當前位置:首頁 > 合作平臺 > 在線期刊 > 中華醫學研究雜志 > 2004年第4卷第10期 > 論著 > 樹突狀細胞體外對腫瘤浸潤淋巴細胞抗小鼠肝癌活性影響的研究

樹突狀細胞體外對腫瘤浸潤淋巴細胞抗小鼠肝癌活性影響的研究

來源:INTERNET 作者:蔭農 劉劍勇 張志明等 2005-7-25

摘要: 【摘要】 目的 樹突狀細胞(DC)是目前已知的功能最強的抗原提呈細胞(APC),可以向包括腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)在內的T淋巴細胞提呈抗原,并誘發細胞毒T淋巴細胞(CTL)反應。本文旨在探討樹突狀細胞激活的腫瘤浸潤淋巴細胞體外對小鼠H22肝癌細胞的殺傷活性。方法 從小鼠骨髓中獲取DC,應用粒/巨噬細胞集落刺激因子(G......


      【摘要】 目的 樹突狀細胞(DC)是目前已知的功能最強的抗原提呈細胞(APC),可以向包括腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)在內的T淋巴細胞提呈抗原,并誘發細胞毒T淋巴細胞(CTL)反應。本文旨在探討樹突狀細胞激活的腫瘤浸潤淋巴細胞體外對小鼠H22肝癌細胞的殺傷活性。方法 從小鼠骨髓中獲取DC,應用粒/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-4(IL-4)和腫瘤全細胞性抗原致敏DC,然后用DC激活TIL,觀察TIL在體外對H22和Hepal-6細胞的殺傷活性。結果 經H22全細胞性抗原致敏的DC激活的TIL具有很高的對H22細胞殺傷活性,殺傷率為(71.31±3.11)%,明顯高于未經DC激活的TIL、DC激活的脾淋巴細胞和未經DC激活的脾淋巴細胞對H22細胞殺傷活性[殺傷率分別為(49.80±3.21)%,(48.76±3.6)%和(19.23±2.71)%]。而它們對Hepal-6細胞的殺傷活性則相對較低。結論 DC能誘導TIL產生高效而特異的體外抗小鼠肝癌活性。

     關鍵詞 樹突狀細胞 腫瘤浸潤淋巴細胞 小鼠肝癌細胞 殺傷活性

  Study of anti-mouse hepatocellular carcinoma activities of TIL  affected by DC in vitro

   Zhao Yinnong,Liu Jianyong,Zhang Zhiming,et al.

    Surgery Department,Affiliated Cancer Hospital of Guangxi Medical University,Nanning530021.

  【Abstract】 Objective To investigate the killing activity of tumor infiltrating lymphocytes(TIL)stimulated by dendritic cells(DC)on carcinoma cells in vitro.Since DC is the strongest antigen presenting cell(APC)which has been known,it can present antigens to T lymphocytes,including TIL,and can induce cytotoxic T lymphocyte(CTL)reˉsponded in vivo and vitro.Methods DC were isolated from mouse bone marrow and stimulated by granulocyte/macrophage colony stimulating factor(GM-CSF),interleukin-4(IL-4)and tumor antigen.Then TILwere stimulatˉed by DC and their killing activity on H22cells and Hepal-6cells in vitro were observed.Results TIL stimulated by DC had very high killing activity on H22cells and the killing rate was(71.31±3.11)%,which was much higher than those of TIL not stimulated by DC and splenocytes lymphocytes stimulated by DC as well as splenocytes lymphoˉcytes not stimulated by DC.The killing rates of the last three ones were(49.80±3.21)%,(48.76±3.6)%and(19.23±2.71)%respectively.However,their killing activity on Hepal-6cells was lower.Conclusion The results indicate that DC can induce more efficient and specific anti-mouse hepatocellular carcinoma killing activity in vitro.

