喉科雜志編輯委員會.慢性鼻竇炎鼻息肉臨床分型分期及內窺鏡鼻竇手術療效評定標準(1997,海口).中華耳鼻咽喉科雜志,1998,33:134.

  2  黃選兆,汪吉寶.實用耳鼻咽喉科學.北京:人民衛生出版社,2002,208-209.

  3  Emanuell A,Shah SL.Chronic rhinosinusitis Allergy and sinus computed tomography relationship.Otolaryngol Head Neck Surg,2000,123:687-691.

  4  Williams PS,Siegel C,Portnoy.Efficacy of a single diagnostic test for sensitization to common allergens.Ann Allergy Asthma Immunol,2001,86(2):196-202.

  5  秦洪義.IVT檢測變態反應疾病的臨床應用評價.中國實用免疫變態反應和哮喘雜志,2000,4(2):70-71.

  作者單位:1 200434 上海,上海市江灣醫院耳鼻咽喉科

       2 200433 上海,第二軍醫大學附屬長海醫院耳鼻咽喉科

  (編輯:子  涵)

日期:2005年11月13日 - 來自[2005年第2卷第3期]欄目

IVT檢測過敏性鼻炎患者血清中吸入性過敏原結果分析

   【摘要】 目的 采用IVT試劑盒體外檢測過敏原,以診斷過敏性鼻炎患者。方法 為2001年3月門診疑似過敏性鼻炎患者94例作此項檢測。結果 陽性者81例,占總數的86.17%,總IgE水平升高;陰性者13例,占13.83%。結論 其結果表明吸入性過敏原與過敏性鼻炎密切相關。體外檢測過敏性鼻炎IVT方法可用于臨床。

   關鍵詞 IVT 過敏性鼻炎 吸入性過敏原

   過敏性鼻炎是耳鼻喉科常見的疾病,據國外統計,人口中有10%患有變態反應性疾病,且一人常患有數種變態反應性病,變態反應性病實為一全身疾病而具有顯著局部癥狀者,影響身體各處組織,但其病變具有高度選擇性,因多數患者缺乏明確的病因,為了進一步了解吸入性過敏原在過敏性鼻炎發病中的意義,我們采用吸入性過敏原體外篩選系統(In vitro test,IVT) [1] 過敏性鼻炎患者血清中特異性的IgE(sIgE)進行定性檢測,現將結果報告如下。

   1 資料與方法

   1.1 一般資料 檢測對象為2001年3月~2003年3月來我院門診就診疑似過敏性鼻炎患者94例,男38,女56例,最小年齡7歲,最大年齡54歲,平均35.1歲。所有患者均有反復鼻塞、打噴涕、鼻癢、流清涕病史,檢查見鼻粘膜灰白色,有清水樣鼻涕。病程>8個月,1個月內停用抗過敏藥物為納入標準。

   1.2 方法 根據酶聯免疫分析的方法,采用美國ASI公司生產的吸入性過敏原體外檢測試劑盒(IVT701試劑盒)該試劑盒供體外檢測過敏原使用,其中的反應細管反應代表面包被有不溶性吸入性過敏原或其混合物,包括屋塵、螨、霉菌、豚草、蒿屬植物/艾蒿、榆/楊/柳樹。具體方法是,從冰箱中取出IVT701酶免反應管用注射器將管中緩沖液排出。吸入受檢血清,置18℃~30℃孵箱,反應100min后取出,棄去血清,用洗滌液沖洗1次,再吸入酶標記物結合物,放于18℃~30℃16h,棄去結合物,以洗滌液洗3次,后將管頭部擦拭干凈,吸入底物,18℃~30℃放5min后,第一次觀察結果。強陽性可顯示明顯紫色反應,弱陽性反應可繼續放置18℃~30℃,直到90min。最終判斷,陽性為紫色,陰性為黃色。6項吸入性過敏原(屋塵+螨+霉菌+豚草+蒿屬植物/艾蒿+榆/楊/柳樹)陰性者13例,占13.78%。其余陽性者81例,總IgE水平都增高。2 結果見表1~表4。表1 1項吸入性過敏原陽性結果(略)

   2 討論

   吸入性過敏原是一些肉眼看不見的微小蛋白顆粒,廣泛分布于環境中,可能是誘發、加重過敏性鼻炎的重要原因。IVT是利用酶聯免疫分析法進行體外檢測過敏原,與以往國內采用的皮膚斑貼法及用過敏原浸出液皮內點刺或劃痕試驗的方法相比較具有安全、快速、方便、可靠、特異性高的優點,適用于任何年齡,無性別差異。本試驗結果顯示,94例過敏性鼻炎患者血清吸入性過敏原檢測1項到6項陰性者13例,占13.83%,而1項到4項陽性者81例,占86.17%。這一結果表明吸入性過敏原與過敏性鼻炎密切相關。94例過敏性鼻炎患者中,有1項過敏原陽性者25例,占總數的26.60%,其中霉菌相對較高,占總數的23.40%;2項過敏原陽性者28例,占總數的29.79%,其中螨+霉菌相對較高,占總數的6.38%,其次是屋塵+螨及霉菌+榆/楊/柳樹,分別占5.32%,及4.26%。3項過敏原陽性者23例,占總數的24.47%,其中霉菌+豚草+榆/楊/柳樹相對較高。其次是屋塵+螨+榆/楊/柳樹及屋塵+霉菌+蒿屬植物/艾蒿。4項吸入性過敏原陽性人數5例。表4中過敏原表4 4項吸入性過敏原陽性結果吸入性過敏原 陽性(略)陽性數相差不大。過敏原陰性者13例,占總數的13.83%、提示過敏性鼻炎可由吸入性過敏原(屋塵、螨、霉菌、豚草、楊/柳/榆樹,蒿屬植物)以外的其它因素引起。筆者的試驗結果表明過敏性鼻炎與吸入性過敏原中的一項或幾項有關,為過敏性鼻炎的防 治提供了理論依據。

   參考文獻

   1 秦洪義.IVT檢測變態反應病臨床應用評價.中國實用免疫變態反應和哮喘雜志,2000,4(2):70-71.

