當前位置:首頁 > 合作平臺 > 在線期刊 > 中華醫學研究雜志 > 2004年第4卷第10期 > 論著 > 血液混樣HBV DNA全自動提取方法的應用研究

血液混樣HBV DNA全自動提取方法的應用研究

來源:INTERNET 作者:葉賢林 王良華 尚桂芳等 2005-7-25

摘要: 【摘要】 目的 探討在加樣儀上實現血液樣本匯集,在Roche MPLC上全自動提取樣本HBV DNA,在COBUS AMˉPLICOR上進行擴增和檢測的方法,為血液HBV DNA篩查提供應用依據。方法 在酶聯免疫吸附實驗(ELISA)篩查血液基礎上,應用STAR2000加樣儀自編程序進行全自動血樣匯集(24例份),在MPLC上全自動方法提取樣本核酸,應用P......


    【摘要】 目的 探討在加樣儀上實現血液樣本匯集,在Roche MPLC上全自動提取樣本HBV DNA,在COBUS AMˉPLICOR上進行擴增和檢測的方法,為血液HBV DNA篩查提供應用依據。方法 在酶聯免疫吸附實驗(ELISA)篩查血液基礎上,應用STAR2000加樣儀自編程序進行全自動血樣匯集(24例份),在MPLC上全自動方法提取樣本核酸,應用PCR方法在COBAS AMPLICOR進行擴增和檢測分析結果,從檢出限量及抗干擾能力方面進行考評。結果 用國際標準核酸質控品考評及常規應用,表明全自動匯集,全自動核酸提取及擴增和檢測HBV DNA95%檢出限量為39.6U/ml,20mg/dl膽紅素、1g/dl血紅蛋白及中等程度的脂血對結果無影響。通過對5136例份樣本共214匯集池分析,HBV DNA陽性6例,陽性率為0.12%。結論 本實驗結果認為MPLC全自動核酸提取方法可應用于血液混樣核酸篩查工作。

  關鍵詞 NAT 全自動 核酸提取 HBV DNA

  Application of nucleic acid entirely automated extraction  method on HBV DNA in blood screening  

   Ye Xianlin,Wang Lianghua,Shang Guifang,et al.

   Shenzhen Blood Center,Shenzhen518035.

  【Abstract】 Objective To investigate and study Roche nucleic acid entirely automated extraction method on HBV DNA in blood sample pooled by sampling processor.Methods Individual donor plasma samples serologically negative for HBV were pooled by STAR2000according to the size24,Using entirely automated extraction method to extraction nucleic acid simultaneously,amplified and detected by Roche COBUS AMPLICOR system,evaluating the sensitivity,efficacy and anti-interference.Results The95percent cutoff for HPLC HBV DNA test was39.6IU/ml,20mg/dl bilirubin,1g/dl hemoglobin and medium lipid blood did not interfere with the results.Conclusion Entirely automated extraction method by MPLC can be applied in the blood screening.

  Key words NAT entirely automation nucleic acid extraction HBV DNA  

  核酸擴增技術(NAT)能顯著縮短EIA的“窗口期”和檢出病毒變異株,降低血源性病毒的傳播,是血液篩查病毒的最有效的手段 [1,2]  。由于在大批量進行血液篩查時手工混樣繁瑣、難標識,且核酸手工提取技術要求高、操作繁雜、耗時及結果重現性差,已不適合現代化血液檢測的需要。為探討在國內血液篩查應用全自動核酸提取技術,筆者與德國Roche合作,在國內首次開展全自動樣本匯集及全自動核酸提取技術評價研究并應用于日常工作,現將結果報告如下。

     1 材料和方法

     1.1 材料 瑞士HIMILTON STAR2000加樣儀,德國Roche MagNA Pure LC核酸提取儀,COBAS AMPLICOR核酸擴增檢測儀,COBAS AmpliScreen HBV V1檢測試劑盒,德國Hettich離心機,72管帶蓋留樣板,HIMILTON一次加樣針(1000μl)。美國Acrometric HBV DNA國際標準品。

  1.2 方法

     1.2.1 樣本準備和匯集 將采集的5ml EDTA抗凝全血保存2℃~8℃冰箱里,待血液樣本經相應的7項檢測合格后,800~1600g室溫離心20min后,裝載樣本條架上,應用STAR2000,啟動一級匯集程序,進行24例份樣本匯集和檔案板的留存。將每個匯集池的樣本條碼文件儲存并輸出以備追溯和確認使用。若第一級匯集樣經檢測為陽性,將檔案板取出,啟動二級匯集程序進行第二級每6個樣本的匯集,同時取出留存的樣本條碼進行記錄,以被確認最終陽性標本。由于一級匯集池陽性概率很少,二級匯集亦可手工進行。

     1.2.2 核酸全自動提取 按控制軟件要求將所需要的純化試劑洗滌緩沖液、蛋白裂解液、磁珠及所有耗材等裝載在MagNA Pure LC核酸提取儀工作臺上,匯集池混合樣取1000μl及陰陽對照最后放入。開啟儀器約1h后自動完成核酸提取。

     1.2.3 核酸擴增及檢測結果 在A-Ring上分別加入Mn 2+  溶液及純化的核酸樣液,置入COBAS AMPLICOR核酸擴增檢測儀上,按要求裝載變性液、內標、酶和顯色劑,儀器自動完成擴增和檢測。內標陽性,樣本陽性報陽性結果。

  2 結果

     2.1 方法檢出限量 將已知濃度的HBV DNA和HIV RNA標準品用陰性血漿稀釋成樣本,濃度范圍分別為1~500U/ml,進行MPLC核酸全自動提取,結果見表1。應用PROBIT概率統計(STATA3.0)計算95%檢測限量,HBV DNA MPLC全自動提取法為39.6U/ml。