  Key words dendritic cell tumor-infiltrating lymphocyte mouse hepatocellular carcinoma cell killing acˉtivity

  樹突狀細胞(Dendritic cells,DC)是目前已知的機體內功能最強的專職抗原提呈細胞(Antigen-presenting cell,APC),也是唯一能激活初始型T細胞的APC,處于免疫反應的中心地位 [1,2]  。DC有攝取抗原的能力,并高表達MHCⅠ、Ⅱ類分子和其他共刺激分子。DC可在體內外向包括腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor-infiltrating lymphocytes,TIL)在內的T淋巴細胞提呈抗原,并誘發細胞毒T淋巴細胞(CTL)反應 [3,4]  。DC在體內含量極少,但在1992年Inaba建立了從小鼠骨髓誘導擴增大量DC的方法后,DC的研究日漸深入,人們已經開始將其應用于惡性腫瘤的免疫治療 [5]  。TIL具有較強的特異性殺傷腫瘤細胞的作用,TIL在體外加入白細胞介素-2(IL-2)進行培養擴增后,其抗腫瘤作用比  LAK細胞高50~100倍 [6,7]  。本實驗用來源于H22細胞的全細胞性抗原致敏DC,進一步激活從H22瘤體中分離出的TIL,觀察TIL在體外對小鼠H22肝癌細胞(H22細胞)和小鼠Hepal-6肝癌細胞(Hepal-6)細胞的殺傷作用。

  1 材料與方法

     1.1 主要試劑及細胞株 RPMI1640培養基干粉購自GIBˉCO公司;重組人IL-2(rhIL-2)為北京德路生公司產品;小鼠淋巴細胞分離液為天津TBD公司產品;乳酸脫氫酶(LDH)4h釋放法殺傷活性測定試劑盒購自Promega公司;大鼠抗小鼠CD4、CD8a和CD45R單抗購自PharMingen公司;大鼠抗小鼠CD205單抗、大鼠抗小鼠樹突狀細胞單抗購自Serotec公司;FITC標記羊抗大鼠IgG購自PharMingen公司;鼠源GM-CSF、IL-4購自Sigma公司;小鼠H22肝癌細胞株購自中科院上海藥物研究所,小鼠Hepal-6肝癌細胞株由第一軍醫大學提供;BALB/C小鼠,4~6周,(18±2)g,雌性,由廣西醫科大學實驗動物中心提供。

  1.2 荷瘤BALB/C小鼠建立 于BALB/C小鼠右股部皮下接種H22細胞0.1ml(含量約5×10 5 H22細胞)。1~2周后腫瘤平均直徑長到0.5~0.6mm大小時即成荷瘤小鼠。

     1.3 TIL及H22細胞分離培養擴增 從荷瘤小鼠中取出瘤體,用小鼠淋巴細胞分離液,不連續密度梯度分離法分離出TIL及H22細胞。TIL體外加入rhIL-2進行體外培養擴增;H22細胞分成兩部分,一部分用于H22細胞全細胞性抗原的制備,一部分凍存用于細胞殺傷活性檢測備用。

     1.4 H22細胞全細胞性抗原的制備 用RPMI1640培養液稀釋從荷瘤小鼠瘤體中分離出的H22細胞,調細胞密度為1×10 6 /ml,分裝于凍存管中,置液氮中快速冷凍,室溫慢融,經過3個凍融周期。

     1.5 小鼠骨髓DC的體外培養、致敏及鑒定 制備小鼠四肢長骨骨髓細胞懸液,用大鼠抗小鼠CD4、CD8a、CD45R單抗及新鮮兔血清去除CD4 + 、CD8 + T淋巴細胞、B淋巴細胞、粒細胞、血小板后,將收集的細胞放入含100U/ml GM-CSF、100U/ml IL-4的完全培養基的培養瓶中,37℃5%CO 2 培養箱中培養4h后除去懸浮細胞,在貼壁的單核細胞中,加入含100U/ml GM-CSF、100U/ml IL-4和H22全細胞性抗原(源于4×10 4 H22細胞)以致敏DC,繼續培養16~20h后,收集懸浮細胞轉入另一培養瓶中繼續培養。DC的鑒定用大鼠抗小鼠CD205單抗及大鼠抗小鼠DC單抗來特異性顯示。從每只小鼠四肢長骨骨髓細胞培養5~7天后可獲得成熟DC約(2~3)×10 6 。

     1.6 小鼠脾淋巴細胞的制備 無菌取出BALB/C小鼠脾臟,體外制成脾淋巴細胞懸液,培養液中加入50U/ml rhIL-2進行培養。

     1.7 致敏DC激活TIL 在TIL培養增殖的第9天加入致敏的DC(TIL:DC=50:1),共培養48h以激活TIL。

     1.8 致敏DC激活小鼠脾淋巴細胞 在小鼠脾淋巴細胞培養增殖的第9天加入致敏DC(小鼠脾淋巴細胞:DC=50:1),共培養48h以激活小鼠脾淋巴細胞分化為CTL。