   作者單位:610070四川省人民醫院耳鼻喉科(臨床實驗中心)

   (收稿日期:2003-04-15)

   (編輯楊 柳)

日期:2005年11月13日 - 來自[2004年第1卷第1期]欄目

蕁麻疹、濕疹ITV特異性過敏原檢測127例分析

  蕁麻疹、濕疹是皮膚科中常見、多發的過敏性疾病,其病因多而復雜,患者往往難以找到明確的原因,給治療帶來一定困難。為了進一步了解吸入性、食入性過敏原在蕁麻疹、濕疹中的意義,有效治療和預防這類疾病,筆者對127例蕁麻疹、濕疹患者進行了血清特異性IgE的檢測,現將結果報告如下。

  1 資料與方法
    
  1.1 一般資料 127例患者均選自我院2002年6月~2004年6月皮膚科門診。男50例,女77例;年齡4~70歲;病程2個月~10年。其中蕁麻疹72例,濕疹55例。
   
  1.2 試劑 IVT試劑盒(美國ASI公司產品,購自北京海奧生物技術有限公司),包括反應管、結合液、清洗液、指示劑等。采用反應管IVT401含IgE、屋塵、塵螨、點青霉、交鏈孢霉、黑根霉過敏原;IVT706含螃蟹、蝦、龍蝦、帶魚、鱈魚、牛肉、羊肉、雞肉、牛奶、蛋黃、蛋白、大豆、花生、大馬哈魚、大比目魚、扇貝、干貝過敏原。
   
  1.3 標本收集 取患者肘靜脈血3ml,留取血清作為標本,患者無須禁食、停用抗組胺藥。血清可在2℃~8℃保存5天。
   
  1.4 操作步驟 將血清標本注入反應管,室溫孵育90~100min,清洗反應管后加入綠色結合液,再孵育16h,然后再清洗加入底物顯色,0~90min內觀察顏色變化。
   
  1.5 結果判斷 本試劑盒是一種體外定性的酶免疫分析法,可同時獨立地檢測各種常見的過敏原反應,并可估計人血清或血漿中IgE的總水平。判斷標準:(參照IVT試劑盒說明書)總IgE黃到灰(低IgE≤30u/ml),紫[正常總IgE=(60±30)u/ml],深紫(高IgE>90u/ml)。特異性IgE(自定義)黃色為陰性,灰到紫色均為陽性。

  2 結果

  見表1、表2。
    
  表1 127例蕁麻疹、濕疹患者血清總IgE水平情況(略)
   
  表2 127例蕁麻疹、濕疹患者過敏原檢測結果(略)
    
  3 討論
    
  蕁麻疹、濕疹皮膚病的發生,主要通過變態反應及非變態反應兩條途徑,前者為機體接觸過敏原后發生Ⅰ型或Ⅲ型變態反應致病,后者為過敏原直接進入體內,刺激肥大細胞釋放組胺致病,由此過敏原的作用是發病的關鍵,若能及時檢測出患者的過敏原,對預防和治療這類疾病極有意義。
   
  IVT試劑盒檢測顯示,127例患者血清總IgE水平高出正常范圍者,蕁麻疹者僅占29.17%,濕疹者僅占36.36%,由此可見蕁麻疹、濕疹患者大多數血清總IgE水平不一定會增高 [1] ,因此對特異性IgE檢測更為重要。本文127例蕁麻疹、濕疹患者吸入性過敏原陽性率最高為塵螨、粉螨(蕁麻疹者中45.83%、濕疹者中49.09%),其次是點青霉類(蕁麻疹者中27.78%、濕疹者中25.45%)。這結果與國內詹氏、孫氏報道結果相近 [2,3] 。食入性過敏原陽性率最高為大馬哈魚、大比目魚、扇貝/干貝(蕁麻疹者占33.33%,濕疹占29.09%),其次為鱈魚、帶魚、金槍魚(蕁麻疹占27.78%)和螃蟹、蝦、龍蝦(濕疹占21.82%)。這可能與本地的飲食習慣有關,應引起臨床醫生和患者的重視,有望在治愈過敏性疾病中起到一定的作用。
   
  此外,IVT檢測法較以往采用的皮膚斑貼試驗、點刺試驗和皮內試驗等既安全、操作又方便,患者接受檢測前不需要停用抗組胺藥,所以說該檢測是一個較好的診斷手段,值得推廣應用。
    
  參考文獻
    
  1 金貴和,宋芳,李惠剛,等.蕁麻疹抗原皮試及血清總IgE含量測定的初步分析.臨床皮膚科雜志,1999,28(2):96-97.
    
  2 詹青松,張文玉,王慈賢.432例慢性蕁麻疹的抗原皮試及脫敏療效分析.中華皮膚科雜志,1992,25(6):383-384.
   
  3 孫廷泉,郝淑蘭,董淑貞,等.1452例慢性蕁麻疹的變應原皮試及脫敏療效分析.中國皮膚性病學雜志,1997,11(3):153-154.
    
  (編輯朝 顏)

  作者單位:200021上海曙光醫院皮膚科 

日期:2005年11月8日 - 來自[2004年第1卷第4期]欄目

過敏性皮膚病患者546例血清吸入性過敏原IgE結果分析

  【摘要】 目的 了解吸入性過敏原與某些皮膚病的關系。方法 采用IVT過敏原體外檢測試劑盒對546例患者進行吸入性過敏原IgE檢測。結果 對1種或1種以上抗原出現陽性反應的總陽性率為71.2%(389/546)。其中蕁麻疹79.7%(192/241),濕疹70.8%(160/226),異位性皮炎46.8%(37/79),均顯著高于對照組(P<0.01)。結論 提示吸入性過敏原IgE誘發Ⅰ型變態反應,刺激肥大細胞釋放組胺造成蕁麻疹、濕疹和異位性皮炎。對臨床上原因不明的過敏應做吸入性過敏原試驗,明確致病物質,從而控制發病率。

  關鍵詞 吸入性過敏原 特異性IgE 蕁麻疹 濕疹 異位性皮炎

   Analysis on serum aeroallergen-specific IgE in546allergic patients  

   Wang Guoli,Zhong Xuanqiong,Sun Fuzhong,et al.