  表1 MPLC全自動提取HBV DNA檢測結果(略)

     2.2 MPLC全自動核酸提取方法抗干擾實驗結果 對50U/ml HBV DNA質控樣本,分別加入20mg/dl膽紅素,1g/dl的血紅蛋白及中等脂肪血的血漿,均能定性檢出。

     2.3 質量控制 以陰性血清(NHP)稀釋HBV DNA國際標準品,分別制成濃度為50U/ml樣液,隨23管陰性樣本一起用加樣程序分別進行制備匯集池,重復8批次,均能定性檢出陽性。

     2.4 常規應用 共對5136例份樣本計214個匯集池進行擴增檢測,HBV DNA檢測陽性6份,經對獻血員重新采血單份檢測仍為陽性,HBV DNA陽性率為0.12%。該實驗尚在進行中。

     3 討論

  NAT檢測可以大大縮短窗口期及可以檢出病毒變異株,許多國家已常規用于血液篩選 [3,4]  。而核酸提取是NAT檢測過程最重要也是最難控制的部分,常規手工不僅需要專門技術人員,且耗時耗力,不適合大批量血液篩查,盡管日本已有全自動核酸提取系統應用于血液篩查的研究 [5]  ,但其專門設計自動化核酸提取純化設備推廣常規應用尚待時日。本研究在我國已有加樣設備基礎上開發全自動樣本匯集,在MPLC上進行全自動核酸提取,最后在COBAS AMPLICOR上擴增和檢測,實現從樣本準備、核酸提取及擴增和檢測一體化和自動化,符合大批量的NAT血液檢測中心工作流程的需要。是國內首次將NAT全自動系統應用血液篩查的嘗試。

     我國是乙肝的高度流行區,流行病學調查結果顯示人 群中HBsAg的攜帶率已上升至10.12%,而目前血液篩查使用的ELISA方法,由于存在“窗口期”、基因變異及低水平攜帶等原因,使得血液篩查有一定的漏檢。給臨床用血安全帶來極大威脅。本實驗結果顯示,在ELISA檢測合格結果中,HBV DNA陽性率為0.12%,低于國內獻血者的檢出率 [4,6]  。主要由于我中心使用了高靈敏度的乙肝進口試劑以及在采血前對乙肝和ALT進行初篩的原因。

     為防止檢測結果出現假陽性,在檢測液中配有AmˉpErase酶,在PCR實驗開始后50℃保溫5min時該酶被激活,切除核酸鏈中U堿基,將可能存在的前次擴增產物降解,達到消除產物污染產生的假陽性。另外在試劑中采用內質控(IC),含有HBV DNA的與引物結合區域及與獨特探針結合區,能監控樣本裂解、抽提、擴增和檢測整個過程,保障結果的可靠性。

     核酸提取是PCR過程中首要一步,卻是最后一個實現自動化的步驟,MPLC是世界上首批實現全自動核酸提取的成套設備,該系統自動釋放靶物核酸,由特異性寡糖核苷酸探針捕獲靶物,此探針通過生物素-鏈霉親和素結合反應與磁珠附著,核酸就被自動純化和濃縮,從而完成核酸自動化提取。該方法靈敏度高,能在1h內同時完成480例份HCV RNA/HIV-1RNA/HBV DNA全自動核酸的提取,比傳統手工方法提前1.5h,且手工操作時間僅15min左右,大大提高工作效率,具有廣闊的應用前景。

  參考文獻

  1 葉萍.核酸擴增檢測技術預防輸血傳染病的應用現狀及研究進展.國外醫學·輸血及血液學分冊,2003,26(5):399-402.

     2 白堅石.原料血漿混樣HCV/HIV-1核酸檢測的方法學研究.中國輸血雜志,2003,16(3):309-312.

     3 H TM Cui jpers.Validation of NucliSens Extractor in combination with the hepatitis C virus Combas Amplicor2.0assay in four laboratories in the Netherlands Utilizing nucleic acid amplification technology for blood screening.Vox Sanguinis,2001,(81):12-20.

     4 黃呈輝.核酸擴增檢測在血液篩查的初步應用.中華檢驗醫學雜志,2001,24(3):141-143.

     5 Q.Meng.全自動多重檢測試劑同時檢測HBV DNA,HCV RNA和HIV-1RNA。國外醫學·輸血及血液學分冊,2003,26(3):280-282.

     6 胡兆平.熒光定量PCR技術在血液篩查中的應用及可行性分析.臨床輸血與檢驗,2002,4(1):7-9.

  (收稿日期:2004-04-25)

  作者單位:518035廣東深圳深圳血液中心 

  (編輯守 中)



頁:
返回頂部】【打印本文】【放入收藏夾】【收藏到新浪】【發布評論



察看關于《血液混樣HBV DNA全自動提取方法的應用研究》的討論


關閉

網站地圖 | RSS訂閱 | 圖文 | 版權說明 | 友情鏈接
Copyright © 2008 39kf.com All rights reserved. 醫源世界 版權所有 蘇ICP備2023000612號-9 | 增值電信業務經營許可證:蘇B2-20230864
醫源世界所刊載之內容一般僅用于教育目的。您從醫源世界獲取的信息不得直接用于診斷、治療疾病或應對您的健康問題。如果您懷疑自己有健康問題,請直接咨詢您的保健醫生。醫源世界、作者、編輯都將不負任何責任和義務。
本站內容來源于網絡,轉載僅為傳播信息促進醫藥行業發展,如果我們的行為侵犯了您的權益,請及時與我們聯系我們將在收到通知后妥善處理該部分內容
聯系Email:w39kf_admin@163.com