     1.9 細胞殺傷活性實驗 以荷瘤小鼠瘤體中分離獲得的H22細胞和Hepal-6細胞株為靶細胞,分別以DC激活的TIL、小鼠脾淋巴細胞,未經DC激活的TIL、小鼠脾淋巴細胞作為效應細胞,應用乳酸脫氫酶(LDH)4h釋放法進行殺傷活性的測定。

     1.10 統計學方法 所有變量均以ˉx±s表示,以SPSS10.0多個樣本均數兩兩比較。

     2 結果

  未經DC激活的小鼠脾淋巴細胞表現出很弱的體外殺傷H22細胞的作用,殺傷率為(19.23±2.71)%;DC激活的小鼠脾淋巴細胞和未經激活的TIL均表現出較強的體外殺傷H22細胞的作用,殺傷率分別為(48.76±3.6)%和(49.80±3.21)%,兩者比較差異無顯著性(P>0.05),但它們分別與未經DC激活的小鼠脾淋巴細胞組相比較,差異有顯著性(P<0.01);DC激活的TIL表現出很強的體外殺傷H22細胞的作用,殺傷率為(71.31±3.11)%,與其他各組分別比較,差異均有顯著性(P<0.01)。

     未經DC激活的小鼠脾淋巴細胞表現出很弱的體外殺傷Hepal-6細胞的作用,殺傷率為(18.73±2.4)%;經DC激活的小鼠脾淋巴細胞和未經激活的TIL均表現出一定的體外殺傷Hepal-6細胞的作用,殺傷率分別為(38.62± 2.8)%和(39.4±3.21)%,兩者比較差異無顯著性(P>0.05),但它們分別與未經DC激活的小鼠脾淋巴細胞組相比較,差異均有顯著性(P<0.01);DC激活的TIL表現出相對較強的體外殺傷Hepal-6細胞的作用,殺傷率為(50.11±3.03)%,與其他各組分別比較,差異均有顯著性(P<0.01)。在效應細胞相同的情況下,均表現為對H22細胞的殺傷率高于對Hepal-6細胞的殺傷率。本實驗的所有結果見表1。  表1 經或未經DC激活的TIL或小鼠脾淋巴細胞對H22 細胞和Hepal-6細胞的殺傷活性 (略)注: ˇ 與其他各組分別比較P<0.01

     3 討論

  宿主體內免疫反應的產生,首先由APC捕獲抗原,經其加工處理后將抗原信息提呈給T、B淋巴細胞,從而激發一系列的特異性細胞和體液免疫反應。因此,APC是其中的關鍵環節,能否有效的提呈抗原直接關系到免疫激活或免疫耐受的誘導 [8]  。目前已知DC是抗原加工與提呈功能最強的APC,而且與其他APC不同的是,DC能顯著刺激初始型T細胞增殖,而巨噬細胞和B細胞僅能刺激已活化的或記憶T細胞,因此DC是體內免疫應答的始動者,對其誘導則具有獨特地位 [9]  。我們在本實驗中運用腫瘤細胞全細胞性抗原致敏DC,原因是對于腫瘤特異性抗原(TSA)和腫瘤相關抗原(TAA)來說,目前尚未能全面明確鑒定和獲取,因此為了全面利用所有的TSA和TAA,用腫瘤細胞全細胞性抗原致敏DC,由DC去攝取、識別抗原并遞呈給機體免疫系統仍是一較方便可行的途徑。有文章指出用完整的腫瘤全細胞性抗原致敏DC較用其他來源的腫瘤抗原更能產生腫瘤抗原特異性免疫反應,原因可能與凍融全細胞性抗原包含有更全面的不同抗原遞呈有關 [10]  。本實驗通過對H22細胞應用反復凍融法獲得H22細胞裂解產物作為H22細胞全細胞性抗原,而抗原的攝取、加工和提呈由DC來完成。目前的研究表明,在不同培養條件下,培養細胞的表型和功能有差異,以在GM-CSF+IL-4條件下培養的DC具有最強的APC功能。所以本實驗應用GM-CSF、IL-4和小鼠H22肝癌全細胞性抗原來激活DC。而TIL是主要存在于腫瘤間質的T細胞為主的一個異質性淋巴細胞群體,其本身具有較強的體內外特異性殺傷腫瘤細胞的作用,它經DC激活后有可能產生更強的特異性殺傷腫瘤細胞的作用。本實驗結果表明,未經DC激活的小鼠脾淋巴細胞具有很弱的體外殺傷H22細胞的作用,考慮可能主要是它的非特異性細胞毒作用所致。DC激活的脾淋巴細胞和未經DC激活的TIL均具有較強的體外殺傷H22細胞作用,原因可能是脾淋巴細胞被致敏的DC激活后,表現出較強的針對H22細胞的特異性細胞毒作用,而TIL則是本身具有較強的針對小鼠H22肝癌細胞的特異性細胞毒作用。在本實驗中,DC激活的TIL表現出很強的體外殺傷小鼠H22肝癌細胞的作用,其原因可能是TIL本身已具有較強的針對小鼠H22肝癌細胞的特異性細胞毒作用,而TIL被聯合應用GM-CSF、IL-4和來源于小鼠H22肝癌細胞全細胞性抗原致敏的DC所激活,其針對小鼠H22肝癌細胞的特異性細胞毒作用得到了進一步的增強。在本實驗中,靶細胞為Hepal-6細胞時亦表現出類似的結果。但在效應細胞相同的情況下,相對于靶細胞為Hepal-6細胞來說,靶細胞為小鼠H22肝癌細胞時,則有更高的殺傷率。原因可能是全細胞性抗原來自小鼠H22肝癌細胞,而由此所誘導產生的抗小鼠肝癌活性對小鼠H22肝癌細胞會具有更高的特異性。本實驗結果提示,DC在體外能誘導TIL產生高效而特異的抗小鼠肝癌活性。