   Sichuan Provincial Institute of Dermatology and Venereal Disease Hospital,Chengdu610031.

  【Abstract】 Objective To investigate the relation between inhaled allergen and some skin disease.Methods 546patients were examined by IVT aeroallergen test reagent box.Results In theinhaled IgE positive patients.One or more aeroallergens were positive,the total positive rate was71.2%(389/546),79.7%(192/241)in urticaria,70.8%(160/226)in eczema,46.8%(37/79)in topic dermatitis.All of them were higher than that of health control,with staˉtistical ignificance(P<0.01).Conclusion It suggests that aeroallergens-specific IgE,induce typeⅠallergic reacˉtion and stimulate mast cell releasing histamine which is the cause of urticaria,eczema and atopic dermatitis.While meetˉing idiopatihic allergic reaction in clinical practice,it can be done to allergic test should be in order to find allergen and control of these disease.

   Key words aeroallergens specific IgE urticaria eczema atopic dermatitis 

  近年來過敏性皮膚病,其病因趨于復雜,且易受外界環境的影響,極大影響了患者的生活質量。為明確致病物質,了解吸入性過敏原在過敏性皮膚病的臨床意義,對546例過敏性皮膚病患者吸入性過敏血清中屋塵、塵螨、霉菌、豚草花粉、艾蒿花粉、樹枝花粉6種常見吸入性過敏原IgE進行檢測,現報告如下。

  1 資料與方法

   1.1 研究對象 2001~2004年3月對四川省皮膚病性病防治研究所門診就診的546例患者,其中包括懷疑為吸入性過敏引起的蕁麻疹241例(包括慢性蕁麻疹155例和急性蕁麻疹86例),濕疹226例(包括慢性濕疹131例和急性濕疹95例),異位性皮炎79例。女360例(66.9%),男186例(34.1%),平均年齡21.1歲(2~68歲),病程3天~18年,均未接受過皮質類固醇激素或免疫抑制劑治療,病例選擇標準參考文獻 [1]  。

   1.2 健康對照 為所內體檢健康者20例,男3例,女17例,平均年齡為20歲(17~46歲),個人和家族成員均無過敏性皮膚病及其他異位性疾病。

  1.3 IVT過敏原體外檢測方法 選用美國ASI公司生產的吸入性過敏原體外檢測試劑盒(IVT701),包括屋塵、塵螨、霉菌、豚草花粉、艾蒿花粉、樹枝花粉抗原IgE檢測,取受檢者血清,經過加樣清洗,酶液結合,再清洗,顯色后結合陽性對照,判讀結果,紫色為陽性,黃色為陰性。

   1.4 統計學方法 各組間的陽性率差采用χ 2 檢驗進行統計分析。

  2 結果

  2.1 546例過敏性皮膚患者與20例對照組的吸入性過敏原檢測陽性結果 見表1。  546例過敏性皮膚病(蕁麻疹、濕疹、異位性皮炎)患者中屋塵和塵螨占的陽性率最高,分別占42.1%和36.1%,其后依次是霉菌占22.7%(P<0.05),豚草花粉占21.6%,艾蒿花粉占15.8%,樹枝花粉占9.2%,各種過敏原的陽性率均顯著高于正常對照組(P<0.01)。    表1 過敏性皮膚病與對照組吸入性過敏原IgE試驗陽性結果 (略)注:與對照組比較, ˇˇ P<0.05, ˇ P<0.01 

  2.2 三種過敏性皮膚病患者與對照組吸入性過敏原IgE檢測陽性結果 見表2。546例病人的吸入性過敏原IgE檢測結果表明有389例對1種或1種以上抗原出現陽性反應,總陽性率為71.2%,其中蕁麻疹陽性率為79.7%(192/241),濕疹陽性率為70.8%(160/226);異位性皮炎為46.8%(37/79),均顯著高于對照組(P<0.01)。 表2 三種過敏性皮膚病與對照組吸入性過敏原IgE陽性反應 例(略)注:各組檢測陽性率平均高于健康對照組(P<0.05)

  3 討論

吸入性過敏原屋塵、塵螨、霉菌、花粉等廣泛存在于自然環境中,目前引起的過敏性皮膚病的發病率有逐年增加的趨勢。由此本文對546例過敏性皮膚病患者進行檢測,結果顯示過敏性皮膚病以屋塵(42.1%)和塵螨6.1%),霉菌(22.2%)的陽性反應最高,其次是豚草花粉(21.6%),艾蒿花粉(15.8%),樹枝花粉(9.2%),其陽性率明顯均明顯高于對照組( ˇˇ P<0.05, ˇ P<0.01)。此結果與國內的其他報道基本一致 [2]  。6種常見的吸入性過敏原IgE對蕁麻疹、濕疹、異位性皮炎測定結果,發現蕁麻疹和濕疹的屋塵陽性率為最高,分別為40.7%和46.0%,異位性皮炎屋塵的陽性率也最高為41.8%。不同過敏原陽性率均明顯高于對照組(P<0.05),其結果如與國內報道大致相似 [3]  。提示吸入性過敏原特異性IgE可能是誘發和加重過敏性皮膚病潛在的因素,相當一部分患者中與吸入性過敏原致敏有關。結果還表明濕疹與吸入性過敏原有關,是否是患者再次接觸過敏原時發生速發型變態反應的遲發相反應,尚待進一步探討。另外,本組病例結果    中發現對1種或1種以上抗原出現陽性反應,總陽 性率為71.2%,其中蕁麻疹組為79.7%,濕疹組為70.8%,異位性皮炎組為46.8%。我們檢測結果陽性,顯示均顯著高于健康對照組(P<0.01),再一次提示吸入性過敏原特異性IgE是引起Ⅰ型變態反應,誘發皮膚肥大細胞釋放組胺造成蕁麻疹和濕疹及異位性皮炎的常見致病因素。因此,對疑為過敏性皮膚病,應做吸入性過敏原實驗找出可疑的過敏原,從而避免和減少吸入性過敏的發生,以達到有效控制和預防減少發病率的目的。

   此外,本組病例女性多于男性,男女之比為1∶1.49,推測可能與女性常用化妝品、衣著打扮和性激素水平有關,也可能與女性在家務勞動更多接觸致敏化學物質有關,具體原因還有待進一步探索。

   參考文獻

     1 Champion RH,Burton JL,Burns DA,et al.Texbook of Dermatology,Oxˉford London Edinburgh:Blackwell Scientific publications,1998,629-667.

    2 李大寧,劉進芬,金文,等.變應原皮膚點刺試驗在7種過敏性皮膚病中的應用.臨床皮膚科雜志,2003,32(11):653-654.

    3 馬川,李林峰,陳學榮.過敏性皮膚病患者血清吸入性過敏原特異性IgE研究.臨床皮膚科雜志,2002,31(1):15-16.

     (收稿日期:2004-07-02)

  作者單位:610031成都四川省皮膚病性病研究所醫院

  (編輯李 木)

日期:2005年11月8日 - 來自[2004年第1卷第1期]欄目

外源性哮喘過敏原皮試和脫敏治療的臨床分析

  我院呼吸科1998~2003年應用北京協和醫院過敏原提取液,對207例外源性哮喘患者進行皮膚過敏原測定,然后根據皮試結果,結合病史特點,選擇性地對156例患者進行脫敏治療。現就臨床資料較完整、連續脫敏治病1年以上的81例患者進行臨床分析。

  1 臨床資料
     
  1.1 一般資料 本組81例中,男49例,女32例,年齡9~54歲,病程7個月~28年。常年發病者52例,占64.2%,其余均為季節性發病。全年發病的最高峰為9~11月,1~3月發病率最低。
   
  1.2 皮膚試驗 選用的抗原種類有:屋塵、塵螨、春季花粉、夏秋花粉、蒿屬花粉、豚草花粉、多價霉菌、多價昆蟲、多價羽毛、多價獸毛、棉絮、蠶絲、香煙、枕墊料、床墊料等。檢查前停用相關抗平喘藥物。皮試時將抗原浸液0.01~0.02ml于上臂外側做皮內試驗,注射后15~20min觀察結果,若皮試呈陽性反應,分別以(±)、(+)(++)、(+++)、(++++)表示陽性反應程度 [1] 。根據本組陽性結果,以屋塵、霉菌、塵螨及花粉陽性率最高,分別為92.6%、83.9%、79.0%、74.0%。
   
  1.3 特異性脫敏治療及其評價 根據過敏原皮試結果,決定脫敏治療。通常采用的起始脫敏藥物濃度為:皮膚反應呈現(+)時,從1∶10 6 開始脫敏,(++)時從1∶10 8 開始,(+++)時從1∶10 10 或1∶10 12 開始。每星期皮下注射2次,每次0.1ml,逐漸增至1.0ml,10次為一療程,下次療程藥物濃度增加10倍,依次遞增達1∶10 2 ,以后進行維持脫敏治療,開始每周2次,每次0.5ml,病情穩定后逐漸延長間隔時間,改為每周1次,每2周1次,每3周1次直至每月1次。可維持脫敏治療1~2年。
   
  1.4 療效評定標準 臨床治愈:不需使用任何藥物保持無癥狀達1年以上。顯效:偶用支氣管舒張藥物以緩解喘息。有效:喘息癥狀減輕一半以上,但常需藥物治療。無效:癥狀無改善。
   
  1.5 結果 本組病例經脫敏治療1年以上,81例中臨床治愈12例(14.8%),顯效21例(25.9%),有效44例(54.3%),無效4(4.9%),總有效率為95.1%。療效與療程呈正比,療程長者療效鞏固,如33例治愈和顯效者脫敏時間均超過2年。
     
  2 討論
    
  支氣管哮喘是臨床上的常見病,發病率較高,該病病因和發病機制尚未完全清楚,因而仍無根治辦法。而脫敏治療對外源性哮喘是一種行之有效的方法,它具有病因治療與病因預防的雙重作用,通過脫敏治療可使體內反應素(IgE)水平降低,封閉抗體逐漸增多,當同類抗原再次進入機體時,即與封閉抗體結合成復合物,而不能與反應結合素結合,由此避免哮喘反復發作 [1] 。
   
  脫敏治療的前提是正確認定過敏原種類,因此在進行皮內試驗時,要切實防止假陽性反應或假陰性反應,患者在皮試前要處于病情緩解期,且應停用抗組胺藥及糖皮質激素,并在抗原皮試的同時,應用生理鹽水作空白對照,以除外皮膚非特異性反應。
   
  鑒于脫敏治療起效慢、療程長,常在6個月以上才出現療效,因此需要患者的充分合作,要持之以恒,療效也往往隨著療程延長而逐步增加。
   
  本科開展脫敏治療5年來,迄今未發生因脫敏注射而造成嚴重副作用。所以該療法只要掌握得當,解釋清楚,脫敏中嚴密觀察患者,一般來說是完全可靠的。
    
  參考文獻
    
  1 顧瑞金.變態反應病診斷治病學.北京:北京醫科大學、中國協和醫科大學聯合出版社,1998,25.    