  參考文獻

  1 Novak N,Siepmann K,Zierhut M,et al.The good,the bad and the ugly-APCs fo the eye.Trends Immunol,2003,24(11):570.

     2 Chain BM.Current issues in antigen presentation-focus on the dendritˉic cell.Immunol Lett,2003,89(2-3):237.

     3 Stift A,Friedl P,Dubsky T,et al.Dendritic cell-based vaccination in solid cancer.J Clin Oncol,2003,21(1):135.

     4 Conrad C,Nestle FO.Dendritic cell-based cancer therapy.Curr Opin Mol Ther,2003,5(4):405.

     5 Inaba K,Inaba M,romani N,et al.Generation of large numbers of denˉdritic cells frommouse bone marrow cultures supplemented with granuloˉcyte/macrophage colony-stimulating factor.J Exp Med,1992,176(6):1693.

     6 Rosenberg SA,Spiess P,Lafreniere R.ANew aproach to theadoptive imˉmunotherapy of caner with tumor-infiltrating lymphocytes.Science,1986,233:1318.

     7 BoonT,Van der Bruggen P.Human tumor antigens recognized byT lymˉphocytes.J Exp Med,1996,183:725.

     8 Steinman RM,Hawiger D,Liu K,et al.Dendritic cell function in vivo during the steady state:A role in peripheral tolerance.Ann N Y Acad Sci,2003,987:15.

     9 Banchereau J,Paczesny S,Blanco P,et al.dendritic Cells:Controllers of the Immune Systen and a New Promise for Immunotherapy.Ann N Y Aˉcad Sci,2003,987:180.

     10 Nestle FO,Alijagic S,Gilliet M,et al.Vaccination of melanoma paˉtients with peptide or tumor lysate-pulsed dendritic cells.Nat Med,1998,4(3):328.

  (收稿日期:2004-07-27)

  基金項目:本課題受廣西科學研究與技術開發計劃攻關項目(桂科攻0143052)基金資助

    作者單位:530021廣西醫科大學附屬腫瘤醫院肝膽外科

  (編輯秋 實)



頁:
返回頂部】【打印本文】【放入收藏夾】【收藏到新浪】【發布評論



察看關于《樹突狀細胞體外對腫瘤浸潤淋巴細胞抗小鼠肝癌活性影響的研究》的討論


關閉

網站地圖 | RSS訂閱 | 圖文 | 版權說明 | 友情鏈接
Copyright © 2008 39kf.com All rights reserved. 醫源世界 版權所有 蘇ICP備2023000612號-9 | 增值電信業務經營許可證:蘇B2-20230864
醫源世界所刊載之內容一般僅用于教育目的。您從醫源世界獲取的信息不得直接用于診斷、治療疾病或應對您的健康問題。如果您懷疑自己有健康問題,請直接咨詢您的保健醫生。醫源世界、作者、編輯都將不負任何責任和義務。
本站內容來源于網絡,轉載僅為傳播信息促進醫藥行業發展,如果我們的行為侵犯了您的權益,請及時與我們聯系我們將在收到通知后妥善處理該部分內容
聯系Email:w39kf_admin@163.com