  作者單位:432400湖北省應城市人民醫院

    (收稿日期:2004-10-15) (編輯含 秋)

日期:2005年9月22日 - 來自[2004年第2卷第12B期]欄目

戶塵螨過敏原雙向免疫印跡指紋圖譜研究

  【摘要】 目的 利用雙向電泳及雙向免疫印跡技術研究戶塵螨過敏原。方法 純種戶塵螨螨體原料購自Allergon,Inc.,ngelholm,Sweden。用Trizol法提取純種戶塵螨螨體蛋白,用二喹啉甲酸(BCA)檢測法測定蛋白質含量,雙向電泳及雙向免疫印跡技術確定戶塵螨過敏原。結果 等電點和分子量分別為5.4,25.6KD的過敏原組分(以下表示方法相同)對應于Der p1;7.6~9.0,15.2KD對應于Der p2;8.1~8.5,28.5~28.6KD對應于Der p3;6.5~7.0,61.0~62.0KD對應于Der p4;7.0~7.3,14.8KD對應于Der p5;5.9~6.1,25.5~25.8KD對應于Der p6;6.9~7.1,26.5KD對應于Der p7;6.8~7.0,24.9KD對應于Der p8;8.8,28.1KD對應于Der p9;6.5~6.8,36.4KD對應于Der p10。與Le Mao一文比較 [3]  ,本實驗發現了與c、d、e、f點相似特征的C、D、E、F點,它們分別為:C點:8.4~8.9和20KD;D點:7.4~8.5,37.6~38.6KD,Le Mao的d點等電點只有7.6,本實驗D點等電點比Le Mao實驗的范圍要大;E點:7.0~7.6,40.5~41.5KD;F點:5.3,43.8KD。本實驗首次在雙向電泳及其雙向印跡中,證實6.5~6.9,175~180KD的過敏原組分對應于Der p14。本實驗新發現5個組分:G點:6.9~7.3和90~93KD為Der p11。H點:7.1~7.5和69.7~70.7KD為Der p18。I點:9.0和14.8KD,可能為Der p5的亞型;J點:等電點為9.0,分子量小于14KD,此過敏原組分可能為大過敏原分子降解后的片段。K點:6.98~7.38,57.0~56.0KD為Der p16。結論 戶塵螨過敏原雙向電泳指紋圖譜可同時直觀顯示戶塵螨過敏原的等電點和分子量。Der p14的成功分離和其它新分離的過敏組分顯示用Trizol液提取戶塵螨可獲得更多的過敏原組分。

  關鍵詞 戶塵螨 過敏原 雙向電泳 免疫印跡
     
  Study on finger printing of Dermatophagoides pteronyssinus by  two-dimensional immunoblotting  
  Sun Jinlu,Zhang Hongyu,Wang Jinglan,et al.
   
  Department of Allergy,PUMC Hospital,CAMS&PUMC,Beijing100730.
   
  【Abstract】 Objective To explore Dermatophagoides pteronyssinus(D.pteronyssinus)allergens finger printˉing with two-dimensional(2D)electrophoresis and2D immunoblotting.Methods D.pteronyssinus purified mite bodies(PMB)extracts were prepared with Trizol reagent.In protein concentration assay,BCA reagents were used and2D electrophoresis and2D immunoblotting technique were done with D.pteronyssinus extract and mixed sera pool.Results Identification of IgE-binding components of D.pteronyssinus(Der p)PMB with MS pool were as follows:Der p1(pI5.4,Mr=25.6KD),Der p2(pI7.6~9.0,Mr=15.2KD),Der p3(pI8.1~8.5,Mr=28.5~28.6KD),Der p4(pI6.5~7.0,Mr=61.0~62.0KD),Der p5(pI7.0~7.3,Mr=14.8KD),Der p6(pI5.8~6.1,Mr=25.5~25.8KD),Der p7(pI6.9~7.1,Mr=26.5KD),Der p8(pI6.8~7.0,Mr=24.9KD),Der p9(pI8.8,Mr=28.1KD),Der p10(pI6.5~6.8,Mr=36.4KD)。Some allergens similar to Le Mao described:C(pI8.4~8.9,Mr=20KD);D(pI7.4~8.5,Mr=37.6~38.6KD),E(pI7.0~7.6,Mr=40.5~41.5KD);F(pI5.3,Mr=43.8KD).Der p14(pI6.5~6.9,175~180KD)was initially showed in2D immunoblotting in this study.We found5new componts Der p11(pI6.9~7.3,Mr=90~93KD),Der p16(pI6.98~7.38,Mr=57.0~56.0KD),Der p18(pI7.1~7.5,Mr=69.7~70.7KD),isoform of Der p5(9.0,Mr=14.8KD).Conclusion D.pteronyssinus alˉlergens in2D finger printing could be seen their pI and Mr at the same map.In addition,Derp14and other new components immunoblotted showed that more components immunoblotted in D.pteronyssinus could be found if we exˉtract it with Trizol reagent.
   
  Key words Dermatophagoides pteronyssinus allergen two-dimensional electrophoresis immunoblotting.  

  塵螨是最重要吸入物過敏原之一,塵螨過敏反應的發病率不斷增加,日益受到人們重視。塵螨過敏可表現為過敏性鼻炎、過敏性哮喘、濕疹、特應性皮炎、蕁麻疹、皮膚瘙癢等。因此,有關塵螨的研究一直是變態反應學的研究熱點 [1]  。塵螨蛋白提取的方法有很多,例如:傳統的Coca’s液、PBS、去垢劑等。在使用去垢劑如SDS、SB3-14(Zwittergent3-14)后,人們發現越來越多的過敏原成分 [2,3]  。螨的浸出液可用于特異性診斷和治療。因此,在塵螨蛋白的提取中,盡量提取到所有的過敏原組分一直是人們最關心的問題。筆者在比較Coca’s液、裂解液及Trizol法提取戶塵螨蛋白效果的基礎上 [4]  ,進一步采用雙向免疫印跡研究戶塵螨過敏原組分。
   
  1 材料與方法

  1.1 材料
   
  1.1.1 純種戶塵螨螨體(Dermatophagoides pteronyssinus)購自Allergon,Inc.,ngelholm,Sweden,批號:496500901,產品質量分析檢驗文件號:4965
   
  1.1.2 Trizol試劑 Gibco BRL購自美國Life Technologies公司。
   
  1.1.3 蛋白質含量測定試劑盒 二喹啉甲酸(BCA)檢測法,美國Pierce公司產品。
   
  1.1.4 雙向電泳試劑 30%丙烯酰胺(acrylamide)/甲叉雙丙烯酰胺(30:0.8,2.7%C)、甘氨酸(glycine)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)購自Bio-Rad公司,N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)、CHAPS購自Sigma公司,超純尿素(ultra urea)、IPG緩沖液、IPG覆蓋液、IPG干膠條(pH為3~10和4~7,L為7cm)、低分子量標準蛋白和Pharmalyte(pH為3~10)購自Amersham Pharmacia Biotech公司,預染的中分子量標準蛋白購自Pierce公司,二硫蘇糖醇(DTT)購自Promega公司,十二烷基硫酸鈉(SDS)購自日本Nacalai tesque公司,碘乙酰胺(iodoacetamide)購自Fluka公司,考馬斯亮藍R-250、PMSF購自Sigma公司,其余均為國產試劑。
   
  1.1.5 雙向電泳設備 IPGphor、附件和循環水浴、直電泳儀miniVE、mageScanner光密度儀、向電泳圖象分析軟件ImˉageMaster2D Elite3.01均為Amersham Pharmcia產品。
   
  1.1.6 轉印儀 美國Bio-Rad公司半干轉印儀(SEMI-DRY TRANSFER CELL TRANS-BLOT SD)。
   
  1.1.7 聚偏二氟乙烯(PVDF)膜 美國Bio-Rad公司。
   
  1.1.8 轉印濾紙 美國Bio-Rad公司300 #  濾紙(每張濾紙厚度約1.5mm)No930-6648。

  1.1.9 X線攝影暗匣AX-II 汕頭市粵華醫療器械廠。

  1.1.10 陽性血清池 來自戶塵螨過敏病人血清池,由20 個對戶塵螨有明顯過敏臨床癥狀的病人陽性血清(經過UˉniCap系統檢測sIgE為:d1為4~6級,d2為3級以下)等量混合而成,分裝后儲存于-40℃,臨用前復溫,避免再次凍溶。
   
  1.1.11 Tris緩沖鹽-吐溫溶液(TBST)成分為 10mM Tris-HCl(pH7.5),150mMNaCl,0.05%Tween-20。
   
  1.1.12 封閉液(5%BSA-TBST) 在100ml TBST中加入5g牛血清白蛋白。
   
  1.1.13 轉印緩沖液(Transfer Buffer) pH8.3成分為:25mM Tris3.03g,192mM Glycine14.4g0.0375%SDS,加超純水至總體積900ml,用前加10%的甲醇。
   
  1.1.14 銀染試劑盒 瑞典Amersham Pharmcia公司產品。

  1.1.15 一抗 上述陽性血清復溫后用封閉液1:10稀釋即成為一抗。
   
  1.1.16 二抗 美國Sigma公司辣根過氧化酶標記的鼠抗人IgE,購買后分裝,儲存于-40℃,臨用前復溫,用封閉液1:1000稀釋。
   
  1.1.17 化學發光試劑 購自Santa Cruz Biotechnology Inc. (Carlifonia)的Western Blotting Luminal Reagent。
   
  1.1.18 顯影液 樂凱公司顯影濃縮液1:12稀釋。

  1.1.19 定影液 樂凱公司定影濃縮液1:7稀釋。
   
  1.2 細胞破碎和蛋白溶解 取適量的純種戶塵螨螨體,放入研缽中,加入液氮,反復凍溶4次。在研缽內反復研磨凍溶后的樣品,時間約10min。
   
  1.3 戶塵螨過敏原提取 Trizol提取蛋白方法 [5]  :將研磨后的樣品按1:10比例,加入Trizol試劑,4℃高速勻漿后,進行相分離、RNA沉淀、DNA沉淀、蛋白質沉淀、漂洗蛋白質沉淀。
   
  1.4 蛋白質含量測定 冷丙酮-20℃沉淀上清液2h,離心12000g×10min,4℃;棄去上清液,用1%SDS復溶,BCA檢測法進行蛋白質含量測定。
   
  1.5 雙向電泳 有以下具體步驟(1)第一向固相pH梯度等電聚焦;(2)平衡;(3)第二向垂直平板SDS-PAGE;(4)染色:按照Amersham Pharmacia公司推薦的方法進行銀染;(5)圖象分析:考染或銀染后利用ImageScanner光學掃描儀,在256色灰度和300dpi的分辨率下,對考染或銀染的凝膠進行掃描,利用ImageMaster2D Elite3.01進行凝膠點的檢測(Spot detection)、背景消減(Background subtraction)、分子量和等電點校正、歸一化處理(Volume normalization)分析蛋白圖譜。
   
  1.6 雙向免疫印跡 (1)免疫印跡前的準備工作:將PVDF膜浸泡在甲醇中20秒,浸泡在超純水中2min,最后在轉印液中浸泡15~20min。取Bio-Rad公司300 # 濾紙2張,按凝膠大小剪好后,在轉印液中浸泡15~20min。將雙向電泳凝膠在轉印液中浸泡15~20min。(2)轉印:由下而上,按下列順序依次擺放:陽極板-1張濾紙-PVDF膜-凝膠-1張濾紙-陰極板,對齊,中間不留氣泡。限壓18V,限流0.8~1mA/cm 2 凝膠,電轉印1h10min。(3)封閉PVDF膜上的免疫球蛋白結合位點:加入15ml封閉液,輕搖1h,TBST洗膜2次,每次5min。(4)一抗與靶蛋白的結合:將PVDF膜置于小脫色盒中,按1:10比例稀釋混合的血清,4℃過夜孵育,TBST洗膜3次,每次5min。(5)與二抗反應:按1:1000比例稀釋度,加入辣根過氧化酶標記的鼠抗人lgE的單克隆抗體。室溫輕搖1h,TBST洗膜3次,每次5min。(6)化學發光:取化學發光試劑A液及B液各2ml在小脫色盒中等量混合,將PVDF膜放入盒內,讓液面沒過PVDF膜,輕搖脫色盒5min,然后取出PVDF膜,用保鮮膜包裹。將包裹好的PVDF膜置于X線攝影暗匣中,將剪好的X線片放在PVDF膜的上下各一張,曝片約2~5min。(7)顯影和定影:將底片放入顯影液,顯影3~5min。然后,放入定影液定影。最后,用超純水沖去底片表面的定影液,涼干底片。
   
  2 結果

  在Trizol法提取純種戶塵螨螨體蛋白后,經雙向電泳,再雙向免疫印跡,結果如下:
   
  如圖1和圖2示,(2D209點)等電點和分子量分別為5.4,25.6KD的過敏原組分對應于Der p1;(2D284,285,286點)7.6~9.0,15.2KD對應于Der p2;(2D186,188點)8.1~8.5,28.5~28.6KD對應于Der p3;(2D82,84,85點)6.5~7.0,61.0~62.0KD對應于Der p4;(2D295點)7.0~7.3,14.8KD對應于Der p5;(2D210,208點)5.9~6.1,25.5~25.8KD對應于Der p6;(2D204,205點)6.9~7.1,26.5KD對應于Der p7;(2D216,218點)6.8~7.0,24.9KD對應于Der p8;(2D192點)8.8,28.1KD對應于Der p9;(2D158,159點)6.5~6.8,36.4KD對應于Der p10。與Le Mao一文比較 [3]  (圖3和圖4),本實驗發現了與c、d、e、f點相似特征的C、D、E、F點,它們分別為:C點:(2D254,252,250點)8.4~8.9和20KD;D點:(2D154,152,148點)7.4~8.5,37.6~38.6KD,Le Mao的d點等電點只有7.6,本實驗D點等電點比Le Mao范圍要大;E點:(2D135,142,141點)7.0~7.6,40.5~41.5KD;F點:(2D126點)5.3,43.8KD。
   
  圖1 Trizol試劑提取純種戶塵螨螨體蛋白雙向凝膠電泳(考染掃描圖)(略)
   
  圖2 純種戶塵螨螨體蛋白雙向免疫印跡過敏原組份圖(化學發光)(略)
     
  本實驗首次在雙向電泳及其雙向印跡中,證實(2D14,17,18點)6.5~6.9,175~180KD的過敏原組分對應于Der p14。Der p14的成功分離進一步顯示用Trizol液提取塵螨可獲得更多的過敏原組分。
     
  本實驗新發現5個組分:G點:(2D46,47,50點)6.9~7.3和90~93KD為Der p11。H點:(2D70,71,72)7.1~7.5和69.7~70.7KD為Der p18。I點:(2D301)9.0和14.8KD,可能為Der p5的亞型;J點:(2D306點)等電點9.0,分子量小于14KD,此過敏原組分可能為大過敏原分子降解的片段。K點:(2D91和96)6.98~7.38,57.0~56.0KD為Der p16。

  圖3 純種戶塵螨螨體蛋白與戶塵螨過敏患者混合血清雙向免疫印跡過敏原組分示意圖(略)
   
  圖4 Le Mao粉塵螨全螨培養物雙向免疫印跡過敏原組分示意圖 [3] (略) 

  黑體顯示粉塵螨全螨培養物與戶塵螨過敏患者混合血清雙向免疫印跡的過敏原組分
   
  3 討論

  指紋圖譜或指紋法(Finger Printing) [6]  是指用各種手段得到的作為生物實體特征性狀的圖案,包括:(1)電泳或層析圖譜;(2)一組一個或多個的氨基酸模體,對蛋白質的保守區域測序時得到。目前,指紋圖譜的研究主要局限于中藥成分鑒定和蛋白質氨基酸的鑒定,本文借這一概念用于不同生物體過敏原組份的鑒定。
   
  本研究采用的是純種戶塵螨螨體(Purified mite bodies PMB)浸液,而Le Mao一文 [3]  雙向電泳及免疫印跡使用的是粉塵螨全培養物(whole mite cultures WMC)浸液與粉塵螨和戶塵螨過敏患者混合血清免疫印跡的結果,區別主要在于:螨種和螨過敏原來源兩個方面都不相同。有許多位點與他們的結果不一致是可以理解的。例如:Der p14在雙向免疫印跡中的證實和我們新發現的5個過敏原組分。
   
  塵螨的第十四組過敏原組分由Fujikawa等 [7]  首先從粉塵螨的cDNA文庫中調出來,重組后經過免疫組化及ELISA抑制試驗驗證。其分子量為177KD,又叫M-177蛋白或Mag3蛋白,存在于螨體浸液中,定位于食管的周圍組織、胃腸道和其它內臟器官,在哮喘病人的致敏中發揮作用;他們再用塵螨cDNA克隆重組的過敏原Mag3免疫兔產生的抗Mag3抗體,他們進一步研究 [8]  則發現此類過敏原組分是一種對蛋白酶敏感的過敏原,僅僅在新鮮制備的粉塵螨浸液中存在,它們降解后的產物具有更強的致敏性。
   
  Epton等 [9]  也從戶塵螨和埋內宇塵螨的cDNA序列中發現Der14的N-端有1650個氨基酸,它們與昆蟲的apolipophorins同源,此類蛋白很難溶解于水相提取液中,主要存在于血液和淋巴的脂質轉運顆粒中,它的脂質可作為增強這種過敏原免疫原性的因素發揮作用。他們 [10]  同樣也證明:Der p14存在于脂質體和脂質轉運顆粒中,僅僅存在于新鮮制備的浸液中,在水相提取時含量很少并且極易降解。對于這種疏水性的過敏原來說水相提取是不合適的。盡管這種過敏原疏水親脂,但是,能誘導IgE的高反應性和具有T細胞的高刺激性。對于無論是過敏患者還是非過敏患者的外周血單個核細胞,這類過敏原組分對T細胞的刺激反應均比Der p2高1倍多,因此,Der p14是一類非常重要的過敏原組分,迄今為止在雙向電泳和免疫印跡中還沒有Der p14的報道。
   
  Maasch等 [11]  曾經首次分別用IEF和SDS-PAGE比較了純化的戶塵螨螨體(Purified mite bodies PMB)和全螨培養物(whole mite cultures WMC)的區別。他們發現:(1)在IEF中,螨體蛋白在7.0至8.0有蛋白而全螨培養物則沒有蛋白;在SDS-PAGE中,螨體蛋白在43KD至177KD(177KD的蛋白為Mag3)之間有蛋白而全螨培養物則沒有蛋白。(2)螨體浸液的過敏原活性(allergenicity)比全螨培養物高。結合其它作者螨體單向蛋白質電泳和單向印跡 [2,12,13]  及Swiss-Prot蛋白質數據庫質譜結果,我們認為分子量為174~178KD的過敏原組分應該是Der p14。Der p14的成功分離進一步證明Trizol提取塵螨蛋白的高效性。此外,本實驗還表明雙向免疫印跡的優勢在于同時顯示過敏原Der p14的等電點和分子量,這是分別用IEF和SDS-PAGE達不到的效果。在本實驗雙向電泳中雖然有幾個高豐度的蛋白點,但雙向免疫印跡顯示它們均不是過敏原,因此,這些高豐度的點對本實驗并無干擾。本實驗戶塵螨最常見的過敏原Der p1至Der p10,Der p14的等電點、分子量與國際免疫學聯合會(IUIS)過敏原命名分會(www.allergen.org)認定命名公告的結果一致。因此,實驗結果是可信的。另外,從www.allergen.org還可查得相應的氨基酸序列,因此,我們暫未進行質譜檢測。
   
  進一步分析新發現的5個過敏原組分:G點:由3個蛋白點組成,等電點和分子量分別為:6.9~7.3和90~92.6KD,而Der f11等電點和分子量分別為5.2~6.4和90~100KD,Tsai [14]  等則發現Der f11是糖蛋白,N-端糖基化,有4個亞型,而戶塵螨中目前尚無Der p11的報道(查WWW. Allgome)。Thomas等 [15]  認為:Der p11可能存在,因為Tovey [2]  和Obrien [16]  的單向免疫印跡都提示戶塵螨中有95-100KD左右的過敏原組分。但是,目前需要考慮的是95-100KD左右的過敏原組分是否為M-177(即Der p14)降解產生,因為一些免疫印跡未能顯示M-177(即Der p14)的存在。我們的雙向免疫印跡已經顯示Der p14的存在;因此,G點可能為Der p11。H點:2D70,71,72等電點和分子量分別為:7.1~7.5和69.7~70.7KD;根據國際免疫學聯合會(IUIS)過敏原命名分會的最新過敏原認定命名公告Der f18的分子量均為:60KD,與H點分子量在10KD范圍內,因此,我們推測H點可能為Der p18。I點:2D301等電點和分子量分別為:9.0和14.8KD,可能為Der p5的亞型;J點:2D306點等電點為9.0,由于此點在最小分子量標準之下,因此,12.3KD的分子量是不精確的,只能認為它的分子量<14KD,此過敏原可能為大過敏原分子降解后的片段。K點:2D91和96蛋白點,對應的等電點和分子量分別為:6.98~7.38和57.0~56.0KD,根據國際免疫學聯合會(IUIS)過敏原命名分會的最新過敏原認定命名公告Der f16 [17]  的分子量均為:53KD,與K點分子量很接近,因此,K點可能為Der p16。G點、H點、I點和K點的氨基酸序列有待于質譜鑒定。由于戶塵螨和粉塵螨同屬于塵螨屬,因此,本研究有些結果與Le Mao [3]的結果是一致的。例如:本實驗也發現了與c點、d點、e點、f點相似的C點、D點、E點、F點,其相似之處體現在位置相似或等電點和分子量相近。但是,他將Der f3和Der f7位置顛倒了,他的這一結果與現在SWISS-PROT蛋白質網站公布質譜檢測Der f3和Der f7等電點結果正好相反,此處有可能是他的筆誤。
   
  粉塵螨和戶塵螨過敏原組分中,有許多組分 [14,18]  有糖基化位點,另外,由于一些過敏原組分還有氨基酸序列的多態性 [18,19]  ,因此,雙向電泳和免疫印跡中,出現了一些蛋白點成串的現象。這些成串的現象,在Le Mao [3]  和Tsai [14]  采用的粉塵螨樣品中均有許多成串的過敏原組分出現;此外,Kim等采用柑桔全爪螨 [20]  的雙向電泳和免疫印跡也有同樣的現象。對于成串的現象,我們認為原因有4種:(1)蛋白質的糖基化 [14]  ,糖基化的位點和數目不同導致它們分子量相同或非常接近,而等電點不同,從而產生許多亞型(isoˉforms);(2)由于同一組過敏原組分的多態性導致這些同一組過敏原組分內有一個或幾個氨基酸不同,從而產生變體(variants) [14]  ;(3)這些成串的蛋白點還有可能為不同的蛋白點;(4)上述現象同時合并存在,進一步研究有待于質譜和糖基化的檢測。
   
  致謝:衷心感謝新加坡國立大學王德云高級研究員、Dr.Chew FT和Dr.Aaron Chen Angus為本實驗中提供寶貴的意見和幫助!

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  (收稿日期:2001-08-17)

  (編輯雨 涵)

  ˇ 基金項目:科技部創新藥物和中藥現代化基金資助(編號:2003AA2Z3502)
   
  作者單位:100730中國醫學科學院中國協和醫科大學北京協和醫院變態反應科。
   
       100850北京放射醫學研究所  △  通訊作者:張宏譽zhy1941@yahoo.com.cn 

日期:2005年9月22日 - 來自[2004年第2卷第9A期]欄目
共 11 頁,當前第 9 頁 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 :


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